ゼブラフィッシュオプティクスカップ形態形成の4次元イメージング

ゼブラフィッシュを用いた全ての方法は、クリステン・クワン博士の動物プロトコル「ゼブラフィッシュにおける視覚システム開発の細胞・分子メカニズム」のもとでカバーされ、ユタ大学の施設動物のケアと使用委員会(IACUC)によって承認されています。 1. キャップRNA合成 インビトロ転写用のDNAテンプレートを生成します。 反応混合物の100 μL体積で10μgのDNAを消化してDNAテンプレートをリニアライズします。典型的な反応は、酵素3 μLと10μLのバッファーを用いて10μgのDNAを消化し、水で100μLに反応量を持たします。注: ダイジェストの典型的なテンプレートは、pCS2 ベクター、たとえば、pCS2-EGFP-CAAX または pCS2FA H2A.F/Z-mCherry 膜およびクロマチン標識に関して、ここで説明します。この場合、プラスミドDNAは、それぞれ、酵素NotIを使用して消化される。ユーザーはスターの活動に注意する必要があります。この場合、高忠実度の酵素が推奨され、市販されている。 反応を一晩37°Cでインキュベートし、DNAが消化されて完了するようにします。 メーカーのプロトコルに従って PCR 精製キットを使用して制限ダイジェストをクリーンアップします。30 μL ddH2O. で DNA を溶出し、線形化された DNA を -20 °C に保存し、必要に応じて使用します。注:DNAの消化量と溶出量は約0.3 μg/μLです。これは、dnaの〜2 μgをテンプレートとして使用して、体外転写の〜5ラウンドで十分です。 インビトロ転写キットを使用して、インビトロでキャップされたRNAを転写します。pCS2 テンプレート (ここで説明する方法) については、SP6 キットを使用します。 インビトロ転写反応を組み立てる:10x反応バッファーの2 μL、2xリボヌクレオチドミックスの10 μL、10x酵素ミックスの2 μLを用いて、DNAテンプレートの2μgまたは最大6 μLを消化します。 37°Cで2〜4時間以上インキュベートします(より長い時間は、より大きな収率につながります)。必要に応じて、酵素ミックスの1 μLは、インキュベーション期間の途中で補うことができます。 1 μLのRNaseフリーDNaseを加え、37°Cで15分間インキュベートして、DNAテンプレートを消化します。 メーカーのプロトコルに従ってRNA精製キットを使用して、キャップされたRNAを精製します( 材料表を参照)。RNaseフリーH2Oの100 μLを持つエルテ。注:このアプリケーションにはβメルカプトエタノールの添加は必要ありません。このプロトコルに記載されている方法は簡単ですが、代替試薬を使用してRNAを精製することもできます。 RNAを沈殿します。 溶出したRNAに3 M RNaseフリーNaOAcの10 μLと2.5ボリューム(約275 μL)の氷冷RNaseフリー100%EtOHを加えます。 -20°Cで15〜30分間インキュベートします。4°Cで高速で15分間スピンし、RNAをペレットします。注:ペレットはチューブの壁に対して見える必要があります。このステップでチューブが遠心分離機でどのように整列されているかに注意して、ペレットがスピンの終わりにある場所を予測するのに役立ちます。 EtOHを注射器で慎重に取り出し、加熱、過剰乾燥、またはペレットの除去を避けるように注意してください。ペレットをRNaseフリーH2Oの20 μLで再懸濁します。 RNA をチェックして、合成が成功していることを確認します。1 μLを使用して分光光度計の濃度をアッセイし、1%アガロースゲルで0.5 μLを実行して、低分子量スメアではなく1つまたは2つの離散バンドをチェックします。インビトロ転写反応の収率は〜1 μg/μLである必要があります。 アリコートでRNAを-20°Cまたは-80°Cで保存します。 RNAは、注射の直前まで希釈されません。 2. 1細胞ゼブラフィッシュ胚のマイクロインジェクション 注:RNAあたり200〜300 pgを注入して、光学カップ形態形成全体にわたってクロマチンと細胞膜のユビキタス発現を得る。5~10 μLのRNA希釈液を調製し、2.5~5 μL/針をロードします。針が壊れた場合に余分な計画を立てる。 注射のための事前準備. マイクロインジェクション用の1細胞胚の配向と向きを容易にする射出型皿を準備する。E3(標準的な胚培地)で2%アガロースを溶かし、ペトリ皿に注ぎます。熱いアガロースの上に射出型( 材料表を参照)を慎重に浮かべ、凝固するにつれてアガロースのトラフの刻印を生成します。アガロースが固まったら、射出成形を取り除く。注:射出型の皿は数ヶ月間使用することができる。E3でカバーし、使用しない場合は4°Cで保存してください。 マイクロインジェクション針を引っ張ります。ガラスの毛細血管を長いテーパーに引き上げ、針の引き手を使用してマイクロインジェクション針を作ります。使用する毛細血管の種類に固有の機械をプログラムします。1.0 x 0.78 mm のホウケイ酸毛細管では、熱 = 546 °C、プル = 130、速度 = 70、時間 = 90 (図 2F) を使用します。ペトリ皿に針を保管し、モデリング粘土でそれを確保します。注:引っ張るレシピは、機械とフィラメントによって異なり、新しいフィラメントは常に較正する必要があります。引っ張りの各ラウンドは2本の針を作り出す(図2G);偶発的な休憩や将来の実験の場合に十分な針を生成するためにこれを数回行います. キャップされたRNAを希釈して注射します。EGFP-CAAXおよびH2A-mCherry RNAAsの両方を、RNaseフリーH2Oと1μLのフェノールレッドを全容量5μL(フェノールレッドの最終濃度は0.1%)で200-300 ng/μL濃度に希釈します。混合物をフリックし、総体積を収集するために簡単にスピンダウン。希釈したRNAを注入する前に氷の上に保管してください。 1細胞胚の注入 魚が繁殖し始めたら、卵が受精することを確実にするために〜15〜20分を許可します。この間、P10およびP10マイクロローダの先端を使用して、RNA希釈液の2.5〜5 μLで針をバックロードします。 ピコインジェクターを使用して、眼球レチクル(マイクロメートルキャリブレーションスライドも十分)を使用して針を較正し、液滴の体積(球の体積=(4/3)*π*半径^3)を測定します。射出量が1nLになるように射出時間と圧力を調整する(図2I)。 ローラー/転写ピペットを使用して、注入金型に卵を慎重にロードします(図2J)。有用であれば、鉗子を使用して、単一の細胞が注射の前または間に見えるように胚を転がす。マイクロマニピュレータを使用するのがユーザーの好みです。 卵黄ではなく細胞を標的とする1細胞段階で胚を注入する(図2M)。これは、発達中の胚の均一な標識を保証します。 胚を所望の段階まで上げる(標準のステージング34に従って12 hpfより前)。注入された胚は発達が遅れるので、わずかに高い温度(29.0-29.5°C)で上げて時間を補います。午後の間に、胚をチェックし、クラッチの健康を維持するために死んでいるものを取り除きます。 3. タイムラプスイメージング用の視小胞ステージゼブラフィッシュ胚の取り付け 取り付ける前に、E3で1.6%低溶融アガロースを調製してください。複数のイメージング実験を計画する場合は、低融解アガロースの約20mLを調製し、室温で保存します。胚取り付けの日に、これを溶かして、取り付ける前に42°Cの熱ブロックに入れることができるチューブに新鮮なアリコート(1〜5mL)を生成します。 実装前に蛍光顕微鏡を用いた蛍光の注入および全体的な明るさを得るためのスクリーニング胚。理想的なサンプルは、強力なEGFPとmCherry蛍光を有し、正しい発達段階にあるでしょう(図3B – B’)。 蛍光顕微鏡を用いた胚のスクリーニング。EGFPとmCherry両方の蛍光を強く発現する胚を選んで実装します。 11 hpf である胚を選択します。胚34を適切にステージングするためにスマイトを数える。11 hpfでは3つのスマイトがあり、12 hpfによって6つのスマイトがあるはずです。注:12 hpf(11 hpf)より前の胚を取り付けることによって、サンプルはタイムラプスが始まるときに12 hpfで適切にステージングされます。 取り付け前のデコリオネート胚。これを手動で細かい鉗子で行うか、プロナーゼ(2 mg/mL)を使用して化学的に行ってください。この若い胚では、寒天コーティングされた皿の中でデコールリオネーションが行われ、胚が空気水界面に接触しないことが不可欠である。 ガラスローラーピペットを使用して、胚を吸い上げ、胚がガラスパスツールピペットの先端に座るようにできるだけ多くのE3を排出します。 胚を熱ブロックからアガロースのチューブに落とします。数秒間アガロースに沈ませ、次にアガロースを最初に吸い上げ、次に胚を吸い上げ、胚がピペットの先端に残っていることを確認します(図3C – C’)。 解剖スコープの下でイメージング用のガラス底皿を置きます。胚とアガロースをガラス底皿のアガロース液滴に排出する。鉗子を使用して、胚が底面下(ガラス底の頭の上)になるように、非常に迅速に配向します。アガロース液滴を硬化させます(図3D – D’)。この段階の胚は壊れやすいので、このステップは迅速かつ慎重に行う必要があります。損傷した胚は、タイムラプスイメージングプロセスを生き残るものではありません。注:この実験では、すべての胚の向きを一貫して行うことが重要です。タイムラプスを行う場合、胚は、光学小胞が成長するための追加のスペースを維持しながら、割り当てられた視野内に収まる必要があります。最適な方位は、すべての胚の前部後方軸を「垂直」に、または時計面の12時と6時に沿って整列させることです(図3G)。 10~12個の胚の間にマウントし、これは画像化される2倍以上であり、共焦点で評価されると最良のサンプルを選択することができます(図3E – E’)。サンプルは、年齢、蛍光標識の均一性、および取り付け方向の精度について評価されます。 胚を取り付けた後、ピペットよりアガロースが皿の底を完全に覆い、それによって単一の大きなアガロースディスクに分離したアガロース液滴のすべてを包み込む(図3F – F’)。十分な量のアガロースは、個々の胚液滴またはディスク全体が皿の底から持ち上がり、視界から浮かび上がらないようにします。 硬化したら、E3でアガロースを重ね、タイムラプスイメージング実験の期間中、サンプルを水分補給します(建物の湿度や環境に依存する懸念)。注:トリケーヌは、これらの胚が十分に若いので、これらの特定のタイムラプスイメージング実験には必要ありません。しかし、必要に応じて、そして胚の古い段階で作業する場合、トリケーヌはアガロース自体に添加され、メディアに重ねることができます。 紙の上に、タイムラプスの設定中に簡単に参照するための胚の地図を描きます。これは、後で各サンプルの遺伝子型と位置を関連付けるために重要です。 4. レーザー走査共焦点顕微鏡による多重位置共焦点タイムラプス 注:このタイムラプスイメージングプロトコルは、メーカーのソフトウェアを搭載したレーザー走査型共焦点顕微鏡で使用するように設計されました( 材料表を参照)。このシステムはZスタックの急速な獲得を可能にするピエゾZ段階装置が装備されている。このプロトコルで使用されるレーザーラインは、488 nmアルゴンイオンレーザーとDPSS 561 nmレーザーです。561 nmレーザーは、mCherry蛍光色素を撮像するのに適しています:それはmCherry励起(587 nm)のピークに十分近く、十分に動力を与えられています。 共焦点を設定します。 コンフォーカルの電源を入れ、デスクトップコンピュータにログインします。 piezo Z ステージインサート (図 4B)を取り付け、取得ソフトウェアを起動します。 取得モード内のソフトウェアで、ドロップダウンメニューを使用して488および561レーザーをオンにします(図4F)。レーザーはウォームアップに数分かかるので、このステップは時間を節約するために早めに行われます。注: 取得パラメータは次のとおりです: Zスタック、時系列、および位置ボックスをチェックします。フレームサイズを512(X)×384(Y)、スキャン速度を9に、スキャンモードを双方向に、ズームを0.7に、ピンホールを60.2(1.63エアリーユニット〜=1.6 μmセクション)に設定し、Z間隔を2.1 μmに設定します。これにより、303.6 μm x 227.7 μm の画像サイズと、0.59 μm のピクセルサイズが得られます。488 および 561 レーザーは、チェックされ、同じトラックに割り当てられる必要があります。EGFP検出範囲は494-545 nmで、mCherry検出範囲は598-679である(図4F)。 ガラス皿の底部を水の屈折率に合致する浸漬媒体で自由にコーティングし、気泡を避けるように注意する(図4C)。40x水の目的を選択し、目的に浸漬媒体の小さな滴を適用します(図4D)。ステージインサートでガラス底の皿を固定し、E3を適用して胚を一晩湿らせておき、モデリングクレイを使用してプラスチック製の蓋を皿の上に密封します(図4E)。料理と接触する目的を上げます。 サンプルをスクリーニングし、タイムラプスの準備をします。 [取得]タブから[場所]タブに切り替え、電球記号をクリックして、透過光をオンにします。透過光で、ジョイスティックで最初のサンプルを見つける:目で、まずサンプルを光のビームに移動し、次に接眼レンズを中心に使用して、光学小胞に焦点を当てます。 [取得] タブに戻ります。Z-stack、時系列、および位置の各ボックスがオンになっていることを確認し、レーザーが使用できるようにウォームアップされていることを確認します。 [フレーム サイズ]を 512 (X) x 384 (Y) に設定し、[スキャン速度] を9 に、[スキャン モード] を [双方向] に設定し、[ズーム]を 0.7 に設定します。 チャネルの見出しの下で、488および 561 レーザーを Power 2.0 およびGain 550 に割り当てることから始めます(これは後で調整できます)。ピンホールを60.2(1.63エアリーユニット~=1.6μmセクション)に設定します。 [連続]ボタンを使用してスキャンを開始します。細かいフォーカスノブを使用して、サンプルをZ軸に配置し、フレーム内のX-Y軸を配置します。スキャンを停止します。 [ 位置 ] 見出しの下にある [追加 ] をクリックして、最初のサンプルに対する XYZ 情報を保存します (図 4F)。これは、サンプルがタイムラプスされる場合にのみ行います。強力な蛍光と最適な取り付けのためのサンプルを選択してください。 [場所検索] タブに切り替え、次のサンプルに移動し、サンプルの選択について選択的に手順 4.2.5 ~ 4.2.6 を繰り返します。 サンプル位置を確定し、z 範囲を割り当て、次に開始タイムラプスを割り当てます。すべてのサンプルを選択し(2.5分の合計時間間隔内で4-5サンプルを画像化することが可能)、位置を保存したら、各サンプルを通過し、表示フレーム内のXYZ位置を調整します。 最初の位置をハイライト表示し、[ 移動先] をクリックします。連続的にスキャンしながら、フレーム内の視小胞を並べています。眼小胞と脳に対して相対的な前および遠位領域に十分なスペースを残します。 次に、細かいフォーカスノブでZ方向を移動しながら 「最初に設定 」と「 最後に設定 」を選択して、最初と最後のZスライスを割り当てます。これは、光学カップの成長に対応するので、〜63の総スライス数を維持します。成長のための部屋を可能にするために、視小胞の腹側に余分な部屋を提供します。 最初と最後の Z スライスを設定したら 、C ボタンをクリックして Z スタックの中央に移動します。両方のレーザーのレーザーパワーとゲインを調整します。可能であれば、レーザーパワーを5以下に保ち、必要に応じてより高いゲインを使用します。スキャンを停止します。[更新] をクリックして、位置情報を 更新します。 [位置 2]をクリックして次の位置に移動します。割り当てられた各ポジションについて、ステップ 4.3.1 から 4.3.3 を繰り返します。レーザーパワーとゲインは、すべてのサンプルが十分に照らされるように設定する必要があります。 位置情報とレーザー設定の両方が確定したら、時系列設定を割り当てます。[ 時系列 ] の見出しの下で、[ 時間間隔 ] を 2.5 分に、 サイクル を 300 に割り当てます (図 4F)。サイクル数は、光学カップの開発が完了したときにタイムラプスが24 hpf段階を超えて進むような計算されます。 タイムラプスを開始するには、[ 開始] をクリックします。最初の完全なサイクルを監視する:タイマーを使用して、1つの完全なサイクル(すべての位置のイメージング)が2.5分未満であることを確認し、各位置が正しく見えることを確認します。顕微鏡は一晩独立して動作し、監視する必要はありません。注意:コンフォーカルルームは温度制御されていますが、室温は20〜25°Cです。 機器の走行とレーザースキャンにより、ステージ上の温度は、形態学的ランドマークで視覚的にアッセイされるように、この予想速度で胚の発達が進むので、28.5°Cに近いように見えます。 これらの設定では、タイムラプスは12.5時間続きます。タイムラプスが完了したら、ファイルを保存します。これは、大きい(〜40 GB)になり、取得ソフトウェアを使用して保存した後、個々の位置に分離することができます。