아이소피크닉 밀도 구배 정제에 의한 U937 세포의 세포 분획
Summary
이 분획 프로토콜을 통해 연구자들은 포유류 세포에서 세포질, 핵, 미토콘드리아 및 막 단백질을 분리 할 수 있습니다. 후자의 2 개의 세포 내 분획은 isopycnic 밀도 구배를 통해 추가로 정제됩니다.
Abstract
이 프로토콜은 세제, 기계적 용해 및 등핵 밀도 구배 원심분리의 조합을 사용하여 포유동물 세포로부터 세포내 단백질 분획을 얻는 방법을 설명합니다. 이 절차의 가장 큰 장점은 세포 내 분획을 얻기 위해 가용화 세제의 단독 사용에 의존하지 않는다는 것입니다. 이것은 원형질막을 세포의 다른 막 결합 세포 기관으로부터 분리하는 것을 가능하게한다. 이 절차는 재현 가능하고 확장 가능하며 선택적인 방법으로 세포에서 단백질 국소화의 결정을 용이하게 할 것입니다. 이 방법은 인간 단핵구 세포주 U937에서 세포질, 핵, 미토콘드리아 및 원형질막 단백질을 분리하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 이 세포주에 최적화되어 있지만, 이 절차는 다른 세포주의 세포하 분획을 위한 적합한 시작점으로서 작용할 수 있다. 절차의 잠재적 함정과 이를 피하는 방법은 다른 세포주에 대해 고려해야 할 수 있는 변경 사항과 마찬가지로 논의됩니다.
Introduction
세포 내 분획은 세포를 용해시키고 여러 가지 방법을 통해 구성 성분으로 분리하는 절차입니다. 이 기술은 연구원들이 포유류 세포에서 단백질 국소화를 결정하거나 다른 방법으로는 검출할 수 없는 저농도 단백질의 농축에 사용할 수 있습니다. 세포 내 분획 방법이 현재 존재하지만 구입할 수있는 상업용 키트와 마찬가지로이 절차가 극복하려고 시도하는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 대부분의 세포 분획 방법은 독점적으로 세제 기반1,2이며, 다양한 세포 구성 요소를 가용화하기 위해 증가하는 양의 세제를 포함하는 완충액을 사용합니다. 이 방법은 빠르고 편리하지만 불순한 분획을 초래합니다. 이들은 연구자들이 세포의 하나 또는 두 개의 구성 요소를 쉽게 분리 할 수 있도록 설계되었지만 동시에 샘플에서 여러 세포 내 분획을 분리 할만큼 복잡하지는 않습니다. 세제에만 의존하면 일반적으로 막으로 둘러싸인 세포 기관과 원형질막이 무차별적으로 가용화되어 이러한 구성 요소의 분리가 어려워집니다. 이러한 키트의 사용으로 인한 추가적인 복잡성은 대부분의 구성 요소가 독점 제형이기 때문에 연구자가 특정 응용 분야에 맞게 키트를 변경/최적화할 수 없다는 것입니다. 마지막으로, 이러한 키트는 엄청나게 비쌀 수 있으며 사용 횟수에 제한이 있어 더 큰 샘플에 적합하지 않습니다.
세제에 의존하지 않는 미토콘드리아 분리용 키트를 사용할 수 있음에도 불구하고 원형질막을 분리하고 표준 분리 프로토콜 3,4보다 훨씬 적은 양의 샘플을 생성하도록 설계되지 않았습니다. 차등 원심분리 방법은 시간이 더 많이 걸리지만 세제 기반 키트1만으로는 얻을 수 없는 뚜렷한 분획을 생성하는 경우가 많습니다. 가용화 세제만 사용하지 않고 분리하면 초원심분리 및 등압 밀도 구배를 사용하여 추가 정제가 가능하여 교차 오염이 줄어듭니다. 이 분획 프로토콜은 세제 및 고속 원심분리 기반 접근법의 조합을 사용하여 U937 단핵구에서 세포 내 분획을 분리하는 것을 보여줍니다. 이 방법은 포유류 세포의 핵, 세포질, 미토콘드리아 및 원형질막 성분의 분리를 용이하게 할 것이며 분획들 사이의 오염을 최소화 할 것이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 방법은 고속 원심분리(11)를 사용하지 않고 세포내 분획화에 대한 이전에 공개된 접근법의 수정된 버전이다. 이 수정된 방법은 최상의 결과를 얻기 위해 보다 전문화된 장비가 필요하지만 더 포괄적이고 일관되게 재현할 수 있습니다.
초기 프로토콜의 개발은 괴사12 동안 단백질 국소화 분석을 위해 미토콘드리아 및 막 샘플을 분리 할 수…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 NIH R15-HL135675-01 및 NIH 2 R15-HL135675-02에서 TJL로 지원되었습니다.
Materials
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advance | 61-BB50-DX | |
| digitonin | Sigma | D141 | |
| end-over-end rotator | ThermoFisher | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E9884 | |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E3889 | |
| GAPDH (14C10) | Cell Signalling Technologies | 2118 | |
| HEPES | VWR | 97064-360 | |
| Hexylene glycol | Sigma | 68340 | |
| Igepal | Sigma | I7771 | Non-ionic, non-denaturing detergent |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| Mannitol | Sigma | M9647 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) | Cell Signalling Technologies | 23565 | |
| Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm | Seton Scientific | 7048 | |
| OptiPrep (Iodixanol) Density Gradient Medium | Sigma | D1556-250ML | |
| phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Protease Inhibitor Cocktail, General Use | VWR | M221-1ML | |
| refrigerated centrifuge | ThermoFisher | ||
| S50-ST Swinging Bucket Rotor | Eppendorf | ||
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma | 436143 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| sodium orthovanadate (SOV) | Sigma | 567540 | |
| sonicator | ThermoFisher | ||
| Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge | ThermoFisher | ||
| Stainless Steel Beads 3.2 mm | Next Advance | SSB32 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Tris-buffered Saline (TBS) | VWR | 97062-370 | |
| Tween 20 | non-ionic detergent in western blotting buffers | ||
| VDAC (D73D12) | Cell Signalling Technologies | 4661 |
References
- Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, 440-445 (2015).
- Il Hwang, S., Han, D. K. Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility. Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).
- Clayton, D. A., Shadel, G. S. Isolation of mitochondria from cells and tissues. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 1040-1041 (2014).
- Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses. Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).
- Sundström, C., Nilsson, K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).
- Hodge, T., Colombini, M. Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels. Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).
- Therien, A. G., Blostein, R. Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology. Cell physiology. 279 (3), 541-566 (2000).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues. Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).
- Bradbury, E. M., Cary, P. D., Crane-Robinson, C., Rattle, H. W. E. Conformations and interactions of histones and their role in chromosome structure. Annals of the New York Academy of Sciences. 222, 266-289 (1973).
- McCaig, W. D., Deragon, M. A., Haluska, R. J., Hodges, A. L., Patel, P. S., LaRocca, T. J. Cell fractionation of U937 cells in the absence of high-speed centrifugation. Journal of Visualized Experiments. (143), e59022 (2019).
- McCaig, W. D., et al. Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis. Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).
