פיצול תאים של תאי U937 על ידי טיהור הדרגתי בצפיפות איזופיקנית
Summary
פרוטוקול פיצול זה יאפשר לחוקרים לבודד חלבונים ציטופלסמיים, גרעיניים, מיטוכונדריאליים וממברנות מתאי יונקים. שני השברים התת-תאיים האחרונים מטוהרים עוד יותר באמצעות שיפוע צפיפות איזופיקני.
Abstract
פרוטוקול זה מתאר שיטה להשגת שברי חלבון תת-תאיים מתאי יונקים באמצעות שילוב של דטרגנטים, תזה מכנית וצנטריפוגה הדרגתית בצפיפות איזופיקנית. היתרון העיקרי של הליך זה הוא שהוא אינו מסתמך על השימוש הבלעדי בדטרגנטים מפריכים כדי להשיג שברים תת-תאיים. זה מאפשר להפריד את קרום הפלזמה מאברונים אחרים הקשורים לממברנה של התא. הליך זה יקל על קביעת לוקליזציה של חלבונים בתאים בשיטה ניתנת לשחזור, מדרגית וסלקטיבית. שיטה זו שימשה בהצלחה לבידוד חלבונים ציטוזוליים, גרעיניים, מיטוכונדריאליים וממברנות פלזמה מקו תאי המונוציטים האנושיים, U937. למרות שהוא ממוטב עבור קו תאים זה, הליך זה עשוי לשמש כנקודת התחלה מתאימה לפיצול תת-תאי של קווי תאים אחרים. מכשולים פוטנציאליים של ההליך וכיצד להימנע מהם נדונים כמו גם שינויים שאולי צריך לקחת בחשבון עבור קווי תאים אחרים.
Introduction
פיצול תת-תאי הוא הליך שבו תאים שוכבים ומופרדים למרכיביהם המרכיבים אותם באמצעות מספר שיטות. טכניקה זו יכולה לשמש חוקרים כדי לקבוע לוקליזציה של חלבונים בתאי יונקים או להעשרה של חלבונים בעלי שפע נמוך שאחרת לא היו ניתנים לגילוי. אמנם קיימות כיום שיטות לפיצול תת-תאי, וכך גם ערכות מסחריות שניתן לרכוש, אך הן סובלות מכמה מגבלות שהליך זה מנסה להתגבר עליהן. רוב שיטות חלוקת התאים מבוססות אך ורק על 1,2 על דטרגנטים, תוך הסתמכותעל שימוש במאגרים המכילים כמויות הולכות וגדלות של חומרי ניקוי כדי לבודד רכיבים תאיים שונים. בעוד ששיטה זו מהירה ונוחה, היא גורמת לשברים לא טהורים. אלה נועדו לאפשר לחוקרים לבודד בקלות מרכיב אחד או שניים של התא, אך אינם מורכבים מספיק כדי לבודד שברים תת-תאיים מרובים מדגימה בו זמנית. הסתמכות על דטרגנטים בלבד גורמת בדרך כלל לכך שאברונים סגורים בממברנה וממברנת הפלזמה מסולפת ללא הבחנה, מה שמקשה על הפרדת רכיבים אלה. סיבוך נוסף מהשימוש בערכות אלה הוא חוסר היכולת של החוקרים לשנות/לייעל אותן עבור יישומים ספציפיים, שכן רוב הרכיבים הם פורמולציות קנייניות. לבסוף, ערכות אלה יכולות להיות יקרות להחריד, עם מגבלות במספר השימושים שהופכות אותן לפחות אידיאליות עבור דגימות גדולות יותר.
למרות הזמינות של ערכות לבידוד מיטוכונדריה שאינן מסתמכות על חומרי ניקוי, הן אינן מיועדות לבודד את קרום הפלזמה ולהניב כמויות דגימה נמוכות משמעותית מפרוטוקולי בידודסטנדרטיים 3,4. בעוד ששיטות צנטריפוגה דיפרנציאליות גוזלות זמן רב יותר, לעתים קרובות הן יוצרות שברים נפרדים שלא ניתן להשיג באמצעות ערכות מבוססות דטרגנטיםבלבד 1. הפרדה ללא שימוש בלעדי בדטרגנטים מסיסים מאפשרת גם טיהור נוסף באמצעות שיפועים אולטרה-צנטריפוגציה וצפיפות איזופיקנית, וכתוצאה מכך פחות זיהום צולב. פרוטוקול פיצול זה מדגים את הבידוד של שברים תת-תאיים ממונוציטים U937 באמצעות שילוב של גישות מבוססות דטרגנטים וצנטריפוגות במהירות גבוהה. שיטה זו תאפשר בידוד של מרכיבי הממברנה הגרעינית, הציטופלסמית, המיטוכונדרית והפלזמה של תא יונק עם זיהום מינימלי בין השברים.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטה זו היא גרסה שונה של גישה שפורסמה בעבר לפיצול תת-תאי ללא שימוש בצנטריפוגהבמהירות גבוהה 11. שיטה שונה זו דורשת ציוד מיוחד יותר כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר, אך היא מקיפה יותר וניתנת לשחזור באופן עקבי.
פיתוח הפרוטוקול הראשוני היה הכרחי בשל חוסר יכולת להפר?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NIH R15-HL135675-01 ו- NIH 2 R15-HL135675-02 ל- T.J.L.
Materials
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advance | 61-BB50-DX | |
| digitonin | Sigma | D141 | |
| end-over-end rotator | ThermoFisher | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E9884 | |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E3889 | |
| GAPDH (14C10) | Cell Signalling Technologies | 2118 | |
| HEPES | VWR | 97064-360 | |
| Hexylene glycol | Sigma | 68340 | |
| Igepal | Sigma | I7771 | Non-ionic, non-denaturing detergent |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| Mannitol | Sigma | M9647 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) | Cell Signalling Technologies | 23565 | |
| Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm | Seton Scientific | 7048 | |
| OptiPrep (Iodixanol) Density Gradient Medium | Sigma | D1556-250ML | |
| phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Protease Inhibitor Cocktail, General Use | VWR | M221-1ML | |
| refrigerated centrifuge | ThermoFisher | ||
| S50-ST Swinging Bucket Rotor | Eppendorf | ||
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma | 436143 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| sodium orthovanadate (SOV) | Sigma | 567540 | |
| sonicator | ThermoFisher | ||
| Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge | ThermoFisher | ||
| Stainless Steel Beads 3.2 mm | Next Advance | SSB32 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Tris-buffered Saline (TBS) | VWR | 97062-370 | |
| Tween 20 | non-ionic detergent in western blotting buffers | ||
| VDAC (D73D12) | Cell Signalling Technologies | 4661 |
References
- Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, 440-445 (2015).
- Il Hwang, S., Han, D. K. Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility. Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).
- Clayton, D. A., Shadel, G. S. Isolation of mitochondria from cells and tissues. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 1040-1041 (2014).
- Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses. Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).
- Sundström, C., Nilsson, K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).
- Hodge, T., Colombini, M. Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels. Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).
- Therien, A. G., Blostein, R. Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology. Cell physiology. 279 (3), 541-566 (2000).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues. Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).
- Bradbury, E. M., Cary, P. D., Crane-Robinson, C., Rattle, H. W. E. Conformations and interactions of histones and their role in chromosome structure. Annals of the New York Academy of Sciences. 222, 266-289 (1973).
- McCaig, W. D., Deragon, M. A., Haluska, R. J., Hodges, A. L., Patel, P. S., LaRocca, T. J. Cell fractionation of U937 cells in the absence of high-speed centrifugation. Journal of Visualized Experiments. (143), e59022 (2019).
- McCaig, W. D., et al. Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis. Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).
