Transplantation de macrophages cardiaques néonatals de souris chez des souris adultes

Toutes les expériences ont été menées conformément au Guide d’utilisation et de soins des animaux de laboratoire. Tous les protocoles animaliers ont été approuvés par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), Fuwai Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences. Une technique aseptique est nécessaire tout au long de la procédure pour prévenir la contamination du site chirurgical. 1. Opération de résection apicale chez une souris néonatale Cx3cr1 GFP/+ de 1 jour (arrière-planC57BL/6) Anesthésie Sortez tous les chiots de souris des cages et mettez-les dans une boîte propre et sèche. Intégrez chaque souris dans la glace pendant environ 2-3 minutes. Assurez-vous qu’il y a une fine barrière comme du latex ou de la gaze entre la glace et le chiot de la souris pour prévenir les engelures. Identifiez une anesthésie suffisante en observant les signes suivants: peau pâle, manque de mouvement des membres et manque de réflexe de pédale. Thoracotomie Prérefroidir la plate-forme de fonctionnement en bronze pendant la nuit à -20 ° C pour aider à maintenir l’anesthésie. Sortez la souris anesthésiée de la glacière et placez-la sur une plate-forme d’exploitation en bronze. Ancrez la souris sur la plate-forme d’exploitation en position couchée à l’aide de ruban adhésif médical. Placez la plate-forme d’exploitation avec la souris dessus sous un stéréoscope. Désinfectez la poitrine de la souris à l’aide d’un tampon de préparation imbibé de bétadine et d’alcool à 70% ou conformément à la politique institutionnelle. Inciser la peau avec une coupe de 1 cm à la quatrième zone intercostale de la cavité thoracique, puis séparer les muscles intercostaux à l’aide de ciseaux microchirurgicaux jusqu’à ce que le cœur soit accessible. Appuyez alternativement sur la poitrine et l’abdomen à l’aide de deux pinces jusqu’à ce que le cœur soit extériorisé hors de la poitrine sans aucun dommage mécanique. Placez les côtes en dessous et au-dessus de la petite incision comme une fixation naturelle pour immobiliser le cœur. Résection ventriculaire de l’apex Localisez l’apex du ventricule gauche. Couper un tissu ventriculaire de l’apex de 1 mm de diamètre à l’aide de ciseaux d’iridectomye sous un stéréoscope. Confirmez que la chambre ventriculaire gauche est exposée et commencez à suinter. Appuyez doucement le cœur vers la cavité thoracique à l’aide d’un coton-tige. Suturez les muscles, les côtes et la peau en utilisant 8-0 Sutures de prolène. Nettoyez soigneusement la souris après l’opération. Soins post-opération Transférez la souris de la plate-forme d’exploitation à une couverture chauffante à 37 °C pour réchauffer le corps immédiatement après l’opération. Confirmez l’anabiose de la souris en observant les signes suivants: restauration spontanée de la respiration, changement de couleur de la peau de pâle à rose et mouvement des membres. Ramenez la souris opérée à sa mère une fois qu’elle a récupéré. Mélangez la souris opérée avec le matériel de nidification de sa mère si nécessaire.REMARQUE: Il est important de retirer tous les chiots de 1 jour de la mère à la fois, puis de les retourner tous en même temps après que tous les chiots sont récupérés. 2. Préparation de la suspension de macrophages cardiaques néonatals REMARQUE: Toutes ces procédures expérimentales doivent être effectuées dans un endroit sombre et dans des conditions stériles. Récoltez le cœur d’une souris néonatale Cx3cr1GFP/+ 1 jour après la résection apicale Euthanasier la souris Cx3cr1GFP/+ un jour après la résection apicale. Utilisez un excès de dioxyde de carbone et décapitez la souris séquentiellement pour appliquer l’euthanasie. Sortez le cœur de la poitrine et plongez-le dans un plat de 10 cm avec du PBS. Coupez les vaisseaux et le tissu conjonctif restant loin des ventricules. Coupez l’appendice auriculaire et le tractus d’écoulement loin du cœur. Une fois que le cœur cesse de battre, coupez le cœur en 1-2 mm3 morceaux dans un tampon PBS à l’aide de ciseaux microchirurgicaux (Figure 2A). Dissociation néonatale du cœur de souris Transférer le tissu cardiaque récolté dans un tube contenant 2,5 mL de mélange d’enzymes préchauffé(Table des matériaux)et fermer hermétiquement le tube. Inversez le tube et placez-le avec le capuchon vers le bas (Figure 2B). Exécutez le programme de dissociation cardiaque néonatale (Table des matériaux). Détachez le tube du dissociateur une fois le programme terminé. Ajouter 7,5 mL de 1x DMEM avec 10% fbS au tube. Filtrer et transférer la suspension dans un tube de centrifugeuse de 15 mL(Figure 2C). Centrifuger la suspension de la cellule à 300 x g pendant 5 minutes. Resuspendez la pastille cellulaire dans 1 mL de solution de lyse des cellules sanguines et incubez pendant 2 minutes à température ambiante. Ajouter 5 à 10 mL de tampon PBS à la suspension et centrifuger à 300 x g pendant 5 minutes. Resuspendez la pastille de cellule dans 1 mL de DMEM avec 10% de FBS. Isolement des macrophages cardiaques néonatals Trier GFP+ macrophages cardiaques néonatals par FACS. Recevez les macrophages triés dans un tube stérile contenant 500 μL de DMEM avec 10% de FBS. Comptez les macrophages GFP+ (Figure 2D). Resuspendez le macrophage dans le DMEM avec 10% de FBS à la concentration de 1 x 106 macrophages pour 200 μL de DMEM pour une injection ultérieure.REMARQUE: Le nombre de macrophages GFP+ est faible chez un nouveau-né (environ 1 x 105); par conséquent, au moins 10 nouveau-nés doivent être utilisés pour obtenir suffisamment de macrophages pour chaque injection de souris adulte. 3. Transplantation néonatale de macrophages cardiaques Effectuer une opération d’infarctus du myocarde sur une souris C57BL/6 mâle adulte (6-8 semaines) par ligature de l’artère coronaire antérieure gauche8. Placez la souris opérée sur une couverture chauffante à 37 °C jusqu’à ce qu’elle se rétablisse. Injecter par voie intraveineuse 200 μL de DMEM avec 1 x 106 GFP+ macrophages cardiaques néonatals à la souris adulte infarctus après l’opération (environ 6 heures plus tard) via la veine caudale. Renvoyez la souris dans une cage propre. 4. Évaluation des résultats Validation de l’efficacité d’injection Anesthésier la souris opérée et prélever le cœur 7 jours après l’opération d’infarctus du myocarde. Plongez le cœur dans le tampon PBS pré-refroidi. Fixez le tissu cardiaque avec 4% de polyformaldéhyde pendant 72 heures à température ambiante en secouant. Déshydrater le tissu cardiaque en diméthylbenzène et en éthanol. Incorporer le tissu cardiaque dans de la paraffine et le découper en sections d’une épaisseur de 5 μm. Effectuer le protocole standard de coloration par immunofluorescence1. Utilisez α-actinine pour marquer les cardiomyocytes. Détecter les macrophages GFP+ dans le cœur recevant la transplantation. Effectuer le protocole standard de coloration par immunofluorescence1. Utiliser α-actinine et pH3 pour marquer respectivement les cardiomyocytes et la prolifération cellulaire(Figure 3A). Évaluation de la réparation cardiaque après la transplantation Utilisez l’échocardiographie sur la souris opérée un mois après l’opération1. Analyser la fonction cardiaque en comparant la fraction d’éjection ventriculaire gauche et le raccourcissement fractionnaire dans différents groupes (Figure 3B). Anesthésiez la souris opérée et récoltez le cœur. Répétez les étapes 4.1.2 à 4.1.5. Effectuez un protocole de coloration de Masson. Analyser la zone infarctus après injection de macrophages (Figure 3C).