تطبيق نظام RatWalker لتحليل المشي في نموذج الفئران الجيني لمرض باركنسون

يحدث PD ، وهو اضطراب الحركة التنكسية العصبية الأكثر شيوعا المرتبط بالعمر ، بسبب فقدان الخلايا العصبية DA في المادة السوداء pars compacta. يؤدي هذا الفقدان للخلايا العصبية DA nigral ومدخلات DA في المخطط إلى ضعف الوظيفة الحركية الملحوظ الذي شوهد في المرضى الذين يعانون من PD ^1,2. تشمل الخصائص الحركية المحددة للمرضى الذين يعانون من مرض باركنسون ، والمعروفة مجتمعة باسم باركنسون ، الصلابة ، ورعاش الراحة ، وبطء الحركة ، وعدم الاستقرار الوضعي ، والتصوير المجهري³. علاوة على ذلك ، تظهر اضطرابات المشي ، الشائعة في مرضى PD ، في وقت مبكر من مسار المرض¹،^4،5. في حين يقترح بعض أنماط الحياة للمساعدة في إبطاء تقدم مرض باركنسون ، مثل الأكل الصحي وممارسة التمارين الرياضية بانتظام ، لا يوجد حاليا علاج لمرض باركنسون ، فقط الأدوية لإدارة الأعراض. وهذا يترك مجالا للحاجة إلى مزيد من التحقيق على أمل تحسين العلاجات. وبالتالي ، فإن توصيف نمط المشي في نماذج الحيوانات PD هو أداة حاسمة لتوصيف أهمية النموذج وكذلك كيف أن العلاجات العلاجية التي تهدف إلى السيطرة على PD تمنع أو تحسن الإعاقات الحركية.

هناك العديد من النماذج الحيوانية PD التي تم استخدامها لاختبار العلاجات العلاجية ، ولكن لكل منها حدودها. على سبيل المثال ، أسفرت النماذج الحيوانية المعالجة بالسم العصبي 1-ميثيل-4-فينيل-1،2،3،6-تتراهيدروبيريدين (MPTP) عن ثروة كبيرة من المعلومات حول العمليات المهمة لفقدان الخلايا العصبية nigral DA والتكيفات المخططة اللاحقة ، وأشارت إلى دور الميتوكوندريا في التسبب في مرض باركنسون. ومع ذلك ، فإن الخلفية المسببة للأمراض لنموذج MPTP ذات طبيعة سامة وليست عملية تنكسية عصبية كما هو الحال في PD⁶ البشري. تشمل النماذج الإضافية القابلة للتحريض كيميائيا 6-هيدروكسي دوبامين (6-OHDA) والروتينون. كان 6-OHDA أول عامل يستخدم للحث على PD عن طريق التراكم الانتقائي للدواء في الخلايا العصبية DA ، والذي يقتل الخلايا العصبية في النهاية ويؤدي إلى أعراض تشبه PD. تم استخدام هذا النموذج لأول مرة لتتبع استنفاد DA من خلال فحص السلوك استجابة للأمفيتامين والآبومورفين⁷. أثبتت طريقة تحريض PD هذه أنها مفيدة لفحص العوامل الدوائية التي تؤثر على DA ومستقبلاته⁸. في حين أن نموذج 6-OHDA هو نموذج رائع لتتبع العجز الحركي القابل للقياس الكمي ، فإن هذا النموذج لا يوضح كيف يؤثر الفقدان التدريجي للخلايا العصبية وتكوين أجسام ليوي على الحيوان. الطريقة الأخرى للتحريض ، الروتينون ، ثبت أن لديها تنكسا تدريجيا للخلايا العصبية السوداء مع فقدان هيدروكسيلاز التيروزين وناقل DA ، مما يسمح بنموذج أفضل لتتبع فقدان الخلايا العصبية بمرور الوقت⁹. أظهرت الفئران المعالجة بالروتينون بطء الحركة ، وعدم الاستقرار الوضعي ، والمشية غير المستقرة¹⁰. ومع ذلك ، فقد وجد أن هذه الطريقة متغيرة على نطاق واسع بين سلالات مختلفة من الفئران ، مما أثار التساؤل عما إذا كان الروتينون نموذجا موثوقا به ل PD¹¹،^12،13 أم لا. في حين ثبت أن تحليل المشي يتأثر بتحريض PD في الفئران ، حتى الآن ، لم يتم استخدام نماذج الفئران PD المستحثة وراثيا بسهولة لتحليل المشي عن طريق المشي بحرية على المدرج.

تتمثل إحدى طرق تحليل الضعف الحركي في القوارض التي تمشي بحرية في تحليل المشي الحركي ، والذي يمكن إجراؤه باستخدام تصوير FTIR. تستخدم هذه الطريقة الراسخة مستشعر بصري يعمل باللمس يعتمد على FTIR ، والذي يسجل ويتتبع آثار أقدام القوارض أثناء تحركها على المدرج¹⁴،^15،16. بالمقارنة مع الطرق الأخرى ، لا يعتمد FTIR على أي علامات على جسم الحيوان يمكن أن تتداخل مع مطبوعات المخلب. ينتج عن إنشاء بيانات الفيديو مطبوعات مخالب رقمية لجميع الأطراف الأربعة التي يمكن دمجها لإنشاء نمط مشي ديناميكي وقابل للتكرار لنماذج القوارض المختلفة. مبدأ تحليل المشي القائم على التصوير هو أخذ كل مخلب فردي وقياس منطقة التلامس بمرور الوقت أثناء سير القوارض على المدرج. يتم تمثيل كل موقف بزيادة في مساحة المخلب (في مرحلة الكبح) وانخفاض في منطقة المخلب (في مرحلة الدفع). يتم ذلك من خلال مرحلة التأرجح ، وهي عندما لا يتم اكتشاف إشارة مخلب. بعد تقييم الفيديو ، يتم إنشاء العديد من المعلمات التي يمكن استخدامها لمقارنة نموذج النوع البري (WT) مقابل نموذج PD. بعض الأمثلة على المعلمات هي طول الخطوة (المسافة التي يغطيها المخلب في خطوة واحدة) ، ومدة التأرجح (المدة الزمنية التي لا يكون فيها المخلب على اتصال بالمدرج) ، وسرعة التأرجح (طول الخطوة كدالة لمدة التأرجح) ، ونمط الخطوة (خطوات قطرية ، خطوات جانبية ، أو خطوات حزام).

لإثبات فائدة FTIR للكشف عن التغيرات المبكرة في نمط المشي في الفئران ، استخدمنا نموذجا وراثيا للفئران من PD. في حين أن معظم حالات مرض باركنسون مجهولة السبب. كشف تحديد الأشكال الوراثية لمرض باركنسون عن طفرات ومتغيرات جينية ، مثل طفرات فقدان الوظيفة في Pink1 و Parkin ، وهما بروتينان مشاركان في مراقبة جودة الميتوكوندريا¹⁷ ، يمكن تسخيرهما لإنشاء نماذج حيوانية¹⁸. لسوء الحظ ، تقاوم الفئران التنكس العصبي عند فقدان هذه البروتينات (مفردة ومجتمعة)¹⁹،^20،21. في الفئران ، يؤدي نقص Pink1 ولكن ليس باركين إلى فقدان الخلايا العصبية nigral DA وضعف الحركة²² ، ولكن دون اختراق كامل. لذلك ، أنشأنا نموذجا مشتركا لفأر Pink1 / Parkin Double Knockout (DKO) ، والذي يعرض النمط الظاهري الظاهر للأطراف الخلفية الواضحة بصريا والذي تم الإبلاغ عنه في ذكور فئران Pink1 KO²² ولكن الآن بمعدل أعلى: 100٪ مقابل 30-50٪ من الذكور بين 4-6 أشهر.

في حين أن هذه الطريقة تعمل بشكل جيد لتحليل العجز الحركي في الفئران¹⁴ ، فإن مواصفات نظام المشي التصويري FTIR لاستيعاب حجم ووزن الفئران لم تكن متوفرة في السابق بشكل غير تجاري. نوضح هنا كيفية بناء RatWalker ، وهو نظام معدل لتصوير المشي FTIR على غرار MouseWalker¹⁴ ، باستثناء تكييفه مع حجم ووزن الفئران. يستخدم هذا النظام تأثيرا بصريا ، FTIR ، لتوفير طريقة لتصور آثار أقدام الحيوانات وتسجيلها لاحقا لتحليلها. يؤدي ملامسة قدم الحيوان مع الدليل الموجي البصري (المنصة) إلى اضطراب في مسار الضوء مما يؤدي إلى تأثير تشتت مرئي ، يتم التقاطه باستخدام تصوير فيديو عالي السرعة من الدرجة المحلية والمعالجة باستخدام برنامج مفتوح المصدر. توضح هذه الدراسة قوة تصوير FTIR في دراسة تغيرات المشي في نماذج الفئران الجينية لمرض باركنسون. على سبيل المثال ، في حين لوحظت تغييرات حركية واضحة بصريا (أي سحب الأطراف الخلفية) في ذكور فئران DKO في 4 أشهر على أقرب تقدير ، باستخدام FTIR ، يمكننا الكشف عن تشوهات البوابة في ذكور فئران DKO في عمر 2 أشهر.