Применение мыши Партеногенетические гаплоидные эмбриональные стволовые клетки в качестве замены спермы

Все эксперименты на животных проводились по лицензии No152/17 в соответствии со стандартами и правилами Кантональной комиссии по этике Цюриха и животноводческого комплекса EPIC в Институте молекулярных медицинских наук, ETH Цюрих. ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол начинается с удаления H19- и IG-DMRsв phaESCs. Для получения подробной информации о том, как установить линии phaESC, пожалуйста, обратитесь к опубликованнымотчетам 10,13. Обзор и временные рамки этого протокола (шаги 1–14) представлены на рисунке 1A; мультимедиа, решения и буферы перечислены в таблице 1. Процедура создания линий DKO-phaESC (шаги 1-6) показана на рисунке 1B,а стратегия построения полу клонированных эмбрионов (шаги 7–14) изображена на рисунке 1C. 1. Трансфекция плазмидов для удаления H19-DMR и IG-DMR в phaESCs Подготовь плазмиды CRISPR/Cas9 для совместного выражения нуклеаз Cas9 и наведи РНК для целевых удалений H19-DMR и IG-DMR. Ligate четыре пары направляющий РНК-олиго (H19-DMR-gRNA1-F, R; H19-DMR-gRNA2-F, R; IG-DMR-gRNA1-F, R; IG-DMR-gRNA2-F, R, перечисленные в таблице 2) в плазмиды pX330.ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к опубликованному протоколу о подробной процедуре подготовки этих 4 плазмидов CRISPR/Cas914. Кроме того, плазмиды, доступные для общих штаммов мыши, также доступны через репозиторий(Таблица материалов). Покрыть поверхность одной колодец 6-хорошо пластины с 1 мл 0,2% желатина раствора инкубации при 37 градусов по Цельсию в течение 10 мин. Плита 2 × 105 фалесков дикого типа на желатиновом покрытом хорошо в среде haESC без антибиотиков, и инкубировать пластину при 37 градусов по Цельсию в атмосфере 5% CO2 в течение 1 дня.ПРИМЕЧАНИЕ: Антибиотики опущены из среды для повышения эффективности последующей липофеции. Мы использовали фаЭКС дикого типа при прохождении 10. Мы рекомендуем использовать ранние фазы прохода, но различные номера прохода были успешно использованы8. Корреляция между числом проходов и эффективностью получения полу клонированных эмбрионов и мышей в настоящее время неизвестна. Трансфект phaESCs в колодец 6-хорошо пластины (от шага 1,3) с 6 плазмидов одновременно с использованием реагента липофеции: 50 нг piggyBac плазмид проведения CAG-EGFP трансгена, 50 ng piggyBac транспозазы плазмид, и 600 нг каждого из 4 CRISPR/Cas9 плазмидов (от шага 1.1). Обратитесь к протоколу производителя о детальной процедуре трансфекции.ПРИМЕЧАНИЕ: Два piggyBac плазмиды используются для интеграции транспосона для повсеместного выражения расширенного зеленого флуоресцентного белка (EGFP) в геном фазек. Если маркировка клеток GFP не требуется, эти две плазмиды могут быть заменены плазмидой CRISPR/Cas9 для преходящей экспрессии белков флуоресценции (например, плазмиды pX458) вместо одной из плазмидов pX330. Переходное выражение EGFP может быть использовано для сортировки трансфицированных клеток. Через два дня после трансфекции, аспирировать среды, и добавить 800 йл трипсина. Инкубировать пластину при 37 градусов по Цельсию в атмосфере 5% CO2 в течение 5 минут. Затем добавьте 2 мл буфера для мытья, чтобы утолить трипсин, и пипетку несколько раз, чтобы получить одну подвеску ячейки. Перенесите подвеску клетки в трубку 15 мл. Центрифуга трубки на 160 х г в течение 5 мин, и удалить супернатант. Переусердуйте клеточные гранулы в 400 МКЛ буфера обслуживания haESC, дополненного 15 мкг/мл Hoechst 33342.ПРИМЕЧАНИЕ: Для уменьшения потенциальной токсичности Hoechst 33342, 1 мкг/мл Hoechst 33342 и 50 МК Верапамил были использованы вместо 15 мкг / мл Hoechst 3334215. Инкубировать подвеску клетки при 37 градусов по Цельсию в атмосфере 5% CO2 в течение 15 минут. После инкубации перенесите подвеску клетки в трубку 5 мл через крышку клеточного ситечко и держите трубку на уровне 4 градусов по Цельсию до готовности к использованию на следующем этапе (раздел 2). 2. Одноклеточное покрытие трансфицированных фазек с использованием цитометра потока За день до сортировки трансфицированных фаЭСК, пластины облученных мышью эмбриональных фибробластов (MEFs) на желатин покрытием 96-хорошо пластин при плотности 4 × 104 клеток /см 2 в среде MEF. Как правило, 6 пластин готовы установить линию phaESC с целевыми удалениями. Инкубировать пластины при 37 градусов по Цельсию в атмосфере 5% CO2.ПРИМЕЧАНИЕ: Облученые МЕФ являются коммерчески доступными. Мы используем МЕФ, полученные из эмбрионов E12.5 мышей DR4. Несмотря на то, что гЕУ могут расти на пластинах с желатиновым покрытием без МЕФ, мы рекомендуем МЕФ для повышения жизнеспособности отсортированных одиночных гЕУ. В день сортировки, аспирировать MEF среды из 96-хорошо пластин, и добавить 120 йл свежей среды haESC на колодец. Держите пластины на уровне 37 градусов по Цельсию в атмосфере 5% CO2. Настройка сортера ячеев с соплом на 100 мкм в соответствии с инструкциями производителя. 355 нм УФ-лазер и 488 нм синий лазер используются для возбуждения Hoechst 33342 и EGFP флуоресценции, соответственно.ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, Hoechst 33342 может быть обнаружен путем возбуждения с 405 нм. Сортировать трансфицированных фазек в 5 мл трубки (от шага 1.10) с помощью ворот для сбора гаплоидных клеток в фазе G1/S, которые показывают выражение EGFP. Депозит одной ячейки в каждый колодец из 96-хорошо пластин из шага 2.2.ПРИМЕЧАНИЕ: Обнаружение Hoechst 33342 окрашивания обычно отличает 3 пики клеток с 1n, 2n, и 4n содержание ДНК, которые соответствуют гаплоидных клеток в фазе G1, смесь гаплоидных клеток в фазе G2/M и диплоидных клеток в фазе G1, и диплоидных клеток в фазе G2/M, соответственно. Гаплоидные клетки на фазе G1/S определены как пик с более низкой интенсивностью флуоресценции Hoechst 33342. Репрезентативный результат и ворота сортировки показаны на рисунке 2A. После покрытия инкубировать 96-хорошо пластин при 37 градусов по Цельсию в атмосфере 5% CO2. 3. Суб клонирование трансфицированных фазК Через три дня после одноклеточного покрытия колонии можно наблюдать в нескольких колодцах 96-х пластин под микроскопом. Отметь колодцы, в которых растут только одиночные колонии.ПРИМЕЧАНИЕ: По нашему опыту, одиночные колонии наблюдались в 20%-40% скважин 96-колодцев. На 4-й день после одноклеточного покрытия замените половину среды новой средой haESC в скважинах на одиночные колонии. За день до прохода (на 4-й или 5-й день после одноклеточного покрытия) пластины облучали МЭФ на пластинах с желатиновым покрытием 96-колодец при плотности 4 × 104 клетки/см2 в среде МЭФ. Держите пластины на уровне 37 градусов по Цельсию в атмосфере 5% CO2. После 5 или 6 дней одноклеточного покрытия, выберите колодцы из 96-колодцев, содержащих одиночные колонии диаметром более 150 мкм.ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительно выбрать около 100 скважин для создания линии phaESC с целевыми удалениями DMR. Аспирировать среду в выбранных скважинах и добавить 30 йл трипсина. Инкубировать 96-хорошо пластин при 37 градусов по Цельсию в 5% CO2 атмосферу в течение 5 мин. Затем добавьте 30 йл буфера для мытья к каждому хорошо, чтобы утолить трипсин. Добавьте 140 МКЛ среды haESC в каждую колодец, и пипетку несколько раз, чтобы получить одиночные клетки. Аспирировать носитель MEF из скважин 96-колодцев, подготовленных в шаге 3.3. Перенесите фазы из каждой системы из шага 3.6 в свежую колодец новой пластины из 96-х из шага 3.7. Инкубировать 96-хорошо пластин, содержащих подклионы фазк при 37 градусов по Цельсию в атмосфере 5% CO2. На следующий день, аспирировать все среды из каждой хорошо, и добавить 120 йл новой среды haESC. Инкубировать пластины при 37 градусов по Цельсию в атмосфере 5% CO2. За день до того, как клетки станут стеченными для прохода, пластина облученных МЭФ на желатин покрытием 24-хорошо пластин при плотности 4 × 104 клеток /см 2 в среде MEF. Держите пластины на уровне 37 градусов по Цельсию в атмосфере 5% CO2. Когда фазы стали сотки для прохода, аспирировать среды и добавить 30 йл трипсина. Инкубировать 96-хорошо пластин при 37 градусов по Цельсию в течение 5 мин. Добавьте 90 мкл буфера мытья в каждый колодец, чтобы утолить трипсин. Pipette несколько раз, чтобы получить одиночные клетки. Аспирировать среду MEF из скважин 24-колодцев из шага 3.11 и добавить 600 МКЛ свежей среды haESC. Передача 60 МКЛ суспензии подклалонов phaESC из каждой хорошо в шаге 3.13 в новую колодец 24-хорошо пластин из шага 3.14. Держите оставшуюся суспензию каждого подклана фазеса для извлечения ДНК и генотипирования в шаге 4. Инкубировать 24-хорошо пластин с подклалонами phaESC при 37 градусов по Цельсию в атмосфере 5% CO2. За день до того, как клеточные культуры достигнут плотности для прохожего, пластины облученных MEFs на желатин покрытием 6-хорошо пластин при плотности 4 × 104 клеток /см 2 в среде MEF. Держите пластины на уровне 37 градусов по Цельсию в атмосфере 5% CO2. Когда фазы становятся достаточно стеченными для прохода, аспирировать среды и добавить 250 йл трипсина. Инкубировать 24-хорошо пластин при 37 градусов по Цельсию в течение 5 минут.ПРИМЕЧАНИЕ: После генотипирования в шаге 4.9, только линии phaESC с удалениями как H19-DMR, так и IG-DMRдолжны быть протечены. Добавьте 750 МКЛ буфера мытья в каждый колодец, чтобы утолить трипсин. Pipette несколько раз, чтобы получить одну подвеску ячейки. Перенесите подвеску клетки в трубку 15 мл. Центрифуга трубки на 160 х г в течение 5 мин, удалить супернатант, и повторно клеточной гранулы в 2 мл гаЭСК среды. Аспирировать среду MEF из скважин 6-колодных пластин от шага 3.17. Перенесите подвеску phaESC с каждой трубки из шага 3.20 в новую колодец. Держите пластины на уровне 37 градусов по Цельсию в атмосфере 5% CO2. Расширьте клеточные клоны, повторяя шаги от 3,17 до 3,21 и увеличивая размер пластины и объемы трипсина, буфера стирки и среды haESC. Подготовьте колбу T25 для каждой суб клонированной линии PHAESC MEF для шага 5.ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем заморозить алицит каждой суб клонированной линии phaESC в 300 МКЛ замораживания среды и поддержания криостока в жидком хранении азота, прежде чем приступить к шагу 5. 4. Первый генотипирование суб клонированных линий phaESC с ПОМОЩЬю МЭФ Чтобы извлечь геномную ДНК из оставшейся клеточной суспензии из шага 3.15, добавьте 200 МКЛ буфера лиза к каждой колодец из 96-хорошо пластин. Перенесите подвеску клетки в трубку 1,5 мл. Промыть каждый колодец с дополнительным 200 йл буфера лиза, чтобы восстановить все оставшиеся клетки и собирать в той же трубке 1,5 мл. Инкубировать трубку 1,5 мл при 55 градусов по Цельсию в течение 3 ч с смешиванием. После инкубации добавьте 460 МКЛ изопропанола в каждую трубку 1,5 мл и аккуратно перемешайте до тех пор, пока не станет виден осадок ДНК. Центрифуга труб при ≥ 10000 х г в течение 5 мин и удалить супернатант. Вымойте гранулы ДНК 200 л 70% этанола. Центрифуга труб при ≥ 10000 х г в течение 5 мин и удалить супернатант. Высушите трубки в воздухе в течение 10 минут, а затем повторно потешите ДНК в 20 мл воды. Выполняйте полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с помощью термостабийной полимеразы ДНК в соответствии с протоколом производителя.ПРИМЕЧАНИЕ: Грунтовые пары для ПЦР перечислены в таблице 2 и используются следующим образом: H19-DMR-P1 и P3 (407 bp для удаленного H19-DMR); H19-DMR-P2 и P3 (623 bp для wildtype H19-DMR); IG-DMR-P1 и P3 (319 bp для удаленного IG-DMR); IG-DMR-P2 и P3 (492 bp для wildtype IG-DMR). Температурный профиль ПЦР для всех праймерных пар таков: 30 с 98 градусов по Цельсию, 35 х (10 с 98 градусов по Цельсию, 20 с 56 градусов по Цельсию, 30 с 72 градусов по Цельсию), 5 мин 72 градусов по Цельсию. Длина усиленных фрагментов ДНК для удалений H19-DMR и IG-DMR показывает некоторые изменения из-за неомологичный конец присоединения, связанные с CRISPR / Cas9-опосредованного редактирования. Фазы были отрастили с MEFs, которые содержат wildtype H19-DMRи ДНКIG-DMR. Таким образом, грунтовое пары H19-DMR-P2/P3 и IG-DMR-P2/P3, которые усиливают фрагменты ДНК дикого типа, не являются информативными. Тем не менее, эти грунтовки пары включены в качестве элементов управления и должны дать полосу во всех реакциях. Проанализируйте фрагменты ПЦР с помощью электрофорезов агарозного геля. Обратитесь к опубликованному протоколу о подробной процедуре электрофореза16. Определите клеточные линии с удалением как H19-DMR, так и IG-DMR. Репрезентативное изображение электрофорезы показано на рисунке 2B.ПРИМЕЧАНИЕ: В нашем случае, восемь клеточных линий с удалениями как H19-DMR и IG-DMR были определены среди 135 суб-клонированных линий phaESC. 5. Очистка гаплоидных клеток суб клонированных линий phaESC Когда суб клонированные культуры phaESC в колбах T25 от шага 3.22 становятся достаточно плотными для прохода, аспирируют среду и добавляют 1,5 мл трипсина. Инкубировать колбу при 37 градусов по Цельсию в течение 5 минут. Затем добавьте 4,5 мл буфера стирки и пипетки несколько раз, чтобы получить одноклеточную подвеску. Передача каждой клеточной суспензии в трубку 15 мл и центрифуга трубки на 160 х г в течение 5 мин. Удалите супернатант и повторно посовестите клеточные гранулы в 400 МКЛ буфера обслуживания haESC, дополненного 15 мкг/мл Hoechst 33342. Инкубировать подвески клетки при 37 градусов по Цельсию в течение 15 минут. После инкубации перенесите подвески клетки в трубку 5 мл через крышку клеточного ситечко. Промыть крышку ситечко клетки с дополнительным 400 йл буфера обслуживания haESC, и собрать оставшиеся клетки в той же трубке 5 мл. Держите трубку при 4 градусов по Цельсию, пока не будет готова к сортировке. Настройка цитометра потока с соплом 100 мкм в соответствии с инструкциями производителя.ПРИМЕЧАНИЕ: Hoechst 33342 может быть обнаружен путем возбуждения на 405 нм. Здесь для обнаружения Hoechst 33342 используется УФ-лазер 355 нм. Настройка клеточной подвески (от шага 5.3) и новой трубки 15 мл, содержащей 2 мл буфера обслуживания haESC для сбора отсортированных клеток в цитометре потока. Начните анализ и установите ворота сортировки для сбора гаплоидных клеток в фазе G1/S. Обратитесь к гистограмме на рисунке 2A для определения фазовой фазы G1/S фазы PHAESC.ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые суб-клонированные линии phaESC не могут содержать гаплоидных клеток из-за полной диплоидизации или ошибочного покрытия диплоидных клеток в шаге 2. Если гаплоидные клетки не наблюдаются в фазе G1/S, перейти к другому образцу без сортировки. В нашем случае 5 клеточных линий содержали гаплоидные клетки и 3 клеточные линии содержали только диплоидные клетки из 8 суб клонированных линий фазЕСК. После сортировки клеток добавьте 5 мл буфера для мытья вдоль стенки трубки сбора 15 мл. Центрифуга трубки на 160 х г в течение 5 мин. Удалите супернатант. Выберите тарелку подходящего размера для культивирования в зависимости от количества отсортированных ячеек. Используйте один колодец из 96-хорошо пластины, 24-хорошо пластины, и 12-хорошо пластины культуры 1000-40000 клеток, 40000-200000 клеток, и 200000-400000 клеток, соответственно. Переусердуйте клеточные гранулы в 120 МКЛ, 600 йл и 1,2 мл гаЕСК среды, соответственно.ПРИМЕЧАНИЕ: Плита клеток при высокой плотности, потому что низкое слияние может привести к гибели клеток после сортировки. С этого момента, phaESCs культурированы на желатин покрытием скважин без MEFs для облегчения генотипирования в шаге 6 и последующее применение для интрацитоплазмической инъекции от шага 9. После переноса клеточной суспензии в колодец с желатиновым покрытием соответствующего размера, инкубировать пластину при 37 градусов по Цельсию в атмосфере 5% CO2. Продолжить расширение культур phaESC, повторяя шаги 3,18 до 3,21 с увеличением размеров пластин и увеличение объемов трипсина, мыть буфер, и haESC среды. Клетки обуасваются на колодцах с желатиновым покрытием без МЕФ. Для каждой суб клонированной линии phaESC подготовьем культуру в одном колодец из 24-хорошо пластины и один колодец 6-хорошо пластины для шагов 6 и 9, соответственно.ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые клетки каждой суб клонированной линии phaESC должны быть заморожены в 300 МКЛ замораживания среды в качестве криостока в резервуаре для хранения жидкого азота, прежде чем приступить к шагу 9. 6. Второй генотипирование суб клонированных линий phaESC без MEFs ПРИМЕЧАНИЕ: Второй раунд генотипирования выполняется, чтобы подтвердить, что суб-клонированные линии phaESC обладают удалениями как H19- и IG-DMRs, и что аллели дикого типа отсутствуют после удаления MEFs. Подтвердите под микроскопом, что культуры в колодцах 24-колодцев из шага 5.11 свободны от МЕФ.ПРИМЕЧАНИЕ: Если МЕФ наблюдаются, необходимо продолжать передавать культуры до тех пор, пока МЕФ не исчезнут, чтобы избежать загрязнения ПЦР ДНК дикого типа из МЕФ. Аспирировать среду из стеченных культур и добавить 400 МКЛ буфера лиза на колодец 24-хорошо пластины. После трубки несколько раз, перенесите подвеску клетки в трубку 1,5 мл. Инкубировать трубку 1,5 мл при 55 градусов по Цельсию в течение 3 ч с смешиванием. После инкубации добавьте 400 МКЛ изопропанола в трубку 1,5 мл и аккуратно перемешайте до тех пор, пока не станет виден осадок ДНК. Центрифуга трубки при ≥ 10000 х г в течение 5 мин и удалить супернатант. Вымойте гранулы ДНК 200 л 70% этанола. Центрифуга трубки при ≥ 10000 х г в течение 5 мин и удалить супернатант. Высушите трубку в воздухе в течение 10 минут, а затем повторно почистите ДНК в 50 мкл воды. Выполните генотипирование ПЦР следующим шагом 4.7 и гель электрофорез в шаге 4.8 для идентификации клеточных линий, которые обладают удалениями как H19- и IG-DMRsи свободны от аллелей дикого типа.ПРИМЕЧАНИЕ: Изображение типичного второго генотипирования анализа показано на рисунке 2B для справки. В нашем случае все 5 клеточных линий, выбранных после очистки гаплоидных клеток (шаг 5), были свободны от аллелей дикого типа и обладали только аллелей удаления H19- и IG-DMRs. Используйте суб клонированные линии phaESC, выбранные после этого второго генотипирования в качестве линий DKO-phaESC. 7. Суперовуляция мышей Для производства MII oocytes, инициировать суперовуляцию путем внутриперитонеальной инъекции 5 МЕ беременной кобылы сыворотки гонадотропина (PMSG) раствор в каждой B6D2F1 женской мыши (4-5 недель) 63-65 ч до сбора яйцеклеток.ПРИМЕЧАНИЕ: Штамм мыши B6D2F1 рекомендуется для этого протокола, потому что Ооциты B6D2F1 хорошо переносят интрацитоплазмическую инъекцию и показывают высокий потенциал развитияпосле процедуры 17. Сорок восемь часов после инъекции PMSG, интраперитонально вводить 5 МЕ человека хорионического раствора гонадотропина в каждой мыши. 8. Сбор яйцеклеток Подготовь 4-хорошо пластины, содержащие 700 йл гиалуронидазы среды в одной скважине и 700 мл M2 среды в оставшихся 3 скважин. Кроме того, приготовьте 6-сантиметровое блюдо с 7 мл среды M2 и блюдом по центру с 900 мл среды M16. Предварительно разогреть тарелку и блюда при 37 градусов по Цельсию в атмосфере 5% CO2. В день интрацитоплазмической инъекции, усыплять суперовулированных женщин (от шага 7,2) либо вывих шейки матки или CO2 ингаляции около 8 утра. Рассекают яйцеклетки с помощью пинцета и ножниц. Поместите яйцеклетки в 6-сантиметровое блюдо со средой M2. Отпустите комплексы кумуляционных яйцеклеток (КОК), разрывая ампулу овидуков иглой 30 Г. Передача COCs в предварительно разогретой среде гиалуронидазы и держать при 37 градусов по Цельсию в атмосфере 5% CO2. Через 2-3 мин, собирать ооциты без кумулятива с ртом пипетки и мыть ооциты 3 раза, передавая их в свежей среде M2 в других 3 скважин 4-хорошо пластины. Соберите метафазы II (MII) ооцитов, которые обладают первыми полярными телами, в центре хорошо блюдо с M16 среды и держать пластину на 37 градусов по Цельсию в 5% CO2 атмосферу до использования для интрацитоплазмы инъекции в шаге 12. 9. Лечение и сбор DKO-фаЭСКО Подготовь культуру DKO-phaESC в колодец из 6-колодец пластины без MEFs на 60-80% слияния за день до интрацитоплазмической инъекции (от шага 5.11). Чтобы вызвать арест клеточного цикла в M-фазе, аспирировать средний полностью и добавить 2 мл гЕСК среды, содержащей 0,05 мг/мл демекольцина. После 8 ч демекольцина лечения, аспирировать среды и добавить 800 йл трипсина. Инкубировать пластину при 37 градусов по Цельсию в атмосфере 5% CO2 в течение 5 минут, затем добавить 2 мл буфера мытья, чтобы утолить трипсин, и пипетку несколько раз, чтобы получить одноклеточную подвеску. Перенесите подвеску клетки в трубку 15 мл. Центрифуга трубки на 160 х г в течение 5 мин и удалить супернатант. Переусердуйте клеточные гранулы в 400 МКЛ буфера обслуживания haESC, содержащего 15 мкг/мл Hoechst 33342. Инкубировать подвеску клетки при 37 градусов по Цельсию в атмосфере 5% CO2 в течение 15 минут. После инкубации перенесите подвеску клетки в трубку 5 мл через крышку клеточного ситечко и держите трубку на уровне 4 градусов по Цельсию до сортировки клеток в шаге 10. 10. Очистка М-фазы арестованных DKO-phaESCs Настройка цитометра потока с соплом 100 мкм в соответствии с инструкциями производителя.ПРИМЕЧАНИЕ: Hoechst 33342 может быть обнаружен путем возбуждения на 405 нм. Здесь для обнаружения Hoechst 33342 используется УФ-лазер 355 нм. Настройка M-фазы арестованных DKO-phaESCs от шага 9.7 и начать анализ. Выберите подходящие ворота сортировки для сбора гаплоидных клеток M-фазы (2n) из образца, обработанного демекольцином.ПРИМЕЧАНИЕ: После лечения демекольцином, 2 популяции клеток, как ожидается, соответствующие гаплоидных и диплоидных M-фазы арестованных клеток, как показано на рисунке 3B. Арест клеточного цикла после лечения демекольцином завершен, таким образом, не наблюдается пик гаплоидной ДНК 1n. Это важно, поскольку гаплоидные M-фазные клетки и клетки диплоидной G1 обладают одинаковым содержанием ДНК (2n) и производят перекрывающиеся пики. Настройка 15 мл трубки, содержащей 2 мл буфера обслуживания haESC для сбора отсортированных клеток в цитометре потока. Начните сортировку клеток. После сортировки клеток добавьте 5 мл буфера стирки вдоль стенки коллектора. Центрифуга трубки на 160 х г в течение 5 мин и удалить супернатант. Переусердствуй с клетками в соответствующем объеме буфера обслуживания haESC, чтобы получить окончательную концентрацию 5 х 105 клеток/мл. Перенесите подвеску клетки в трубку 1,5 мл. Держите трубку на льду до готовности к интрацитоплазмической инъекции в шаге 12. 11. Подготовка труб холдинга и микроинъекции ПРИМЕЧАНИЕ: Для выполнения интрацитоплазмической инъекции (шаг 12) требуется несколько пипеток холдинга и микроинъекции(рисунок 4A). Эти пипетки можно приобрести по индивидуальному заказу у коммерческого поставщика или сделать из подходящих стеклянных капилляров с помощью шкива микропипта и микрофорза. Потяните борозиликатные стеклянные капилляры на шкив микропипта. Чтобы вытащить борозиликатные стеклянные капилляры без нити (0,78 х 1,00 х 80 мм) для пылающего горизонтального шкива(таблицаматериалов) в качестве эталона, но будет отличаться для других инструментов и типов стеклянных капилляров: Heat 510 (Ramp test 480), Pull 0, Velocity 150, Time 175 и Pressure 200 для проведения пипеток; Тепло 510 (Ramp test 480), Pull 90, Скорость 140, Время 125 и Давление 200 для микроинъекции пипетки.ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальные параметры должны быть определены индивидуально, потому что несколько факторов, включая влажность, модель шкив микропипта и много стеклянных капилляров может повлиять на форму инъекций пипетки. Удлиненная форма с постепенным конусом должна быть направлена на. Подготовка проведения пипеток Установите один вытащил капилляр подготовлен в шаге 11,1 к микрофорге. Поместите капилляр над стеклянной шариком на нить и опустите капилляр, чтобы установить контакт со стеклянной шариком при нагревании нити. Разбейте капилляр, выключив отопление и отсоединив от стеклянного шарика так, чтобы его внешний диаметр составляет 60–100 мкм. Распоистите кончик капилляра горизонтально, чтобы лицом к стеклянной шарику на нити. Нагрейте нить, чтобы позволить внутреннему диаметру кончика капилляров расплавиться до диаметра 10-20 мкм. Перемести капилляр так, чтобы стеклянный шарик позиции в точке 1 мм от капиллярного кончика без контакта. Нагрейте нить, чтобы капилляры согнуть под углом 20 градусов. Смонтировать капилляр, называют проведение пипетки, от микрофоржа.ПРИМЕЧАНИЕ: Для измерения размера капилляра, окулярная решетка предпочтительно установлена в микрофорге. Приготовление микроинъекции пипеток Установите один вытащил капилляр подготовлен в шаге 11,1 к микрофорге. Поместите капилляр над стеклянной шариком на нить и опустите капилляр, чтобы установить контакт со стеклянной шариком при нагревании нити. Разбейте капилляр, выключив отопление и отсоединив от стеклянной шарика в положении, что его внешний диаметр составляет 6 мкм. Перемести капилляр так, чтобы стеклянный шарик позиции в точке 1 мм от капиллярного кончика без контакта. Нагрейте нить, чтобы капилляры согнуть вверх под углом 20 градусов. Смонтировать микроинъекцию пипетки из микрофорги и хранить в безопасной коробке для более длительного использования.ПРИМЕЧАНИЕ: микроинъекции пипетки готовятся со следующими спецификациями: внешний диаметр, 6 мкм; внутренний диаметр, 4,5-5 мкм; угол наклона, 20 градусов. Определение оптимальной конструкции микроинъекции пипетки имеет важное значение для успеха интрацитоплазмической инъекции. Слишком большой внутренний диаметр может предотвратить разрыв плазменной мембраны донора DKO-phESCs (см. раздел обсуждения). Если внутренний диаметр слишком узкий, он может препятствовать гладкой трубе донора DKO-phESCs. Угол изгиба «lt; 30» предпочтительнее, так как высокий угол изгиба препятствует эффекту импульсов пьезо. 12. Интрацитоплазмическая инъекция DKO-фаЭСКО Перед интрацитоплазмической инъекцией (от шага 12.2), подготовить раствор поливинилпирролидон (PVP), добавив 5 мл M2 среды в 50 мл трубки, содержащей 0,6 г PVP и агитации трубки на рокер при 4 градусов по Цельсию в течение 2 дней. После полного растворения PVP растворяется, раствор фильтруется и хранится при 4 градусах Цельсия. В день интрацитоплазмической инъекции приготовьте блюдо в центре города с 900 МКЛ средней KSOM и предварительно разогреете блюдо при 37 градусах Цельсия в атмосфере 5% CO2. Приготовьте блюдо из микроманипуляции, выровняв капли 5 МКЛ раствора PVP и 20 МКЛ среды M2 на крышке 10-сантиметрового блюда, которое помещается вверх дном. Обложка капель с минеральным маслом, и поместите блюдо на стадии инъекционного микроскопа.ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемое расположение микроманипуляции блюдо показано на рисунке 4B. Установите удерживаемую пипету на микроманипулятор. Заполните микроинъекции пипетки с фторуглеродного масла с помощью микрозагрузчика отзыв, и установить его на piezo привода. Погрузите микроинъекцию пипетки в каплю с PVP раствором и пипеткой вверх и вниз несколько раз, чтобы покрыть стекло PVP и сделать его менее липким. Загрузите небольшой объем PVP раствора в микроинъекции пипетки, и переместить пипетку в каплю со средним M2. Погрузите удерживаемую пипетут в среду M2 и сосредоточьтесь на пипетки в нижней части капли. Передача примерно 2 мл подвески DKO-phaESC из шага 10,6 в среднее падение M2. Передача 10 MII oocytes от шага 8.5 в том же M2 средней капли с помощью рот пипетки. Для инъекции поверните яйцеклетку в средней капле M2 так, чтобы перивильное пространство столкнулось с микроинъекцией пипетки, а пластина MII не расположена на пути микроинъекции пипетки(рисунок 4A). Держите яйцеклетки, применяя отрицательное давление через удерживающих пипетки.ПРИМЕЧАНИЕ: Пластина MII визуально идентифицируется как выступ ооплазмы, которая называется “горб” и часто находится рядом с первым полярным телом. Пластина MII содержит мейотический шпиндель с прикрепленными хромосомами. Прикосновение к микроинъекции пипетки и пластины MII следует избегать, как механическое повреждение шпинделя и хромосом может нарушить развитие эмбриона. Загрузите один DKO-phaESC в кончик микроинъекции пипетки, применяя мягкое отрицательное давление. Разрыв плазменной мембраны DKO-phaESC путем трубопроводов, чтобы избежать инъекции нетронутой DKO-phaESC(рисунок 3C; см. обсуждение).ПРИМЕЧАНИЕ: В случае, если плазменная мембрана DKO-phaESC не разрывается путем трубопроводов, отбросьте DKO-phaESC и загрузите другой DKO-phaESC. Поместите микроинъекцию пипетки в контакт с zona pellucida яйцеклетки, и применить небольшое количество отрицательного давления в микроинъекции пипетки. Нанесите пьезо импульсы (интенсивность, 20; частота, 4), чтобы прорваться через зону, толкая кончик пипетки микроинъекции к перивителлиновому пространству. Подтвердите, что пластина MII, содержащая шпиндель и хромосомы, не находится на пути микроинъекции пипетки.ПРИМЕЧАНИЕ: Эмпирически настроить настройки на самые низкие импульсы пьезо для бурения через зону, чтобы свести к минимуму возможность повреждения oolemma. Отбросьте фрагмент zona pellucida из микроинъекции пипетки и распоимите DKO-phaESC на краю пипетки. Проникают в яйцеклетку с помощью микроинъекции пипетки так, что oolemma достигает противоположной стороны.ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикасайтесь к пластине MII, чтобы предотвратить повреждение шпинделя и хромосом. Нанесите пульс пьезо (интенсивность, 6; частота, 1), чтобы пробить oolemma. Убедитесь, что oolemma расслабляется вдоль вала микроинъекции пипетки.ПРИМЕЧАНИЕ: Эмпирически определить самый низкий параметр пульса пьезо для нарушения oolemma свести к минимуму ущерб яйцеклетки. Ввимите DKO-phaESC с минимальным объемом среды в ооплазму и свяжете микроинъекцию пипетки плавно из яйцеклетки. Освободите вводимый яйцеклетку из удерживающих пипеток и поместите ее на сторону микропропа для более поздней коллекции. Повторите процедуру инъекции с ступеней 12,9 до 12,17 для других яйцеклеток MII в средней капле M2.ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте хранения яйцеклеток из инкубатора в течение более 20 минут. По нашему опыту, партия из 10 яйцеклеток можно манипулировать комфортно в течение 15 минут после соответствующей подготовки. Перенесите партию инъекционных яйцеклеток из среднего падения M2 в предварительно разогретое блюдо в центре с помощью среды KSOM. Держите блюдо в течение 1 ч при 37 градусов по Цельсию в атмосфере 5% CO2. Повторите манипуляции ооцитов из шагов 12,5 и 12,20 с дополнительными группами Ооцитов МИИ, чтобы получить достаточное количество инъекционных яйцеклеток. 13. Активация построенных полу клонированных эмбрионов Приготовьте два блюда из центра и 900 йл каждый из среды KSOM и среды активации. Подготовь 4-хорошо пластины с 700 йл KSOM среды в каждой хорошо. Предварительно разогреть посуду и тарелку при 37 градусов по Цельсию в атмосфере 5% CO2. После 1 ч в среде KSOM, передача вводили яйцеклетки из шага 12,21 в предварительно разогретый центр хорошо блюдо с активацией среды. Держите блюдо в течение 6 ч при 37 градусов по Цельсию в атмосфере 5% CO2 для активации. После активации, наблюдать некоторые полу-клонированных эмбрионов образуют три полярных тела, которые являются первым и вторым полярных тел яйцеклетки, и псевдо полярного тела из DKO-phaESC (Рисунок 3E). Вымойте эмбрионы 3 раза, переведя их в новые скважины со средой KSOM в 4-хорошо пластины. Передача эмбрионов в центр хорошо блюдо с KSOM среды, и держать блюдо при 37 градусов по Цельсию в 5% CO2 атмосферу для дальнейшего развития. 14. Разработка построенных полу клонированных эмбрионов После 1 дня культуры в среде KSOM от шага 13.6, несколько полу-клонированных зародышей достигают 2-клеточной стадии(рисунок 5A). Для дальнейшего развития предимплантационной эмбрионов в пробирке продолжайте культивирование полу клонированных эмбрионов в среде KSOM при 37 градусах Цельсия в атмосфере 5% CO2. Перенесите полу клонированные эмбрионы в свежую среду KSOM на второй день. На 4-й день несколько эмбрионов достигнут стадии бластоцистки(рисунок 5A). Для производных полу клонированных мышей, перенос 2-клеточных эмбрионов из шага 14.1 в яйцеклетки псевдо-беременных самок-реципиентов. Определите псевдо-беременных самок путем спаривания с вазэктомизированных самцов за день до переноса эмбриона и выберите их на основе наличия четко видимой вилки утром дня для переноса эмбриона (0,5 дней после койтума (dpc)). Около 19.5 dpc, полный срок щенков, естественно, доставлены от женщин-получателей(рисунок 5B).