経瞳孔二光子マウス網膜のin vivoイメージング

注:以下の手順は、セントルイスのワシントン大学の施設動物管理および使用委員会のガイドラインに準拠して実行されました。この研究で使用された試薬、機器、および動物の詳細については、 材料の表 を参照してください。 1.アデノ随伴ウイルス注射 注:網膜の特定の細胞の標識は、発現パターンが制限されたCreトランスジェニックマウス株で達成できます。このセクションでは、蛍光タンパク質のCre依存的発現をコードし、特異的網膜細胞を標識するAAVベクターの硝子体内送達について説明します。4週齢からマウス(雄と雌)を注射します。 マイクロピペット針の準備マイクロピペットプーラーを使用して、ホウケイ酸ガラスキャピラリーニードルを作成します。マイクロピペットプーラーにガラスキャピラリーをロードし、ランプテストを実行して、結果の値を記録します。ランプテストに使用したガラスキャピラリーを廃棄します。 次の設定でマイクロピペットを引きます:熱:ランプテスト値マイナス10;プル:55;ベロシティ:65;時間:120;空気圧:500;プル開始時の放送時間:20。注意 プラーごとに設定を調整する必要がある場合があります。 解剖顕微鏡で、かみそりの刃を使用して、ガラスの先端が力でわずかにたわむ位置(テーパー部分の端から~10 mm)で、引っ張られたマイクロピペットの先端を切り取ります。カットが斜めの先端を生成するように鋭角にカットします。鈍い先端を捨てます。 注射器の準備カットガラス製マイクロピペットを、酢酸エチル(EVA)プラスチックチューブ(内径0.05インチ、外径0.09インチ)の2cmセグメントに取り付けます。このチューブセグメントのもう一方の端を、長さ20cmのEVAチューブ(内径0.02インチ、外径0.06インチ)に接続します。 チューブを22 Gのセメント針を備えた50 μLのガラスシリンジに接続します。ガラスシリンジからプランジャーを取り外し、25Gシリンジニードルを使用してシリンジと接続されたチューブをミネラルオイルで埋め戻します。マイクロピペットの先端に4mmのスペースを残します。 AAVの硝子体内注射生存手術のための施設プロトコルに従って、滅菌手術用手袋、清潔な白衣、マスク、滅菌フィールド、およびオートクレーブ滅菌器具を使用して、標準的な無菌技術で硝子体内注射を実行します。 AAVベクターのアリコートを-80°Cで保存場所から除去し、氷上で解凍します。解凍後、2,000 × g で10秒間遠心分離し、気泡を取り除きます。 施設動物研究委員会の麻酔および規制物質のガイドラインに従ってください。.30 Gの皮下注射針を使用して、ケタミン/キシラジンカクテル(10 mg / mLケタミン、生理食塩水中1 mg / mLキシラジン、マウスへの有効用量:100 mg / kgケタミン、10 mg / kgキシラジン)の0.1 mL / 10 g体重腹腔内(IP)注射を行います。.マウスをケージに戻し、麻酔が有効になるまで5分間待ちます。 30 Gの皮下注射針を使用して、メロキシカムの0.1 mL / 10 g体重の皮下注射を行います(0.9%塩化ナトリウム溶液0.5 mg / mL)。. 角膜反射の喪失と尾とつま先のつまみへの離脱反射を確認することにより、麻酔の深さをテストします。尾とつま先の離脱反射を失った後も角膜反射が続く場合は、各眼に0.5%プロパラカイン溶液を滴下し、10秒間待ちます。. マウスを実体顕微鏡の下に横向きに置きます。ミニブルドッグ止血クランプを使用して、軌道より上下の皮膚をつかみ、クランプを内側のカンサスに固定して、地球を軌道から部分的に変位させます。 切断したマイクロピペットをガラスシリンジに接続し、縁筋の1~2 mm後方に外側強膜を穿刺します。辺縁のすぐ後方を円周方向に走る血管系を乱さないでください。強膜に垂直な角度で穿刺を行い、強膜を穿孔した直後にマイクロピペットをわずかに引っ込めて、レンズの損傷を防ぎます。 ガラスシリンジのプランジャーを使用して、注射用の液体量にほぼ対応する1〜2μLの硝子体液を引き出します。マイクロピペットを目から引き出し、除去した硝子体液を排出します。 マイクロピペットの先端に1〜2 μLのAAVを入れ、ウイルスベクターと鉱物油の間に~4 mmの空間を残して、混合を防ぎます。最初の穿刺によって作成された強膜の穴にマイクロピペットを挿入し、ガラスシリンジのプランジャーをゆっくりと押して、20〜30秒かけてウイルスベクターを注入します。マイクロピペットの先端でウイルスベクターの液面を可視化し、空気が目に入る前に注入を停止するように注意してください。 マイクロピペットを同じ位置に10秒間保持してから、マイクロピペットを引っ込めます。ブルドッグ止血クランプを取り外します。 オキシテトラサイクリン/ポリミキシンB抗生物質眼科用軟膏を注射した眼に塗布します。.マウスを加熱パッドの上に置き、麻酔からの回復を監視します(3.4.3を参照)。 マウスをハウジングに戻し、施設のガイドラインに従って術後ケアを行います。イメージングの前に、蛍光色素のウイルス媒介発現に2〜3週間かかります。 2. 顕微鏡のセットアップ 注:顕微鏡の光路の概略図を 図1に示します。 「常時オン」の機器:これらの機器は、調整またはメンテナンスを受けない限り、常にオンのままにしておく必要があります。レーザー冷却システムの高温を20.0°Cに設定します。 超高速Ti:Sapphireレーザーの主電源をオンにし、システム起動プロセスの完了時間を確保し、「レーザーイネーブル」キーを「オン」の位置に回します。 発光光路構成目的の蛍光色素に適した二色性フィルターセットとバンドパスフィルターセットを使用して、蛍光放出収集経路をサンプル波長に設定します。注:この原稿では、Twitch2bイメージングは、505ロングパスダイクロイックと480/40および535/30バンドパスフィルターペアで構成されるフィルターキューブを使用しました。GFPは、525/50および605/70バンドパスフィルターを備えた560ロングパスフィルターで構成される赤/緑フィルターキューブを使用して画像化されました。エバンスブルーは、560ショートパスフィルターを使用して画像化されました。発光フィルターを変更すると、発光光路が迷走室内光にさらされ、光電子増倍管(PMT)が損傷する可能性があります。光の露出はPMT機能に悪影響を与える可能性があるため、PMTがオフになっていることを確認し、収集光パスを変更する前に部屋のライトをオフにします。 画像取得の開始注意: 2光子レーザーに直接さらすことは、遠赤色光がまばたき応答を誘発しないため、特に目に危険です。レーザーが光路に沿って閉じていることを確認するために適切な注意を払い、接眼レンズを介した曝露や顕微鏡対物レンズからの放出からユーザーを保護するためにフェイルセーフを配置する必要があります。ユーザーは、レーザーが対物レンズから放出される条件を理解し、そのような危険にさらされないように適切な予防措置を講じる必要があります。データ収集デバイス、コンピューター、ポッケルスセル、顕微鏡およびステージコントローラー、メカニカルシャッターコントローラー、およびPMT主電源の電源を入れます。PMTは、画像取得の準備ができ、迷光から遮蔽されるまで「無効」状態に保ちます。コンピューターと画像取得ソフトウェアのレーザー制御インターフェースを開きます。コンピュータインターフェースからレーザーをオンにし、モードロックを確認します。 希望のレーザー波長を設定します。レーザーシャッターを開いてレーザー光がポッケルスセルに入っていることを確認し、レーザー出力が安定するまで30分待ちます。 対物レンズでのレーザー出力の測定と最大レーザーパーセンテージの設定注意: レーザー放射は、パワー測定中に対物レンズから放射されます。イメージングシャッターを有効にする前に、顕微鏡エンクロージャカーテンを閉じ、適切な目の保護具を着用してください。システムの初期設置時にレーザー出力を測定して、対象波長ごとに出力曲線を確立し、その後毎月測定して励起電力の安定性を検証します。光パワーメータの電源を入れ、レーザー波長に対応する測定波長を選択します。光パワーメータ検出器を顕微鏡ステージに置き、X-Y寸法で対物レンズの真下に操作します。Z次元電動フォーカスドライブを使用して、パワーメーター検出器が対物レンズより~1mm下になるまで対物レンズを下げます。 落射蛍光照明から顕微鏡励起光路としてのレーザーに切り替えます。メカニカルシャッターを有効にします。 画像取得ソフトウェアで、ポイントスキャンを開始してイメージングシャッターを開き、レーザーを光パワーメーターに送信します。スキャンソフトウェアでレーザー出力を100%に設定します。最高のレーザー出力測定が得られるまで、パワーメータ検出器のX-YおよびZ位置を最適化します。 ポッケルスセルで対物レンズのレーザー出力を0.1%から100%まで測定し、10%間隔で測定します。対物レンズでの45 mWの電力に対応するポッケルスセルの割合を記録します。このパーセンテージを画像取得ソフトウェアの最大レーザー出力として設定します。注:標的組織に目に見える損傷を与えずにin vivoマウス網膜イメージングで観察された最高出力は、イメージングの2週間後に組織学的染色によってアッセイされた45mWでした。明らかな網膜損傷は、対物レンズで55 mWでイメージングした後に明らかです。 イメージングシャッターを無効にし、励起光路を落射蛍光に戻します。 3. 画像取得用マウスの準備 イメージング用麻酔マウス注意: イソフルランへの曝露を軽減するために、適切な廃ガスの清掃を確認してください。麻酔導入室の排気口がパッシブ掃気ガスフィルターキャニスターに接続され、マウス麻酔ノーズピースの出口がガス排出装置によって提供される真空のアクティブ掃気ガスフィルターキャニスターに接続されていることを確認してください。交換のためにフィルターキャニスターの重量を監視するためのメーカーのガイドラインに従ってください。上記のステップ1.3.3で説明したように、ケタミン/キシラジンカクテルを使用してマウスを麻酔します。あるいは、麻酔の維持のためにイソフルランも使用する場合は、イソフルラン吸入を介して麻酔を誘発します(画像セッション>30分)。小動物麻酔装置を、0.5 L / minの流量で室内空気と混合した5%イソフルランで誘導チャンバーを満たすように設定します。マウスを誘導チャンバーに入れ、マウスが麻酔されるまで15秒待ちます。 イソフルラン気化器を0%に切り替え、麻酔の流れをノーズピースに向けます。誘導チャンバーの5秒間の「O2 フラッシュ」を実行します。マウスを誘導チャンバーから取り出し、ヘッドホルダーに固定して(セクション3.3を参照)、ノーズピースを取り付けます。 麻酔の維持のために、1%イソフルランと室内空気の混合物を0.5 L / minの流量で使用します。.麻酔中は5分間隔で呼吸数を監視し、イソフルランの割合を調整して、呼吸数を~60呼吸/分に維持します。注:これらの設定(%イソフルラン、流量)は、ケタミン/キシラジンカクテルによって誘発される麻酔の維持にも使用できます。 瞳孔拡張1%w / vアトロピンと2.5%w / vフェニレフリン塩酸塩の溶液を水中に調製します。拡張器溶液は、光から保護された室温で保管してください。 使い捨てピペット点眼器を使用して、画像化する各目に拡張器溶液を一滴塗布します。部屋の明かりを消し、瞳孔が拡張するまで5分間待ちます。瞳孔が拡張したら、糸くずの出ない組織で拡張器溶液を吸い取ります。注意: 拡張器溶液が鼻孔に入らないようにしてください。 画像化する各目に潤滑剤アイジェルを大量に塗布します。両目を画像化する場合は、脱水症を防ぐために、非画像眼のアイジェルの上にプラスチックの粘着フィルムの小片を塗布します。片方の目だけを画像化する場合は、画像化されない目に潤滑剤の眼軟膏を塗布します。 イメージング用のポジショニングマウスマウスをイメージングヘッドホルダーに固定するには、イヤピースバーが水平より60°以上の角度で傾くまでヘッドホルダーのメインアームを回転させます。下外耳道ピンを内側に伸ばした位置に固定し、上耳道ピンを引き出した位置に固定します。 マウスをバイトバーに向けて、片方の耳を伸ばした下部ピンに取り付け、ピンを外耳道に挿入します。上外耳道ピンを固定しているネジを緩め、ピンをもう一方の外耳道に伸ばします。ネジを締めてヘッドを固定します。 バイトバーをマウスの頭に向かってスライドさせます。マウスの頭をそっと持ち上げてから、マウスの上顎切歯をバイトバーの穴に下げます。バイトバーを穏やかな力で引っ込めてマウスの頭を固定し、ネジを締めてバイトバーの位置を固定します。 イソフルランを使用する場合は、マウスの切歯を固定する前に、ノーズピースをスロットからバイトバーにスライドさせます。.手順3.3.3のようにバイトバーの位置を固定して締めます。マウスの鼻にぴったりと収まるまで、上面の2本のネジを使用してノーズピースを締めますが、鼻を収縮させません。 ヘッドホルダー内のマウスを対物レンズの下の顕微鏡ステージに移します。ヘッドホルダーのメインアームを、目の瞳孔が光路に沿ってまっすぐ上を向くまで回転させます(図2)。 コンパクトなフィルターホルダーに#1.5カバーガラスを置き、ホルダーを顕微鏡ステージに取り付けます。カバーガラスを目に向かって下げ、カバースリップが角膜のすぐ上に水平になるように潤滑剤アイジェルを接触させます(図2)。カバーガラスが角膜に触れないようにしてください。注意: 顕微鏡で、励起光路が落射蛍光に設定され、発光光路が接眼レンズに設定されていることを確認してください。落射蛍光イルミネーターを最低電力でオンにし、イルミネーターシャッターを開きます。イメージングする蛍光色素に対応する落射蛍光照明器の波長と蛍光フィルターを選択します。 広視野励起光が角膜を完全に覆うまで、ステージコントロールと電動フォーカスドライブを使用して、X-Y寸法でステージを操作し、Zポジションで対物レンズを操作します。接眼レンズを通して見て、網膜の蛍光細胞または構造が焦点が合うまで、ステージのZ位置を調整し続けます。サンプル信号が明るさが不十分で、接眼レンズを通して関心のある個々の細胞または構造を分解できない場合は、落射蛍光イルミネーターのパワーを上げます。注意: 網膜の位置がわかりにくい場合、虹彩は高コントラストのランドマークであり、固定してから網膜に向かって焦点を合わせます。このステップでは、瞳孔が最大限に拡張していることを検証することもできます。 マウスレンズで軸上のイメージング領域を取得します。焦点面を調整するときに、焦点が合っていない光の膨張または収縮のみが発生するまで、ヘッドホルダーのさまざまな自由度を使用してマウスの角度を調整します。落射蛍光イルミネーターの電源を切り、イルミネーターシャッターを閉じます。注意: Z方向の焦点面をスクロールしている間の焦点が合っていない光の著しいX-Y視差は、網膜がイメージング光路に対して軸上にないことを示しています。 4. 2光子画像取得 画像のセットアップと取得パラメータ注意: 部屋の照明をオフにし、部屋の迷光光源を覆います。落射蛍光イルミネーターがオフになっていて、イルミネーターシャッターが閉じていることを確認してください。励起光路をレーザーに切り替え、発光光路を光電子増倍管に切り替えます。 画像取得ソフトウェアで、フレームサイズを512 x 512、フレーム平均を3に設定します。スライスあたりのステップ数を -8 μm に設定します。zステッピングをスタックの一番上から開始して下に向かって進むように指定し、光受容体の2光子レーザー活性化を最小限に抑えます。注:イメージング時間の増加を犠牲にして、ステップサイズを小さくしてZ分解能を上げることができますが、このイメージング構成で細胞体細胞を分解するには8μmステップで十分です。 PMTをオンにして有効にします。 PMT電圧を680 Vに調整します。 励起シャッターを有効にします。メモ: パワードPMTは軽い損傷を受けやすいです。落射蛍光照明がオフになっていて、顕微鏡エンクロージャーのカーテンが引かれ、部屋の照明がオフになっていることを確認します。 1%のレーザー出力から始めて、ターゲット組織のライブ画像プレビューを開始します。ディスプレイの明るさを自動調整して、目的のセルまたは構造を視覚化します。スキャンフェーズを自動調整します。ターゲット組織が薄暗いか不明瞭な場合は、2.4.4mWに対応するステップ45で設定された制限を超えることなく構造が見えるようになるまで、レーザー出力のパーセンテージを増やします。注:16ビット画像の場合、関心のある構造を含むZ平面の明るさを自動調整するときの表示値が~1000の場合は、サンプルの十分な明るさを示します。 顕微鏡ステージをX-Y方向に操作して目的のイメージング領域の中心に配置し、関心のある構造に焦点を合わせたZ平面に移動します。注:視神経乳頭に隣接するイメージングにより、慢性イメージング実験の明確なランドマークとして機能することができます。 これが慢性的なタイムラプス実験である場合は、取得コンピューターで以前の画像を開き、それを参照として使用して、同じ関心領域を見つけます。イメージングの角度が前の画像の角度と類似していることを確認して、最小視差で同じセルセットを取得します。注:前の時点と同じセルを画像化するには、マウスの頭の位置をさらに調整する必要があります(図3)。 対象の最上部と最下部のZ平面に移動してイメージングスタックのZ制限を設定し、画像を取得します。画像取得が完了したら、PMTと発光シャッターを無効にします。発光光路を接眼レンズに戻し、励起光経路を落射蛍光照明に切り替えます。顕微鏡ステージからマウスを取り外します。 システムソフトウェアとハードウェアのシャットダウン画像取得ソフトウェアを終了します。コンピュータインターフェースのレーザーをオフにします。「常時オン」機器を除き、逆の起動順序でハードウェアをシャットダウンします。 マウスの回復ヘッドホルダーとマウスを顕微鏡ステージから取り外します。該当する場合は、イソフルラン気化器を0%に設定します。ヘッドホルダーからマウスを取り外します。 糸くずの出ないティッシュで潤滑剤アイジェルをそっと拭き取り、白いワセリン鉱油潤滑剤眼軟膏を両目に塗ります。マウスを温水循環加熱パッド(37°Cに設定)に置き、マウスが目覚めて歩行能力を取り戻すまで、マウスに注意を払い、呼吸数を監視し続けます。マウスをハウジングに戻します。 該当する場合は、硝子体内注射後24時間で動物の活動と罹患率を評価します。.研究が完了したら、トリブロモエタノール(250 mg / kg)の過剰摂取でマウスを安楽死させ、網膜組織を保存するために4%パラホルムアルデヒドで経心灌流を行います。. 5. 画像処理・解析 マルチチャンネルデータのインターリーブ解除とマージ特定の画像取得ソフトウェアプログラムはマルチチャンネル画像をインターリーブ形式で保存するため、フィジー(https://imagej.net/Fiji)などのソフトウェアを使用して.tif画像ファイルを開き、チャンネルを分離します。 フィジーの 画像 メニューで、 スタック |ツール |インターリーブ解除。画像を構成するチャンネル数を入力し、[ OK]をクリックします。 分離したチャンネルを 1 つのファイルにマージするには、 画像 |カラー |チャンネルをマージします。インターリーブ解除した画像チャンネルを別々のカラーチャンネルに配置し、「 OK 」をクリックしてマルチチャンネル合成画像を作成します。この合成画像を新しい.tifファイルとして保存します。 マルチチャンネル画像における蛍光強度の定量化注:指定された関心領域(ROI)内の蛍光強度は、フィジーを使用して単一画像平面で定量化できます。レシオメトリック読み出しの定量化は、同じROI内の合成画像の異なるチャネルにおける蛍光強度を測定することによって達成することができる。慢性イメージング実験では、励起または発光レシオメトリック出力に基づくバイオセンサーを使用するのが最善です。フィジーでは、 分析 |ツール |ROIマネージャー。フィジーで合成画像を開きます。目的の構造に対応する Z スライスまでスクロールし、選択ツール (四角形選択、楕円選択、ポリゴン 選択 など) を使用して ROI の概要を説明します。 キーボードの T キーを押して、各選択項目を ROI マネージャに追加します。ROIの選択が完了したら、ROIマネージャーの[測定]をクリックして、面積や平均強度の値などのROIからのさまざまなデータを記録します。 結果ウィンドウに記録されている現在選択されているチャンネルの測定値をスプレッドシートにコピーします。コンポジット画像ウィンドウで次のチャンネルに切り替え、[測定]をクリックして、同じROIセット内のそのチャンネルの測定値を取得します。ROIマネージャー内で、[その他]に移動します|ROI を保存し、.zip ファイルとして保存します。 ディスプレイ用の最大強度投影画像データの表示を作成するには、フィジーのZプロジェクト関数を使用します。 [イメージ ] メニューで、[ スタック |Zプロジェクト。対象領域が存在するフレームのみを選択して、背景を縮小します。 PMTショットノイズを除去したい場合は、 メディアンフィルタ機能を使用します。 [プロセス ] メニューで、[ プロセス |フィルター |中央値。空間の詳細を維持するには、値 1.0 を選択します。 単一セルに焦点を当てた最大強度の投影を作成するには、目的のセルに対応する画像フレームのみを選択して、このプロセスを繰り返します。注:これにより、セルラーアーバーを解決する能力が大幅に向上します(図4)。蛍光強度の測定は、最大強度投影ではなく、単一画像平面で実行する必要があります。