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발생학

Applicazioni di immobilizzazione dei tessuti Drosophila con coaguli di fibrina per l'imaging dal vivo

Published: December 22, 2020
doi:
10.3791/61954
,
1Cell & Developmental Biology, School of Life Sciences,University of Dundee

Summary

Questo protocollo descrive le applicazioni dell’immobilizzazione dei campioni utilizzando coaguli di Fibrin, limitando la deriva e consentendo l’aggiunta e il lavaggio di reagenti durante l’imaging dal vivo. I campioni vengono trasferiti in una goccia di Fibrinogen contenente terreno di coltura sulla superficie di un coverslip, dopo di che la polimerizzazione è indotta dall’aggiunta di trombina.

Abstract

Drosophila è un importante sistema modello per studiare una vasta gamma di questioni biologiche. Vari organi e tessuti di diversi stadi di sviluppo della mosca come i dischi immaginari, le camere larvali del cervello o delle uova delle femmine adulte o dell’intestino adulto possono essere estratti e tenuti in coltura per l’imaging con microscopia time-lapse, fornendo preziose informazioni sulla biologia cellulare e dello sviluppo. Qui, descriviamo in dettaglio il nostro attuale protocollo per la dissezione dei cervelli larvali di Drosophila, e poi presentiamo il nostro attuale approccio per immobilizzare e orientare cervelli larvali e altri tessuti su una coverlip di vetro usando coaguli di fibrina. Questo metodo di immobilizzazione richiede solo l’aggiunta di Fibrinogen e Thrombin al mezzo di coltura. È adatto per l’imaging time lapse ad alta risoluzione su microscopi rovesciati di più campioni nello stesso piatto di coltura, riduce al minimo la deriva laterale frequentemente causata dai movimenti della fase del microscopio in microscopia da visita multi-punto e consente l’aggiunta e la rimozione di reagenti durante il corso di imaging. Presentiamo anche macro su misura che utilizziamo regolarmente per correggere per la deriva e per estrarre ed elaborare informazioni quantitative specifiche dall’analisi time-lapse.

Introduction

Drosophila continua ad essere un importante sistema modello per studiare una vasta gamma di questioni biologiche ed è eccelleto nel far progredire le conoscenze in molte discipline per decenni. Una caratteristica che lo distingue particolarmente è che è particolarmente adatto per l’imaging dal vivo. La capacità di monitorare i processi subcellulari o il comportamento di cellule e tessuti in tempo reale continua a contribuire a generare concetti chiave rilevanti per la biologia cellulare e dello sviluppo. Molti protocolli di successo sono stati sviluppati da diversi gruppi per mantenere vivi e sani tali campioni di Drosophila per studiare il comportamento del campione e delle molecole fluorescenti vive. Organi e tessuti della mosca come idischi immaginari1,2,il cervello larvale3,4,5, 6o camere d’uovo di femmine adulte7,8,9o l’intestino adulto10 per esempio possono essere estratti e conservati in coltura per l’imaging con microscopia time-lapse. Una sfida fondamentale per l’imaging dal vivo consiste nel garantire che il campione sia tenuto vicino alla superficie di imaging per una risoluzione ottimale e immobile senza compromettere l’integrità del campione che può essere sensibile agli impatti meccanici. Per studiare le cellule staminali neurali, chiamate neuroblasti o neuroni nel cervello larvale della Drosophila, ad esempio, mantenere i campioni vicini alla superficie di imaging può essere ottenuto coprendoli con mezzi di coltura in camere di imaging sigillate11,12,13. Tuttavia, questo approccio non consente facilmente lo scambio di media limitando così lo spazio sperimentale di manovra. In alternativa, i campioni possono essere preparati e posizionati su coverlips trattati per aumentare l’adesione delle cellule e consentire la microscopia a visita multi-punto e l’imaging esteso a cellule vive in piatti a coltura aperta, che potenzialmente consentono lo scambio di media, ma non forniscono mezzi facili per prevenire la deriva o la perdita del campione durante lo scambiodi media 14,15.

Il metodo del coagulo di Fibrina originariamente sviluppato per studiare la meiosi negli spermatociti vita gru-mosca16 è specificamente adatto a superare questi problemi. Il fibrinogeno viene sciolto nel mezzo di coltura pertinente, i campioni posizionati e orientati in una goccia di questa soluzione su un’adeguata camera di imaging vetro-superficie prima dell’aggiunta di Trombina, con conseguente rapida formazione di un coagulo di Fibrina insolubile, una rete fibrosa appiccicosa che aderisce alla superficie del vetro e ai campioni garantendo al contempo l’accesso del campione al terreno di coltura. Il mezzo può quindi essere scambiato senza perturbo il coagulo o la posizione del campione. Lo scambio di mezzi di coltura durante l’imaging è, ad esempio, auspicabile quando gli inibitori devono essere aggiunti come nel metodo originale o per esperimenti di lavaggio o inseguimento di impulsi o quando i coloranti fluorescenti devono essere aggiunti durante l’imaging di cellule vive mantenendo cellule e tessuti in posizione. I coaguli di fibrina sono adatti per l’imaging di tessuti Drosophila e singolecellule 13,17. I coaguli di fibrina possono essere ulteriormente utilizzati per aiutare a orientare i campioni, che a causa della loro forma o altre proprietà normalmente non sarebbero orientati nel modo desiderato modulando la posizione del campione all’interno del coagulo di Fibrina e la forma del coagulo stesso.

Qui forniamo un aggiornamento sui nostri attuali metodi di imaging basati sul coagulo di Fibrin e forniamo strumenti per l’analisi delle immagini basata sulla segmentazione e ci concentriamo sull’uso di questo metodo per studiare le divisioni dei neuroblasti nel cervello della mosca in via di sviluppo. Usiamo regolarmente il metodo del coagulo di Fibrin per seguire più campioni in coaguli diversi nello stesso piatto di coltura. Ciò consente di i) l’imaging di eventi subcellulari come il comportamento centrosoma o la localizzazione dell’mRNAdal vivo 18,19, ii) il monitoraggio del comportamento dei campioni durante il trattamento farmacologico di diversi genotipi sotto le stesse impostazioni di imaging utilizzando visite multi-punto microscopia20, iii) studio degli effetti dell’inibizione acutadegli enzimi 21 e iv) minimizzazione della deriva per studiare i cambiamenti nell’orientamento della divisione cellulare delle cellule all’interno del loro ambiente fisiologico su laser-ablazionemirata 22. Mentre gli effetti indesiderati di Trombina e Fibrinogeno e del coagulo di Fibrina devono essere testati empiricamente per ogni campione, questo metodo è in linea di principio adatto a immobilizzare qualsiasi tipo di campione che deve essere analizzato mediante imaging a cellule vive e in Drosophila è stato utilizzato con successo per studiare molteplici aspetti della biologia dei neuroblasti5,19,20, ma anche la dinamica delle proiezioni citosensoriali delle cellule staminali della linea germinalefemminile 23 e i cambiamenti di polarità sull’inibizione acuta dell’aPKC delle cellule follicolari delle camere uovo femminili drosophila 21.

L’imaging fluorescente time-lapse si traduce nella generazione di complessi set di dati 3D risolti nel tempo che richiedono metodi per estrarre queste informazioni quantitative. Qui descriviamo il nostro ulteriore sviluppo dimacro 24 basate su ImageJ che possono essere utilizzate per correggere la deriva negli iperstack e macro ImageJ su misura che consentono la quantificazione semi-automatizzata della fluorescenza multicanale presso la corteccia cellulare sviluppata per quantificare le proteine corticali nei neuroblasti dei cervelli larvali di Drosophila o dei singoli neuroblasti nella coltura cellulare primaria.

Protocol

1. Preparazione dei reagenti NOTA: Tutti i passaggi di questo protocollo, salvo diversa indicazione, vengono eseguiti a temperatura ambiente. Per preparare una soluzione di 1x PBS-BSA (0,1% w/v), sciogliere 1 mg di albumina sierice bovina (BSA) in 1 mL di PBS. Per preparare una soluzione stock di Trombina 1.000 unità·mL-1, sciogliere 1.000 unità di Trombina in 1 mL di PBS-BSA (0,1% w/v). Fare aliquote di 10 μL e conservare a -20 °C per un massimo di 4 mesi. Per preparare il terreno di coltura per il cervello di Drosophila, sciogliere 1 g di glucosio in 1 L del mezzo schneider in condizioni sterili. Filtrare e conservare a 4 °C per un massimo di 3 mesi. Per preparare la soluzione di Fibrinogeno, sciogliere 10 mg di Fibrinogeno in 1 mL di terreno di coltura per 20 min a temperatura ambiente o 5 min a 37 °C.NOTA: Se viene utilizzato un mezzo di coltura diverso da quello preparato al passaggio 1.2 e i coaguli di Fibrina si formano già in questo passaggio, il mezzo di coltura probabilmente contiene trombina attiva, che deve essere inattivata in anticipo. Una probabile fonte di trombina è il siero bovino fetale, che può essere inattivato riscaldando il siero a 56 °C per 30 min. Per preparare una soluzione di rivestimento di PBS-BSA (5% w/v), sciogliere 50 mg di albumina di siero bovino (BSA) in 1 mL di 1x PBS. Per l’esempio di reagente utilizzato nella fase 4, preparare una soluzione stock di 10 mM NAPP1 sciogliendo 1 mg di NAPP1 in 315 μL Dimetil solfossido. 2. Dissezione dei cervelli larvali di Drosophila NOTA: eseguire questo passaggio sotto un binocolo di dissezione. Utilizzare un pennello per trasferire le larve L3 in un piatto di vetro borosilicato a 9 po ‘contenente PBS. Mescolare per staccare la maggior parte del cibo di mosca dalle larve e trasferirlo in un altro mezzo di coltura ben contenente. Utilizzare le flesse (ad esempio, Dumont #55) per afferrare una larva attraverso tutto il suo diametro, al centro della sua lunghezza corporea (vedere figura 1A,B). Tenendo la larva, trasferirla in un altro pozzo della piastra borosilicata contenente 200 μL di mezzo di coltura fresco. Non rilasciare la larva. Per tagliare la larva a metà su tutto il suodiametro (Figura 1B),macinare l’area afferrata con il movimento laterale delle punte delle forcep(Figura 1A,pannello superiore) o far scorrere una punta di un’altra coppia di forcep tra le due punte del forcipe che tengono la larva(Figura 1A,pannello inferiore). Non tagliare la larva a metà tirando su una delle sue estremità, in quanto potrebbe danneggiare il cervello tirandolo attraverso i nervi che attraversano la lunghezza del corpo (linee rosse nella figura 1B). Utilizzare le flesse per trattenere la larva con la sua cuticola e un altro paio di forcep per smontare la cuticola senza tirare il cervello (Figura 1C). Ripetere fino a quando i nervi provenienti dal cervello sono visibili e gli organi che collegano il cervello alle parti della bocca sono accessibili come mostrato nella figura 1D. Usa le forcep per trattenere i nervi originati dal cervello. Con l’altra coppia di forcep, utilizzare una delle tecniche mostrate nella figura 1A per tagliare la connessione tra il cervello e le parti della bocca, separando il cervello dal resto della cuticola (Figura 1D). Usa le forcep per tenere il cervello vicino agli assoni che escono dal cordone nervoso ventrale. Strappare gli organi raffigurati in grigio nella Figura 1E allontanandoli delicatamente dal cervello.NOTA: Non tirare sui dischi immaginabili occhio/antenna (giallo scuro) per staccarli dal cervello. La connessione tra questi tessuti è troppo robusta per essere interrotta tirando senza danneggiare il cervello. Pur afferrando i nervi per tenere e orientare il cervello, afferrare la connessione tra i dischi immaginabili occhio/antenna (giallo scuro) e il cervello con l’altra coppia di forcep (Figura 1F). Utilizzare una delle tecniche mostrate nella figura 1A per tagliare questa connessione senza tirare il cervello. Verificare se il cervello è adeguatamente sgombrato da altri tessuti (Figura 1G) e non danneggiato(Figura 1H). Scartare il cervello se mostra segni di danno. Pipettare la soluzione di rivestimento con un P20 in uscita e fuori per rivestire la punta della pipetta. Pipettare il cervello con la punta rivestita insieme a 3 μL di mezzo(Figura 2A, sinistra) e pipettarlo in un altro pozzo contenente 200 μL di mezzo di coltura pulito. Ripetere i passaggi da 2,2 a 2,8 fino a sezionare abbastanza cervelli, occasionalmente sostituendo il mezzo di coltura del pozzo in cui vengono eseguite le dissezioni. Figura 1: Dissezione dei cervelli larvali di D. melanogaster.  (A) Tecnica di taglio senza trazione con forceps. Il campione (verde pallido) può essere tagliato essendo macinato tra le punte delle flesse (pannello superiore) o eseguendo una punta di una punta di coppia di forcep lungo le punte di una coppia di forcep che tengono il campione (pannello inferiore). (B–F) Passaggi per isolare il cervello larvale senza danneggiarlo (vedi testo). Rosso: cervello. Giallo scuro: dischi occhi/antenne. Testo blu: azioni da eseguire con le forcep corrispondenti. (G) Comparsa di un cervello isolato senza danni visibili. D è il lato dorsale e V è il lato ventrale sulla vista laterale. (H) Danni comuni causati dall’estrarre eccessivamente il cervello durante la dissezione. Pannello superiore: distacco del cordone nervoso ventrale. Pannello inferiore: deformazione di un lobo. Posteriore è sinistro e anteriore è proprio in tutti i pannelli. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 3. Immobilizzazione su coverlip con coaguli di fibrina NOTA: eseguire questo passaggio sotto un binocolo di dissezione. Utilizzare una pipetta P20 con punta rivestita come nel passaggio 2.8 per trasferire il cervello sezionato in un altro pozzo della piastra borosilicata contenente 200 μL di mezzo di coltura + Fibrinogeno (Figura 2A). Pipetta in un cervello insieme a 9 μL di mezzo di coltura + Fibrinogeno. Con l’estremità della punta che quasi tocca il fondo di vetro di copertura di un piatto di coltura cellulare da 35 mm, pipettare il contenuto (il mezzo di coltura e il cervello) facendo toccare il mezzo di coltura il coverslip immediatamente dopo essere usciti dalla punta della pipetta in modo che il cervello e il mezzo non scivolino ai lati della punta, potenzialmentedanneggiando il cervello (Figura 2A). Utilizzare una punta di una coppia di forcep o una coppia chiusa di forcep per spingere e posizionare delicatamente il cervello all’interno del mezzo di coltura + goccia di Fibrinogen.NOTA: Toccare la goccia con una coppia aperta di forcep può far tirare il mezzo di coltura dalla capillarità tra le punte delle forcep (Figura 2B). Se la parte ventrale del cervello deve essere immagine, indurre la coagulazione di Fibrinogen come segue per orientare correttamente il cervello all’interno del coagulo (Figura 2C). Spingi il cervello da un lato della goccia. Con una pipetta P1 dotata di punta P1, pipetta 1 μL di soluzione di trombina, toccare il bordo della goccia sul lato opposto del cervello con la punta della pipetta e pipettare la trombina(Figura 2C,primo disegno). Attendere 1-2 min affinché il Fibrinogen inizi a polimerizzare, con conseguente formazione di un precipitato torbido su un lato della goccia(Figura 2C, secondo disegno). Spingere delicatamente e “infilare” il cervello nel coagulo di Fibrina, assicurandosi che la parte da immaginere (ad esempio, il lato ventrale) sia il più vicino possibile al copripago senza deformare il cervello(Figura 2C,terzo disegno). Pipetta fuori 1 μL di soluzione di trombina vicino al lato del cervello non infilato nel coagulo di Fibrina. (Figura2C, quarto disegno). Attendere 2-3 minuti per impostare il secondo coagulo di Fibrin(Figura 2C, quinto disegno). Premere sui bordi del coagulo per farlo aderire più fortemente al coverslip, facendo attenzione a non deformare il cervello(Figura 2C,sesto e settimo di disegni). Se il cervello sembra essere troppo lontano dal coverslip, avvicinalo premendo il coagulo di Fibrina vicino al cervello. Se la parte dorsale del cervello deve essere immagine, indurre fibrina coagulazione come segue (Figura 2D). Posizionare il cervello al centro della goccia, parte dorsale rivolta verso il coverslip. Con una pipetta P10 dotata di punta sottile, pipetta 1 μL di soluzione di trombina, toccare il bordo della goccia sul lato opposto del cervello con la punta della pipetta e pipettare la trombina(Figura 2D,primo disegno). Attendere 2-3 minuti affinché il Fibrinogeno inizi a polimerizzare, con conseguente formazione di un precipitato torbido e fibroso (Figura 2D, secondo disegno). Premere sui bordi del coagulo per farlo aderire più fortemente al coverslip, facendo attenzione a non deformare il cervello(Figura 2D,terzo e quarto di disegni). Ripetere i passaggi da 3.1 a 3.5 se diversi campioni di coagulo devono essere immobilizzati sul coperchio. Con l’estremità della punta posizionata a circa 0,5 cm sopra il coagulo o i coaguli, pipettare delicatamente 390 μL di mezzo di coltura senza Fibrinogen dropwise sopra il coagulo(Figura 2B, piastra di Petri destra). Non aggiungere il mezzo di coltura ai lati del coagulo in quanto potrebbe staccarlo dal coverslip. Per lavare la trombina rimanente, utilizzare una pipetta per rimuovere 300 μl del mezzo di coltura e aggiungere 300 μl di mezzo di coltura pulito, assicurandosi che i coaguli rimangano completamente immersi. Ripetere due volte per lavare l’eccesso di trombina. Figura 2: Immobilizzazione di un cervello larvale di Drosophila usando coaguli di fibrina. (A) Utilizzando una punta pipetta rivestita in BSA, i cervelli vengono trasferiti dal mezzo di coltura (giallo) in un mezzo di coltura + soluzione di fibrinogeno (arancione), quindi pipettati sul coverslip (azzurro) di un piatto di coltura insieme a 3,5 μL di mezzo di coltura + Fibrinogen. La coagulazione del fibrinogeno è indotta dall’aggiunta di Trombina per immobilizzare il cervello in posizione dorsale o ventrale (vedi D ed E). I cervelli protetti nei coaguli vengono successivamente coperti in mezzo di coltura senza Fibrinogen e la trombina in eccesso viene rimossa aggiungendo e rimuovendo il mezzo di coltura tre volte. (B) La posizione del cervello all’interno della goccia di mezzo di coltura + Fibrinogeno (arancione) sul coverslip deve essere regolata solo spingendola delicatamente con la punta di una coppia chiusa di forcep, o solo una punta di spinta. Toccare la goccia con su una coppia aperta di forcep può far tirare il mezzo di coltura dalla capillarità tra le punte delle forcep. (C) Passi per il posizionamento del cervello larvale per l’imaging del lato ventrale (vedi testo). (D) Passi per il posizionamento del cervello larvale per l’imaging del lato dorsale (vedi testo). In (D) e (E), verde: Trombina. Arancione scuro: coagulo di fibrina. Blu pallido: coverslip. Frecce blu: bordi del coagulo da spingere contro il copripasta per stabilizzare il coagulo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 4. Aggiunta di reagenti durante l’imaging dal vivo Per evitare che i cambiamenti di temperatura causino cambiamenti di messa a fuoco, mantenere la soluzione con i reagenti da aggiungere al piatto di coltura alla stessa temperatura del piatto di coltura stesso per portarlo alla stessa temperatura prima di aggiungerlo. Se si utilizza una camera ambientale, lasciare la soluzione all’interno della camera. Rimuovere il coperchio del piatto della cultura senza spostare il piatto della cultura stesso. Per una rimozione più semplice, posizionare il coperchio del piatto da 35 mm capovolto sopra il piatto prima dell’imaging. Con una pipetta P1000, posizionare la punta della pipetta vicino alla superficie del mezzo di coltura all’interno del piatto di coltura e rilasciare delicatamente il volume adeguato di soluzione di reagente su di esso per raggiungere la concentrazione di reagente desiderata (ad esempio, 400 μL di una soluzione di 20 μM NAPP1 su 400 μL di mezzo di coltura per una concentrazione finale di 10 μM NAPP1) , senza generare forti flussi che potrebbero staccare i coaguli. Per omogeneizzare la soluzione all’interno del piatto di coltura, utilizzare una pipetta P200 per pipettare lentamente una piccola quantità della soluzione dentro e fuori cinque volte (ad esempio, 150 μL per un volume di 800 μL all’interno del piatto). Sostituire il coperchio sopra il piatto della coltura senza spostare il piatto di coltura stesso e riprendere l’imaging. 5. Lavaggio dei reagenti durante l’imaging dal vivo Prima del lavaggio, mantenere la soluzione di lavaggio alla stessa temperatura del piatto di coltura. Rimuovere il coperchio del piatto della cultura senza spostare il piatto della cultura stesso. Con una pipetta P200 o P1000, rimuovere lentamente qualche mezzo di coltura dal piatto di coltura senza esporre la parte superiore del coagulo (ad esempio, rimuovere 600 μL da 800 μL di mezzo di coltura all’interno del piatto). Per diluire il reagente, con una pipetta P1000, posizionare la punta della pipetta vicino alla superficie del mezzo di coltura all’interno del piatto di coltura e rilasciare lentamente la soluzione di lavaggio (ad esempio, aggiungere 1 mL di soluzione di lavaggio al mezzo di coltura di 200 μL lasciato all’interno del piatto per un fattore di diluizione di 6). Ripetere i passaggi 5.3 e 5.4 fino a quando il reagente non viene diluito come richiesto (ad esempio, altri tre cicli simili si tradurranno in un fattore di diluizione di 1296, riducendo la concentrazione iniziale di 10 μM NAPP1 a 7,7 nM). Sostituire il coperchio sopra il piatto della coltura senza spostare il piatto di coltura stesso e riprendere l’imaging. 6. Correzione dello xyz alla deriva su time-lapses tridimensionali e/o multicanale preparazione Scaricare e installare ImageJ24. Scarica i plugin TurboReg25 e MultiStackReg26 e posizionali all’interno della cartella plugin di ImageJ. Scaricare le macro MultiHyperStackReg (file di codifica supplementare 1) e AutoHyperStackReg ImageJ ( file di codifica supplementare2). Per installare una macro, inserire il file ijm nella cartella plugins di ImageJ oppure aggiungere il contenuto del file ijm al file ImageJ/macros/StartupMacros.txt. In ImageJ aprire un filmato time-lapse che include diverse sezioni e/o più canali (d’ora in poi denominati “hyperstack”, Figura 3A,4A). Se il time-lapse include solo una sezione e un canale, l’allineamento può essere eseguito direttamente utilizzando MultiStackReg. Correzione della deriva laterale con MultiHyperStackReg Decidere quale canale e/o sezione dell’hyperstack deve essere utilizzato come riferimento per l’allineamento. Per generare uno stack di riferimento a una sezione a un canale (d’ora in poi indicato come “stack di riferimento”), fare clic su Immagine | Duplica…, spunta la casella di controllo Iperstack duplicato, digita il numero di canale pertinente nei canali (c): (ad esempio, sostituisci 1-2 con 1) e/o il numero di canale pertinente in Slices (z): (ad esempio, sostituisci 1-15 con 8) e assicurati che Frames: (t) includa tutti i fotogrammi (ad esempio, 1-50) prima di fare clic su OK ( Figura3B). In alternativa al passaggio 6.2.1, se si preferisce una proiezione di più sezioni per lo stack di riferimento a una sezione a un canale, fare clic su Immagine | Stack | Progetto Z…, selezionare la prima e l’ultima sezione e il tipo di proiezione, assicurarsi che tutti i fotogrammi di tempo siano selezionati e fare clic su OK. Se il time-lapse ha più canali, eliminare i canali irrilevanti (Image | Stack | Delete Slice) dalla proiezione risultante o duplicare il canale di riferimento scelto (Image | Duplicato(Figura 3B). Facoltativamente, ritaglia lo stack di riferimento per utilizzare una sola parte come riferimento selezionando lo strumento rettangolo sulla barra degli strumenti, tracciando un rettangolo sull’area di interesse e facendo clic su Immagine | Ritaglia. Per avviare MultiStackReg, fare clic su Plugin | Registrazione | MultiStackReg. Nel menu a comparsa Stack 1:selezionare il nome dello stack a una sezione a un canale generato nei passaggi precedenti. Nel menu a comparsa Trasformazione:, selezionare Traduzione; selezionare la casella di controllo Salva file di trasformazione e ignorare tutti gli altri campi.NOTA: Altri tipi di trasformazione (cfr.25). Fare clic su OK. Selezionare un percorso e un nome per salvare il file di allineamento e fare clic su Salva. Nella finestra dello stack di riferimento attendere che i frame smettano di muoversi automaticamente, indicando che la registrazione è finita (Figura 3B). Controllare lo stack di riferimento per verificare se l’allineamento è soddisfacente. In caso diverso, ripetere i passaggi da 6.2.1 a 6.2.5 con una sezione, un canale e/o un ritaglio di riferimento diverso. Chiudere lo stack di riferimento. Selezionare la finestra hyperstack ed eseguire la macro MultiHyperStackReg. Selezionare il file di trasformazione creato nel passaggio 6.2.5 e fare clic su Apri. Attendere l’applicazione dell’allineamento a ogni canale e/o sezione dell’hyperstack, a quel punto si aprirà una nuova finestra con il suffisso “_aligned” (Figura 3C). Correzione della deriva dello stato attivo con MultiHyperStackReg Clicca su Immagine | Proprietà…, copiare il valore visualizzato in Larghezza pixel. Per risceccare ortogonalmente l’iperstack a un canale con una spaziatura di un pixel, fare clic su Immagine | Stack | Reslice [/]…, incollare il valore della larghezza dei pixel nel campo Output Spacing: numeric; selezionare In alto nel menu di scelta rapida Inizia da:, selezionare Evita interpolazione e fare clic su OK.NOTA: Nel caso in cui la memoria deve essere liberata su ImageJ, l’iperstack può essere chiuso dopo la reslice. Selezionare la nuova finestra generata dalla reslice (d’ora in poi denominata “hyperstack resliced”, Figura 4B). Se l’hyperstack resliced ha più canali, selezionare un canale di riferimento per eseguire l’allineamento ed eliminare gli altri canali selezionandoli nella barra di scorrimento del canale; clicca su Immagine | Stack | Elimina sezione, selezionare Canale dal menu di scelta rapida Elimina corrente e scegliere OK. Generare un hyperstack resliced a sezione singola (d’ora in poi indicato come “stack di riferimento resliced”), duplicando una singola sezione dell’iperstack resliced (vedere il passaggio 6.2.1) o proiettando diverse sezioni dell’hyperstack resliced (vedere il passaggio 6.2.2) (Figura 4C). Facoltativamente, ritagliare lo stack di riferimento resliced per utilizzare una sola parte come riferimento (vedere il passaggio 6.2.3). Eseguire la registrazione delle immagini nello stack di riferimento resliced con MutiStackReg (vedere i passaggi 6.2.4–6.2.6) (Figura 4C). Selezionare la finestra dell’hyperstack resliced ed eseguire la macro MultiHyperStackReg. Selezionare il file di trasformazione creato nel passaggio 6.3.5, fare clic su Apri e attendere che l’allineamento venga applicato a ogni canale e/o sezione dell’hyperstack, a quel punto si aprirà una nuova finestra con il suffisso “_aligned” (d’ora in poi denominata “stack di riferimento resliced”, Figura 4D). Chiudere l’iperstack originale resliced. Per convertire l’iperstack allineato resliced nella visualizzazione xy dell’hyperstack originale, fare clic su Stack | Reslice [/]…, selezionare Inizio da: menu di scelta rapida, selezionare Evita interpolazione e fare clic su OK. Una volta aperta una nuova finestra con l’iperstack allineato allo stato attivo finale (Figura 4E), chiudere l’iperstack allineato resliced. Per correggere automaticamente la deriva laterale e la deriva dello stato attivo, eseguire la macro AutoHyperStackReg. Selezionare il canale di riferimento, se applicabile, e se correggere la deriva laterale e/o di messa a fuoco. Fare clic su OK. Figura 3: Pipeline per la correzione della deriva laterale con MultiHyperstackReg. (A) Le derive laterale e di messa a fuoco possono essere osservate su un iperstack contenente diverse fette e punti di tempo. (B) Un singolo stack di riferimento a canale singolo viene generato dall’iperstack, mediante duplicazione o proiezione Z. Lo stack di riferimento è allineato dal plug-in MultiStackReg, generando un file di allineamento. (C) La macro MultiHyperstackReg viene utilizzata per applicare il file di allineamento all’hyperstack, generando un hyperstack allineato per il quale viene corretta la deriva laterale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: Pipeline per la correzione della deriva dello stato attivo con MultiHyperstackReg. (A) Le derive di messa a fuoco possono essere osservate su un iperstack contenente diverse fette e punti di tempo. (B) L’iperstack viene resliced ortogonalmente dall’alto, lungo ogni linea di pixel lungo l’asse Y, senza interpolazione. Ciò si traduce in un hyperstack resliced contenente le stesse informazioni dell’iperstack, con le sue coordinate y e z commutate. La deriva di messa a fuoco (in z) dell’iperstack originale si verifica come una deriva in y sull’iperstack resliced. (C) Un singolo stack di riferimento resliced a canale singolo viene generato dall’iperstack resliced, mediante duplicazione o proiezione Z. Lo stack di riferimento resliced è allineato dal plug-in MultiStackReg, generando un file di allineamento. (D) La macro MultiHyperstackReg viene utilizzata per applicare il file di allineamento all’iperstack resliced, ottenendo un hyperstack resliced allineato per il quale viene corretta la deriva dello stato attivo (in y). (E) Una seconda reslice ortogonale ripristina le coordinate originali dell’iperstack, che ora non presenta più una deriva di messa a fuoco (in z). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 7. Misurazione del segnale corticale con lattine rotanti Scaricare la macro Rotating Linescans ImageJ (File di codifica supplementare 3). Aprire un time-lapse in ImageJ. Posizionare la barra di scorrimento dei fotogrammi sul primo fotogramma e, nel caso in cui il time-lapse contenga più sezioni, posizionare la barra di scorrimento delle sezioni sulla sezione su cui verrà misurato il segnale. Modalità di tracciamento Selezionare lo strumento linea retta sulla barra degli strumenti. Tracciare una linea attraverso la zona corticale da misurare (Figura 5A), assicurandosi che la linea sia approssimativamente perpendicolare alla corteccia e che la linea sia abbastanza lunga da attraversare la corteccia in ogni punto successivo (Figura 5B, primo e secondo pannello). Fare doppio clic sull’icona dello strumento linea sulla barra degli strumenti per aprire la finestra Larghezza linea. Aumentare la larghezza della linea tutto il necessario mantenendo l’intersezione tra la linea e la corteccia una linea retta (Figura 5B, terzo pannello). Avviare la macro Rotating Linescans. Impostare l’intervallo di rotazione (Figura 5E) su un valore basso (circa 10°) se l’orientamento della zona corticale da misurare non cambia molto da un punto di tempo all’altro. Impostate il valore Misura intorno a 0 pixel per misurare solo il segnale sulla linea in cui viene rilevata l’intensità massima del segnale o su valori più alti per misurare anche il segnale intorno a questa linea.NOTA: il valore Misura intorno influenzerà la misurazione del segnale solo dopo il rilevamento della corteccia e non influenzerà il rilevamento stesso. Nel menu di scelta rapida Trova corteccia sul canale: selezionare il canale su cui verrà eseguito il rilevamento. Per visualizzare dove è stata rilevata la corteccia in ogni punto di tempo, mantenere la casella di controllo Posizione di visualizzazione… spuntata (consigliata). Mantieni la casella di controllo Recenter e riorienta… spuntata. Fare clic su OK. Una volta visualizzato lo stato Fatto, Risultati copiati negli Appunti nello stato della finestra ImageJ, scorrere il time-lapse per verificare se le posizioni della corteccia rilevate (sovrapposizione gialla) e l’area misurata (sovrapposizione ciano) sono soddisfacenti. In caso diverso, ripetere i passaggi da 7.3.1 a 7.3.4 con una posizione, una lunghezza o una larghezza della linea diversa e impostazioni diverse nella finestra delle opzioni Rotating Linescans. Incollare le misure in un software per fogli di calcolo.NOTA: le colonne corrispondono ai canali nell’ordine del loro aspetto nel time-lapse e le linee corrispondono ai fotogrammi. Modalità di non tracciamento Selezionare lo strumento linea retta sulla barra degli strumenti. Tracciare una linea (indicata in ciano, Figura 5A) attraverso la zona corticale da misurare, assicurandosi che la linea sia approssimativamente perpendicolare alla corteccia e che la linea sia abbastanza lunga da attraversare la corteccia in ogni punto del tempo(Figura 5C, primo e secondo pannello). Fare doppio clic sull’icona dello strumento linea sulla barra degli strumenti per aprire la finestra Larghezza linea. Aumentare la larghezza della linea quanto necessario mantenendo l’intersezione tra la linea e la corteccia una linea retta (Figura 5C, terzo pannello). Avviare la macro Rotating Linescans. Impostare l’intervallo di rotazione (Figura 5E) in base ai cambiamenti di orientamento della zona corticale da misurare per l’intero lapside. Impostate il valore Misura intorno a 0 pixel per misurare solo il segnale sulla linea in cui viene rilevata l’intensità massima del segnale o su valori più alti per misurare anche il segnale intorno a questa linea.NOTA: il valore Misura intorno influenzerà la misurazione del segnale solo dopo il rilevamento della corteccia e non influenzerà il rilevamento stesso. Nel menu di scelta rapida Trova corteccia sul canale: selezionare il canale su cui verrà eseguito il rilevamento. Per visualizzare dove è stata rilevata la corteccia in ogni punto di tempo, mantenere la casella di controllo Visualizza posizioni… spuntata (consigliata). Deselezionare la casella di controllo Recenter e Reorient… Fare clic su OK. Una volta fatto, i risultati copiati negli Appunti vengono visualizzati nello stato della finestra ImageJ, scorrere il time-lapse per verificare se le posizioni della corteccia rilevate (sovrapposizione gialla) e l’area misurata (sovrapposizione ciano) sono soddisfacenti. In caso diverso, ripetere i passaggi precedenti con una posizione, una lunghezza o una larghezza della linea diversa e impostazioni diverse nella finestra delle opzioni Linee rotanticani. Incollare le misure in un software per fogli di calcolo.NOTA: le colonne corrispondono ai canali nell’ordine del loro aspetto nel time-lapse e le linee corrispondono ai fotogrammi. Figura 5: Misurazione del segnale corticale con linee rotanticane. (A) Una linea (ciano) viene tracciata perpendicolarmente alla corteccia (nera) dove verrà misurato il segnale. Diverse tonalità di grigio mostrano la posizione della cella che cambia su tre punti di tempo (t1, t2, t3). (B) A sinistra: corretto posizionamento della linea in modalità di tracciamento. Al centro: posizionamento errato della linea in modalità di tracciamento in quanto non vi è sovrapposizione con la corteccia nel punto di tempo successivo. A destra: linea troppo larga con conseguente intersezione (linea arancione) tra la corteccia e la linea non è dritta. (C) A sinistra: corretto posizionamento della linea in modalità di non tracciamento. Al centro: posizionamento errato della linea in modalità non di tracciamento in quanto non vi è sovrapposizione con la corteccia in ogni punto di tempo. A destra: linea troppo larga con conseguente intersezione (linea arancione) tra la corteccia e la linea non è dritta. (D) Lunghezza e larghezza della linea di scansione. (E) Le linee possono essere eseguite all’interno di un intervallo di orientamenti attorno all’orientamento originale mostrato in (D) definito dal parametro “intervallo di rotazione”, ad un intervallo definito dal parametro “passo di rotazione”. (F) Orientamento non ottimale della linea di scansione rispetto alla corteccia, con conseguente segnale basso misurato lungo la linea. (G) L’orientamento ottimale della linea è definito come quello risultante dal picco più alto di intensità del segnale misurato lungo la linea. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Representative Results

Immobilizzazione dei tessuti Drosophila con coaguli di Fibrina e scambio di mezzi di coltura durante l’imaging dal vivo.Dopo essere stati sezionati seguendo la procedura presentata nella fase 2 (Figura 1) e immobilizzati nei coaguli di Fibrina sullo stesso coverslip seguendo la procedura presentata al passaggio 3 (Figura 2), i cervelli larvali che esprimono Bazooka taggato dalla GFP (Baz::GFP), l’ortologo a mosca della proteina polarità Par-3, sono stati imageizzati per 30 minuti in imaging confocale multi-posizione time-lapse. Baz::GFP è combinato con apkcas4, un allele che consente l’inibizione acuta della proteina atipica chinasi C (aPKC) attraverso l’aggiunta del piccolo atp analogico 1-NAPP120. 1-NAPP1 è stato quindi aggiunto al mezzo di coltura seguendo la procedura presentata nella fase 4 e l’imaging dal vivo è stato ripreso per 2,5 ore. I cervelli di controllo che trasportavano una versione di tipo selvaggio dell’aPKC della chinasi non hanno reagito all’analogo ATP, mentre i cervelli che trasportavano inoltre una mutazione analoga sensibile dell’aPKC (apkcas4) hanno mostrato una contrazione del neuroepitelio e dei gruppi luminosi di Baz nei neuroblasti e nella loro progenie(Figura 6, Video 1). I neuroblasti continuano a dividersi per tutto il time-lapse, indicando che il tessuto rimane sano, e il cervello mostra poca deriva nonostante il cambiamento del mezzo di coltura, indicando che sono ben immobilizzati. Allo stesso modo, dopo essere stati sezionati seguendo la procedura presentata in27, gli ovariole che esprimono Baz::GFP sono stati immobilizzati nei coaguli di Fibrina sullo stesso coverslip e con immagini per 8 minuti, dopo di che l’applicazione di 1-NAPP1 ha indotto la contrazione di cellule follicolari mutanti apkcas4 ma non di controlli(Figura 7, Video 2). Correzione della deriva laterale e dello stato attivo mediante MultiHyperstackReg.Un hyperstack che mostra sia la deriva laterale che quella di messa a fuoco(Video 3,pannello sinistro) è stato prima corretto per la deriva laterale (passaggio 6.2, Figura 3, Video 3, pannello centrale), quindi la deriva di messa a fuoco (passaggio 6.3, Figura 4, Video 3, pannello destro) utilizzando il plugin MultiStackReg e la macro MultiHyperstackReg, con conseguente sostanziale riduzione dei movimenti osservati nell’iperstack originale. Misurazione corticale del segnale utilizzando lattine di linea rotantiUn neuroblasto che esprime Baz::GFP (verde) e la proteina transmembrana CD4 taggata con una proteina fluorescente infrarossa (CD4::mIFP, rosso) è stato immaginato durante una mitosi. Il segnale CD4::mIFP è stato utilizzato come riferimento per rilevare la corteccia in varie parti del neuroblasto con lattine di linee (passo 7, Figura 5, Figura 8A-C) e il segnale Baz::GFP è stato misurato nelle posizioni rilevate Figura 8D). Durante la loro divisione, i neuroblasti si polarizzarono transitoriamente stabilendo domini corticali distinti e opposti: il polo apicale e il polo basale. Baz definisce il polo apicale e, coerentemente, il segnale Baz::GFP aumentato al polo apicale del neuroblasto e diminuito al polo basale durante la divisione (Figura 8C,D). La posizione della corteccia è stata tracciata in modo soddisfacente per tutto il time-lapse(Figura 8C, Video 4). Le linee e i genotipi drosophila sono referenziati nella tabella supplementare 1-2. Figura 6: Applicazione di un analogo ATP sul cervello larvale immobilizzato durante l’imaging dal vivo. (A) Imaging dal vivo di due cervelli larvali che esprimono Baz::GFP immobilizzato sullo stesso coverslip. Il mezzo di coltura viene cambiato in una concentrazione di 10 μM dell’ATP analogico 1-NAPP1 a 0 min. I cervelli di controllo non reagiscono visibilmente all’analogo ATP, mentre i cervelli che portano una mutazione sensibile analogica diaPKC ( aPKCAS4) mostrano una contrazione del neuroepitelio (punte di freccia) e dei gruppi luminosi di Baz nei neuroblasti e nella loro progenie. Proiezione di intensità massima di 33 fette per una profondità di 23 μM. Barra di scala: 20 μM. (B) Ingrandimento del neuroepitelio. Barra di scala: 10 μM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 7: Applicazione di un analogo ATP sulle camere delle uova immobilizzate durante l’imaging dal vivo. Imaging dal vivo di due ovariole che esprimono Baz::GFP immobilizzato sullo stesso coverslip. Il mezzo di coltura viene cambiato in una concentrazione di 10 μM dell’ATP analogico 1-NAPP1 a 0 min. Le camere delle uova di controllo non reagiscono visibilmente all’analogo ATP, mentre le camere delle uova che portano una mutazione sensibile analogica diaPKC (aPKCAS4) mostrano una contrazione dell’epitelio (punte di freccia) che alla fine porta all’apparente rottura delle giunzioni aderenti. Proiezione di intensità massima di 33 fette per una profondità di 27 μM. Barra di scala: 20 μM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 8: Misurazione del segnale corticale mediante lacanne rotanti. (A) Neuroblasto D. melanogaster vivo che esprime Baz::GFP (verde) e CD4::mIFP (rosso). Linee ciano: linee di scansione iniziali tracciate perpendicolarmente a varie zone corticali da misurare. Barra di scala: 5 μM. (B) Identificazione della corteccia (linea blu scuro) usando lattine di linee corticali e CD4::mIFP (rosso) come canale di riferimento. Linea ciano: area definita dal parametro “Misura intorno” (qui, 2 pixel), dove il segnale viene misurato dopo il rilevamento della corteccia. Barra di scala: 2 μm. (C) Ciano: aree corticali identificate durante una divisione di neuroblasti dal metodo delle reti a linee rotanti dalle linee di scansione iniziali visualizzate in (A), usando CD4::mIFP (rosso) come canale di riferimento. Barra di scala: 5 μM. Freccia: polo apicale. Punta di freccia: palo basale. (D) Misurazione dell’intensità del segnale Baz::GFP nel tempo nelle due zone corrispondenti identificate dalle lattine rotanti visualizzate in (C). Durante la mitosi, Baz::GFP si arricchisce transitoriamente al polo apicale del neuroblasto e si esaurisce dal polo basale opposto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Video 1: Applicazione dello scambio di media sul cervello larvale immobilizzato durante l’imaging dal vivo per aggiungere un inibitore, presentato nella Figura 6, barra di scala: 20 μm. Fare clic qui per scaricare questo video. Video 2: Applicazione dello scambio di supporti su camere di uova immobilizzate durante l’imaging dal vivo per aggiungere un inibitore, presentato nella figura 7, barra di scala: 20 μm. Fare clic qui per scaricare questo video. Video 3: Correzione della deriva laterale e di messa a fuoco con MultiHyperStackReg. Imaging dal vivo di un neuroblasto che esprime la sonda di membrana PH::GFP. Xy: piano focale singolo. Xz: reslice ortogonale. A sinistra: prima della correzione della deriva. Al centro: dopo la correzione della deriva laterale. A destra: dopo aver corretto la deriva laterale e di messa a fuoco, barra di scala: 10 μm. Fare clic qui per scaricare questo video. Video 4: Rilevamento della corteccia utilizzando lattine rotanti, presentato nella figura 8, barra di scala: 5 μm. Fare clic qui per scaricare questo video. Tabella supplementare 1: Genotipi di tessuti Drosophila con immagini. Clicca qui per scaricare questa tabella. Tabella supplementare 2: Origine dei transgeni utilizzati. Clicca qui per scaricare questa tabella. File di codifica supplementare 1: Origine dei transgeni utilizzati. Clicca qui per scaricare questo file. File di codifica supplementare 2: Origine dei transgeni utilizzati. Clicca qui per scaricare questo file. File di codifica supplementare 3: Origine dei transgeni utilizzati. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

L’imaging dal vivo di cervelli larvali D. melanogaster a montaggio intero offre l’opportunità di osservare divisioni asimmetriche delle cellule staminali neurali in condizioni vicine a un contesto fisiologico. La prima parte del nostro protocollo introduce il nostro approccio sulla dissezione del cervello larvale. Come già affermato13, un aspetto critico della preparazione è evitare di danneggiare il cervello. L’aspetto più impegnativo di questo è separare il cervello dai dischi immaginari vicini senza tirare eccessivamente sul cervello. Il nostro approccio al “taglio senza trazione” è quello di eseguire un movimento di rettifica con le punte di una coppia di pini, o di far scorrere una punta di pin pin lungo altre due punte di pin che tengono la connessione tra i tessuti (Figura 1A) mentre Lerit et al. Consigliamo allo sperimentatore di provare tutti gli approcci e di adottare quello più adatto a se stesso. Suggeriamo inoltre di utilizzare punte di pipette rivestite in BSA o FCS piuttosto che strumenti di dissezione per trasferire cervelli isolati. Il rivestimento impedisce ai tessuti di attaccarsi alla plastica e consente il trasferimento sicuro dei tessuti mantenendoli sempre completamente immersi, senza sottometterli a una possibile deformazione transitoria mentre si attaccano allo strumento di dissezione durante il trasferimento. Le punte rivestite hanno altri vantaggi per consentire il trasferimento di più cervelli contemporaneamente, il che è particolarmente utile quando è fondamentale controllare il tempo di residenza dei campioni all’interno di un particolare mezzo; sono adatti per il trasferimento di altri tessuti, anche fragili come, ad esempio, corpi grassi; possono ospitare una vasta gamma di diverse dimensioni del campione utilizzando punte più grandi o tagliando l’estremità della punta.

Successivamente, questo protocollo descrive l’uso della coagulazione di Fibrinogen per immobilizzare il cervello larvale sul coverslip di un piatto di coltura. Un cervello è orientato all’interno di una goccia di mezzo di coltura + Fibrinogeno, dopo di che la coagulazione è indotta dall’aggiunta di Trombina. La formazione di fibrina è graduale, fornendo un’area di tempo durante la quale l’orientamento del campione può essere messo a punto, se necessario (Figura 2C). Se è necessaria una leggera compressione del campione – cosa che sconsigliamo nel caso di cervelli larvali – può anche essere regolata finemente premendo il coagulo più o meno vicino al campione durante i passaggi 3.4.4 e 3.5.2. Il principale vantaggio di questa coagulazione di Fibrinogen rispetto al protocollo descritto in Lerit et al., in cui i cervelli sono montati tra una membrana permeabile al gas e un coverslip, è la capacità di sostituire il mezzo di coltura durante l’imaging dal vivo. Un possibile vantaggio dell’uso di una membrana permeabile al gas rispetto al nostro protocollo potrebbe essere che fornisce un’ossigenazione ottimale dei campioni, che potrebbe essere più limitata con il nostro approccio poiché i cervelli sono separati dall’aria dal coagulo e da qualche mezzo. Per questo motivo, anche se non abbiamo valutato l’effetto della quantità di mezzo di coltura all’interno del piatto di coltura, suggeriamo di limitare la quantità di mezzo di coltura sopra i coaguli mantenendo i coaguli completamente immersi.

Poiché la manipolazione dei coaguli può essere sperimentalmente difficile e dispendiosa in termini di tempo, si consiglia allo sperimentatore di praticare prima la manipolazione dei coaguli senza campioni. Modulare il volume della goccia di mezzo di coltura + Fibrinogeno sul coverslip, la concentrazione di Fibrinogen o il volume e la concentrazione di Trombina potrebbero contribuire a facilitare la preparazione e potrebbero essere importanti quando si adatta il protocollo ad altri tipi di tessuti. Con abbastanza esperienza nella manipolazione dei coaguli, diversi cervelli possono essere immobilizzati in un unico coagulo se necessario, anche se complica la messa a punto dell’orientamento. Diversi coaguli possono essere formati sul coverslip, consentendo, ad esempio, di immagini campioni di diversi genotipi. È anche possibile esporre coaguli diversi sullo stesso copriscicolo a diversi mezzi di coltura, anche se occorre fare attenzione a non mescolare mai le gocce di mezzo di coltura che coprono i diversi coaguli. Una volta che i cervelli larvali sono immobilizzati e pronti per l’imaging dal vivo, si consiglia di seguire le raccomandazioni di Lerit etal. Aggiungiamo solo a queste raccomandazioni non solo per mantenere il cervello a 25 °C durante l’imaging dal vivo con un incubatore di stadio, ma anche per preriscaldare questa fase per almeno 30 minuti prima dell’inizio dell’imaging. Nelle nostre mani, non farlo sistematicamente si traduce in una forte deriva di attenzione.

Può essere vantaggioso in alcuni contesti essere in grado di eseguire microscopia correlata e fissare e immunosomodiare un campione dopo l’imaging dal vivo. Tuttavia, una limitazione dell’uso di coaguli di Fibrin è che è quasi impossibile isolare meccanicamente un cervello da un coagulo senza danneggiarlo. Un possibile modo per superare questa limitazione potrebbe essere quello di sviluppare metodi per degradare i coaguli di fibrina con plasmina o per indurre lo smontaggio del coagulo mediante l’aggiunta di un peptide che imita le manopole permettendo la polimerizzazione della Fibrina28. In genere usiamo coaguli di fibrina su campioni che vanno da singole cellule a tessuti lunghi 200 μM, ma potremmo anche immobilizzare con successo nei coaguli e nel cervello dell’immagine da bombi adulti larghi oltre 3 mm. Resta da determinare il limite superiore della dimensione del campione che può essere immobilizzato nei coaguli. Allo stesso modo, sebbene di solito immaginiamo campioni immobilizzati per 4-5 ore, abbiamo immaginato con successo i neuroblasti nella coltura primaria per un massimo di 3 giorni, indicando che il coagulo almeno non interferisce con la vitalità a lungo termine. Al contrario, i coaguli possono facilitare la sostituzione regolare del mezzo, un requisito per l’imaging a lungo termine, senza la necessità di dispositivi come pompe peristaltiche a questo scopo. Anche se non abbiamo misurato i parametri di permeabilità dei coaguli di fibrina, la natura fibrosa simile a un gel dei coaguli sembra essere penetrabile da molecole permeabili cellulari. Abbiamo scoperto che Latrunculin A, Colcemid o 1-NAPP1, ligandi a tag HALO e altri coloranti standard utilizzati in biologia cellulare raggiungono le cellule nel coagulo di fibrina senza problemi e finora non hanno incontrato molecole che sarebbero state trattenute dal coagulo, che, tuttavia, è una possibilità che deve essere testata empiricamente.

In conclusione, l’utilizzo di coaguli di Fibrin fornisce un modo affidabile e relativamente facile da implementare per immobilizzare i tessuti viventi per l’imaging dal vivo. Al di là della sua utilità nel limitare la deriva laterale, la capacità di cambiare il mezzo di coltura durante l’imaging vivo si è dimostrata inestimabile per il nostro approccio di genetica chimica allo studio della divisione cellulare asimmetrica dei neuroblasti D. melanogaster 21. Prevediamo che questa tecnica sarà utile per gli studi su una vasta gamma di tessuti diversi, in particolare se coinvolgono genetica chimica o, ad esempio, autoeticazione proteica29.

La nostra macro MultiHyperStackReg si basa sul plug-in TurboReg ImageJ, che allinea frame o sezioni successive di uno stack, e sul plug-in MultiStackReg ImageJ, che consente di applicare le trasformazioni ad altri stack. MultiHyperStackReg consente semplicemente di applicare queste trasformazioni agli iperstack (stack con almeno quattro dimensioni). Poiché l’uso di MultiHyperStackReg, come lo descriviamo, richiede molte azioni e può richiedere molto tempo, abbiamo anche scritto la macro AutoHyperStackReg, che esegue automaticamente tutti i passaggi descritti nei passaggi 6.2 e 6.3. Tuttavia, contrariamente a MultiHyperStackReg, AutoHyperStackReg attualmente non ha la possibilità di calcolare l’allineamento di uno stack in base a una sottoregione di questo stack, un’opzione che abbiamo trovato a volte è cruciale per un allineamento soddisfacente. Un’altra limitazione di AutoHyperStackReg è che il suo utilizzo è limitato alle traduzioni e non alle altre trasformazioni proposte da TurboReg e MultiStackReg, mentre MultiHyperStackReg può essere applicato a un hyperstack qualsiasi tipo di trasformazione se l’utente ne ha bisogno. Le versioni future implementeranno queste funzioni e saranno disponibili su GitHub30. Infine, la nostra macro di linee rotanti può fornire un modo semplice per misurare rapidamente i segnali corticali in time lapses, anche se la corteccia cambia la sua posizione o orientamento nel tempo. Se la sua modalità di tracciamento o la sua modalità di non tracciamento è più adatta per l’analisi dipende dalla qualità e dalla coerenza del segnale corticale. La modalità di tracciamento è più facile da usare in quanto l’utente non ha bisogno di considerare dove sarà la corteccia per ogni punto di tempo e può adattarsi a grandi cambiamenti di posizione e orientamento nel tempo. Tuttavia, è adatto solo se il segnale corticale rimane abbastanza forte per il rilevamento durante l’intero filmato: la mancata rilevazione di nient’altro che la corteccia (ad esempio, un compartimento citoplasmatico luminoso vicino alla corteccia) può compromettere il rilevamento per ogni successivo punto di tempo (ad esempio, il compartimento citoplasmatico si allontana dalla corteccia e le linee corticalican lo seguono per il resto del tempo decadrà). La modalità di non tracciamento non ha questa insidia in quanto il rilevamento è limitato alla linea originariamente disegnata dall’utente (ad esempio, un compartimento citoplasmatico luminoso può causare il fallimento del rilevamento per alcuni punti di tempo, ma man mano che il compartimento citoplasmatico si allontana dalla zona di rilevamento, riprende il corretto rilevamento della corteccia), ma non si comporta bene se la posizione o l’orientamento della corteccia cambia molto nel tempo. La prossima funzione (che sarà disponibile su GitHub30) da sviluppare per la modalità di tracciamento sarà la possibilità di analizzare solo i punti di tempo specificati e di definire un punto di tempo di riferimento (anziché il primo punto di tempo) prima del quale e dopo di che verrà eseguito il rilevamento, che consentirà all’utente di evitare almeno punti di tempo problematici.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Il lavoro nel laboratorio Januschke è supportato da sovvenzioni wellcome trust 100031/Z/12/A e 1000032/Z/12/A. La struttura di imaging tissutale è supportata dalla sovvenzione WT101468 di Wellcome.

Materials

Albumin bovine serum, BSA Merck 5470
D-(+)-Glucose Sigma G7021
Dimethyl sulfoxide Sigma D2650
Dumont #55 Forceps Fine Science Tools 11255-20
Fetal Bovie Serum, suitable for cell culture Sigma F7524
Fibrinogen from human plasma Sigma F3879
FluoroDish Cell Culture Dish – 35mm, 23 mm well World Precision Instruments FD35-100
PP1 Analog (1NA-PP1) Merck Millipore 529579
Pyrex spot plate with nine depressions Sigma CLS722085-18EA
Schneider's Insect Medium Sigma S0146
Thrombin from bovine plasma Merck T4648
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Januschke, J., Loyer, N. Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging. J. Vis. Exp. (166), e61954, doi:10.3791/61954 (2020).
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