Directe medicijnafgifte aan de nier via de nierslagader
Summary
Dit manuscript beschrijft een methode voor gerichte levering aan een enkele nier via een katheter die in de infrarenale abdominale aorta in de muis wordt geplaatst.
Abstract
Er is behoefte aan gerichte injecties om een verhoogde en specifieke nierblootstelling mogelijk te maken voor een efficiënte evaluatie van geneesmiddeldoelstellingen op het gebied van nieronderzoek. Accumulatie van geneesmiddelen in bepaalde organen kan leiden tot nadelige en ongewenste effecten, afhankelijk van de aard van het injectaat. Om spill-over en/of accumulatie in andere weefsels tot een minimum te beperken, leidt de hierin beschreven methode de formulering in de bloedbaan van de nierslagader door een katheter in de infra-renale aorta in te brengen, net onder waar deze zich in de nierslagader vertakt, wat resulteert in de nier als eerste bereikt orgaan en distributie van formulering door de nier.
Dit manuscript geeft een gedetailleerde beschrijving van de methode, evenals de uitdagingen en moeilijkheden. Het begeleidt de experimenteerder om bekwaam te worden met dit type microchirurgie dat nauwkeurigheid vereist onder steriele omstandigheden. Snelheid is cruciaal voor het minimaliseren van de ischemie en het oefenen van de procedure zal de kans op succesvolle injecties zonder nadelige effecten vergroten. Door de tijd tussen injectie en reperfusie en het geïnjecteerde volume te moduleren, wordt het risico op overloop naar andere organen beperkt.
Merk op dat deze techniek geschikt is voor enkelvoudige doseringsstrategieën.
Introduction
In het preklinische onderzoeksveld binnen de farmaceutische industrie maakt model- en methodeontwikkeling deel uit van het dagelijks werk. Er is een toenemende belangstelling voor het vermogen om geneesmiddelen naar specifieke organen te leiden, of zelfs compartimenten van een orgaan te scheiden, zonder grote overloop / beknelling, via de bloedbaan, naar andere weefsels. Dit om een verhoogde en specifieke blootstelling mogelijk te maken voor een efficiënte evaluatie van geneesmiddeldoelstellingen in modellen van verschillende ziektegebieden 1,2,3,4.
Een veel voorkomende manier om stoffen af te leveren is via systemische routes (bijvoorbeeld via de staartader), omdat het minder invasief is dan de methode die in dit manuscript wordt beschreven. Systemische toediening verhoogt echter het risico op een verhoogd metabolisme of accumulatie van de verbinding in andere weefsels dan het beoogde doelorgaan, bij het passeren van filterorganen zoals de long, de lever en de milt 2,3,5. Afgezien van het niet bereiken van het voorbestemde weefsel, kan dit mogelijk leiden tot nadelige en/of ongewenste effecten, afhankelijk van de aard van het injectaat. Slechts zeer kleine moleculen passeren de haarvaten van filterorganen en daarom is gerichte levering vooral belangrijk bij het werken met grotere moleculen 6.
Om spillover en/of accumulatie van geïnjecteerde formulering, in andere weefsels, te minimaliseren, leidt de hierin beschreven methode de formulering in de bloedbaan van de nierslagader via een katheter die in de abdominale aorta wordt ingebracht net onder waar deze zich vertakt in de nierslagader, wat resulteert in de nier als eerste bereikte orgaan. Een ander voordeel van deze geleide toediening is dat een lagere dosis/volume kan worden gebruikt om hetzelfde blootstellingsniveau te bereiken als bereikt via systemische toediening 3.
Andere toedieningswegen zijn onderzocht, bijvoorbeeld injecties via een katheter rechtstreeks in de nierslagader. In onze handen bleek dit een hoger risico te vormen op het niet herstellen van de bloedsomloop naar de nier. De zeer kleine diameter van de nierslagader (ongeveer 0,35-0,55 mm in diameter) maakt de incisie relatief groot en vormt een risico op obstructie en/of embolie bij het sluiten van het ingangsgat. Volgens onze ervaring ischemische schade aan de nier vaak opgetreden bij het gebruik van deze methode, en daarom ontwikkelden we deze nieuwe manier om de nier met succes te richten door stoffen te injecteren door incisie van de grotere aorta om de nier te richten.
Er worden vergelijkbare technieken ontwikkeld bij ratten die ook de uitdagingen en het risico van stenose/trombose manifesteren door rechtstreeks met injecties in de nierslagader te werken 5. Dit ondersteunt onze bevindingen omdat de vaten in muizen nog kleiner zijn.
Dit manuscript en deze video beschrijven in detail hoe injecties in de nierslagader bij muizen kunnen worden geleid via een katheter die in de infrarenale aorta is ingebracht, evenals begeleiding bij het overwinnen van veelvoorkomende problemen in de procedure, om op de veiligste manier te werken en daardoor de reproduceerbaarheid te vergroten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze methode is succesvol geweest in het leveren van formuleringen aan de nier zonder nierschade te veroorzaken. Het kan worden gebruikt voor de levering van elke vorm van formuleringen (bijv. kleine moleculen, stam / voorlopercellen of microvesicles). De methode kan worden toegepast bij gezonde dieren of bij nierziektemodellen.
In figuur 2 en figuur 3wordt de histologie gepresenteerd. Figuur 2 toont histologie 180 minuten na perfusie, terwijl figuur 3 de geschiedenis 7 dagen na infusie laat zien. De reden hiervoor is dat de experimenten met de nierslagader slechts 180 minuten lang waren. Om er zeker van te zijn dat we geen chronische schade hadden met deze nieuwe methode, wachtten we doelbewust 7 dagen om ze te evalueren. Het n-getal is klein, maar dit is slechts een voorbeeld.
Merk op dat deze nieuw ontwikkelde methode van aortatoediening om de nier te targeten een invasieve methode is met een relatief lage doorvoer en alleen geschikt is voor enkelvoudige doseringsstrategieën. Herhaalde toediening is met deze methode niet mogelijk.
Bij kleine aanpassingen van de ligatuurplaatsingen kan deze methode mogelijk worden gebruikt om beide nieren simultaniously5,7te infuseren . Met het verhoogde risico op overloop door aortavertakking hebben we besloten om de afsluitende ligatuur zo dicht mogelijk bij de nier te houden, waardoor de injectie alleen naar de linkernier leidt. Het kan ook worden gebruikt in aanvulling op andere modellen of technieken zoals uninephrectomy of misschien zelfs gelijktijdige renale ischemie reperfusie letsel (IRI). Naar onze mening is het doen van de injectie slechts 24 uur na de IRI3-operatie te hard en zal het herstel van het dier aanzienlijk beïnvloeden.
Bij het gebruik van nieuwe muizenstammen moet men altijd een proefexperiment uitvoeren op sommige dieren uit die stam om ervoor te zorgen dat de methode niet op de een of andere manier hoeft te worden aangepast. Bij sommige stammen kan de vaatvertakking van de aorta bijvoorbeeld een beetje anders worden gepositioneerd. De positie van de ligaturen kan enigszins veranderen om ervoor te zorgen dat de formulering op de juiste locatie terechtkomt.
Uitdroging
Het openen van de buikholte vormt een groot risico op uitdroging. Het is daarom noodzakelijk om vloeistoffen (ongeveer 37 °C) toe te voegen, zowel tijdens als na de operatie om een goede basis voor herstel na de operatie te garanderen. We geven meestal 1 ml/muizen s.c. na de operatie.
Ischemie
Langdurige operatietijd of als het niet bereiken van volledige recirculatie zal resulteren in ischemie. Het is belangrijk om de werkelijke ischemietijd vast te leggen en ervoor te zorgen dat de bloedsomloop naar de nier (en achterpoten) wordt hersteld. Constante training en vernieuwing van vaardigheden zijn, zoals altijd, belangrijk. Het sneller uitvoeren van de procedure vermindert de tijd dat de nier wordt blootgesteld aan ischemie. Het is aangetoond dat het houden van de ischemietijd (ligatie van aorta) tot ongeveer 5 minuten (maximaal 10 minuten) de nier niet schaadt.
Spillover
Gezien het risico van overloop naar andere organen wanneer de geïnjecteerde formulering opnieuw in de circulatie komt via de nierader, moet het geïnjecteerde volume tot een minimum worden beperkt. We raden een maximumvolume van 50 μL aan. De dosering is ook door anderen als een kritieke factor voor efficiëntie3.
Bijwerkingen (trombose en verlamming)
In eerste instantie ondervonden we bij het opzetten van het model niet-consistente problemen met verlamming in de achterbenen. Na de relevante dosis anticoagulantia (10 IE heparine in de staartader) preoperatief, was dit nadelige effect significant verminderd. Na het raadplegen van experts in het veld, begonnen we ook nog voorzichtiger te zijn in het werken met atraumatische chirurgie, wat betekent dat we geen weefsels knijpen en zo min mogelijk gebieden aanraken. Deze acties samen verminderden de frequentie van verlamming van ongeveer 50% tot vrijwel geen.
In eerste instantie hebben we tijdens de ontwikkeling van de methode antistollingsmiddelweefsel op de nierslagader aangebracht om het incisiegat te sluiten. Dit was niet mogelijk bij het doen van injecties in de aorta omdat de druk zoveel hoger is in de aorta. Anticoagulantia verhogen ook het risico op trombose als het in het vatlumen terechtkomt.
Zorg ervoor dat adventitia niet wordt blootgesteld in het lumen van de aorta bij het hechten, omdat adventitia zeer trombogeen is. Vermijd ook omkerende wondranden of vernauwing van de aorta door te hechten aan de dij.
We hebben nu een gevestigde methode om formuleringen rechtstreeks aan de nier te leveren.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Met dank aan René Remie van RRSSC voor het helpen finetunen van de techniek en Instech labs voor samenwerking bij het produceren van een speciaal ontworpen katheter. Een grote dank ook aan alle collega’s van AstraZeneca R&D voor productieve discussies met tips en trucs en Xerox voor het voltooien van de video met geluid.
Materials
| Blunt hook 5mm 8/pack | Cooper surgical | 3316-8G | |
| ETHILON Nylon Suture 11/0 | Ethicon | W2881 | For vessel |
| Microsurgery forceps curved | Karo Pharma | FRC-15 RM-8 | |
| Microsurgery forceps straight | Karo Pharma | FRS-15 RM-8 | |
| Mouse renal artery cannula, 3mm 32ga stainless steel, 10cm 2Fr PU, fits 25ga | Instech | C07SS-MRA1813 | |
| Vicryl, 6-0, BV-1 needle | Angthos | W9575 | For abdominal cavity |
References
- Porvasnik, S. L., Mah, C., Polyak, S. Targeting Murine Small Bowel and Colon Through Selective Superior Mesenteric Artery Injection. Microsurgery. 30 (6), 487-493 (2010).
- Rocca, C. J., Ur, S. N., Harrison, F., Cherqui, S. rAAV9 combined with renal vein injection is optimal for kidney-targeted gene delivery: conclusion of a comparative study. Gene Therapy. 21 (6), 618-628 (2014).
- Cai, J., et al. Maximum efficacy of mesenchymal stem cells in rat model of renal ischemia-reperfusion injury: renal artery administration with optimal numbers. PLoS One. 9 (3), 92347 (2014).
- Leda, A. R., Dygert, L., Bertrand, L., Toborek, M. Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery. Journal of Visualized Experiments. (119), e54804 (2017).
- Monteiro Carvalho Mori da Cunha, M. G., et al. A Surgical Technique for Homogenous Renal Distribution of Substances in Rats. European Surgical Research. 51, 58-65 (2013).
- De Jong, W. H., et al. Particle size-dependent organ distribution of gold nanoparticles after intravenous administration. Biomaterials. 29 (12), 1912-1919 (2008).
- Ullah, M., et al. A Novel Approach to Deliver Therapeutic Extracellular Vesicles Directly into the Mouse Kidney via Its Arterial Blood Supply. Cells. 9 (4), 937 (2020).
