测量 果蝇 拉瓦的机械结节的改进的检测和工具

1. 机械探头结构 使用小型线切割机（图 1C），将每个尼他诺灯丝（图 1B）切成指定长度（图1M-N）垂直于其长轴。灯丝有三种不同的预设直径（图1B）。注：此处指定的长度是实现所指示的近似压力的指南，使用类似的协议来构建安装。最终，无论灯丝切割的长度和安装孔的深度如何，灯丝都必须在平衡上测量/校准，以获得确切的力/压力值。 在立体显微镜下检查灯丝的尖端，以确保没有锋利或不规则的边缘保持，因为这些边缘可能会对幼虫的皮肤造成组织损伤并干扰校准。 使用磨刀石手动平滑机械探头的锋利边缘，直到没有明显的不规则现象持续存在（图 1D）。 用皮下针在木制冰棒（图1E）末端打一个洞（见 材料表）。将针头至少插入冰棒高度的一半（图 1E）。这创建一个插入尼他诺灯丝的腔室。 将木胶涂在单根硝基醇长丝（图1F）上，将胶涂层的长丝插入木制冰棒（图1G）的针槽中。允许干燥~5小时。 将每个机械探头按压到刻度上，直到机械探头弯曲（图 1H-L），从而校准每个机械探头。这是可以用克记录的最大力点。根据灯丝直径（预集）和长度（用户确定），可以生成各种力和压力。 使用公式 f = ma 将第 1.6 步中记录的质量转换为在米林沃顿 （mN） 中力（力等于质量乘以引力加速度）。f：武力：m：质量：a：引力加速度（9.8米/s2）（图1M）。 最后，通过将测量的力除以灯丝尖的表面积（图 1M），将计算的力转换为千帕斯卡 （kPa） 中的压力（力/面积）。要计算面积，将不同尼蒂诺长丝的直径从英寸（0.04 英寸、0.06 英寸和 0.08 英寸）转换为厘米。然后，+2（ 其中，r = 硝基醇灯丝半径）确定区域（见 图 1M）。使用不同直径和长度的细丝准备多个探针将生成一套跨越 果蝇 幼虫响应范围的完整集（ 图 1N中显示的示例集）。注：至少每3-4周检查一次每个机械探头。当压力偏离原测量± 3% 以上时，必须制造新的机械探头。 2. 幼虫的准备 在25°C孵化器中，在标准食品上提高控制菌株（w1118）幼虫后代或幼虫，其中含有转基因 ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP（ 用于可视化对感官神经元的损伤）。通常，库存通常维持在18°C，但父母和幼虫后代都以25°C的标准玉米粉食品饲养，用于实验。注：成年苍蝇（5雄10雌，1：2比例）保存在飞瓶中，允许产卵，约24小时。产卵后的时间 （AEL） 从成人被移除开始。 通过轻轻地将自来水喷入含有幼虫的软蝇食物中，收集大约96小时后的第三个星内幼虫。离开食物的流浪幼虫，或者曾经长过前孢子或后尖刺的幼虫，对于这个检测来说太大/太老了。第二个星内幼虫（~长度小于4毫米）太小。 倒出软飞食品的内容到一个干净的标准大小的培养皿（100毫米×15毫米）。 使用钳子，排序中三星，中等大小，幼虫（见 图2A）从较小的（第二星和早期第三星）或更大（晚或徘徊第三星）幼虫。建议用钳子进行温和操作，以避免对幼虫造成任何组织损伤。注意：使用钳子的转移主要基于水的张力，而不是用钳子的叶片对幼虫施加压力。使用钳子操纵幼虫的替代方案是软漆刷。使用任一工具，用户应练习转移动物，以免造成意外的组织损伤，从而可能使行为测量复杂化。 将中三星幼虫，使用钳子，转移到一个小的培养皿（30毫米×15毫米），里面装着一小插在室温下用水滋润的苍蝇食物。将幼虫放在小培养皿中，直到进行实验，但不超过20分钟。注：一般来说，将20-30个幼虫转移到食物塞上，可以提供足够数量的20分钟的行为检测。 3. 机械节点检测 将三分之一的星状幼虫（使用钳子）放在明亮的场立体显微镜下的黑色或深色乙烯基薄垫上。深色提供对比度，改善幼虫的可视化。最好有一块可自由移动的深色乙烯基，因为它允许用户对齐幼虫而不接触或伤害它。 将光纤光放在显微镜客观透镜和黑色或深色乙烯基垫之间：这将允许足够的高对比度照明看到幼虫。 丢弃幼虫，在转移到垫子后不显示正常运动。这些可以干扰正常的无感知行为反应。有关正常运动，请参阅 视频 1。 用纸巾擦去幼虫周围的任何多余的水，这些水都可能导致幼虫漂浮在乙烯基垫上。 通过移动深色乙烯基垫来定位幼虫。幼虫的头部/嘴应该指向左边，如果你是右手，反之亦然，如果你是左撇子（图2A-B）。 将选定的机械探头（通常为 1-2 s）涂抹在幼虫的后背侧，大致位于腹部部分 A8（见图 2B），直到探针弯曲并引出先前测量的压力（图 2C）。重要的是，探头压在幼虫的底体表面，并在探针接触点将幼虫压缩到底垫中。注：在硝基酚丝尖与多孔角质层表皮之间的接触点，探头低于 2，300 kPa，主要弯曲而不穿透角质层和底层组织。这种探针很少影响幼虫死亡率4。在更高的压力（>5，000 kPa）下，探头会弯曲，偶尔会穿透角质层和底层组织。幼虫的穿刺会损害幼虫的生存4， 如果观察到，这些幼虫通常从行为分析中被丢弃。 记录每个幼虫的行为反应。如果幼虫在3s内沿着身体轴线显示360°的完整卷，则表示阳性无感知反应（视频2）。其他响应（尝试转动、快速爬行和摆动）对于此检测的目的被视为否定。注：拉瓦刺激与潜移默化机械刺激（200 kPa）没有引起典型的非感知或滚动反应（视频3）。有些幼虫确实表现出快进或轻触反应，如运动方向的变化。 丢弃幼虫，准备下一个进行检测，重复步骤 3.1 到 3.7。 重复步骤 3.1-3.7 直到达到所需的幼虫数量（每个探头使用三到六组 n = 10 幼虫）。注：当使用低压机械探头（174-462 kPa）时，每个幼虫的检测需要更多时间。这是因为较长的细丝尖更振荡，使得在A8段的中心戳幼虫更加困难。这些探针需要实践。 4. 结合显微镜评估神经元形态学 将幼虫（基因型 ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP 标记感官神经元）之前用硝醇长丝刺激到科普林罐内的乙醚化室中，里面装着一个 10 mL 烧杯，里面装着一个棉球，里面浸泡着 ~1 mL 的二乙醚。让幼虫在房间里坐~5分钟。注：我们小组12日公布的先前研究中提供了一个关于乙醚化的详细协议。 将幼虫轻轻地从乙醚化室冲洗成一个小的培养皿。 准备好一个显微镜滑梯，两个小盖片（22×22毫米）和一个长盖片（22×54毫米）（见 材料表）。 在滑梯的两端添加小滴乙醚：油溶液（乙醚与卤碳油溶液的 1：5 比率，见 材料表），然后将小盖片放在小液滴的顶部。这种安排创造了一个小的空间间隙，幼虫可以适合。注意：将小盖片压在显微镜滑梯上，直到难以滑动。 在显微镜滑梯中间添加一些以太：油溶液，然后使用钳子将幼虫放置在显微镜滑梯的中心（在小盖片之间）。确保幼虫的前后轴与滑梯的短侧平行，并且正朝上。 盖住幼虫，将长盖片放在幼虫和两个较小的盖片上。注意：慷慨地按下长盖片，直到幼虫几乎变平。 使用粘膜显微镜（见 材料表）的幼虫图像段 A8 使用激光波长 488 （GFP）。注：立即对幼虫进行成像，因为通过乙醚麻醉会很快消退（约5-10分钟），幼虫会醒来移动，这会使进一步成像复杂化。 使用 20 倍数光圈 （NA） 0.7 干目标透镜在 1 倍变焦下捕获 1024 x 1024 像素的 Z 堆栈图像，步幅为 1.5μm。 5. 组织损伤的量化 收集并将 Z 系列堆栈图像（从第 4.8 节）转换为单个 Z 投影（将不同对焦平面拍摄的多个图像平展为单个合成图像）。这可以使用市售软件（例如，奥林巴斯 Fluoview）或任何等效的开源平台执行，例如，斐济/图像 J. 在 TIFF 格式中保存单个 Z 投影。 打开图像分析程序斐济/图像J。 单击 “文件”，从菜单栏中单击”打开”，然后从显示的窗口中选择 “打开 “。 选择以 TIFF 格式保存的存储单个图像投影进行分析。 单击 “编辑”，从菜单栏中，从显示的窗口中选择 “倒置 “选项。 单击”图像”，从菜单栏中，然后从显示的窗口选择”调整”，最后选择亮度/对比度选项。 从工具栏中选择 徒手形状 选项，以测量间隙的区域（如果有）。 单击 “分析”，从菜单栏中选择 “测量 “选项。这将显示间隙或伤口的区域。