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환경과학

Avaliando o impacto da fratura hidráulica nos córregos usando assinaturas moleculares microbianas

Published: April 04, 2021
doi:
10.3791/61904
, , , , , ,
1Department of Biology,Juniata College, 2Wright Labs, LLC, 3Department of Biological Sciences,Michigan Technological University, 4Biosciences Division,Oak Ridge National Laboratory, 5Department of Civil and Environmental Engineering,University of Tennessee

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para investigar os impactos da fratura hidráulica nos córregos próximos, analisando suas comunidades microbianas de água e sedimentos.

Abstract

A fratura hidráulica (HF), comumente chamada de “fracking”, usa uma mistura de água de alta pressão, areia e produtos químicos para fraturar rochas, liberando óleo e gás. Esse processo revolucionou a indústria de energia dos EUA, pois dá acesso a recursos antes inalcançáveis e agora produz dois terços do gás natural total nos Estados Unidos. Embora o fracking tenha tido um impacto positivo na economia dos EUA, vários estudos têm destacado seus efeitos ambientais prejudiciais. Uma preocupação particular é o efeito da fracking sobre as correntes de cabeceira, que são especialmente importantes devido ao seu impacto desproporcionalmente grande na saúde de toda a bacia hidrográfica. As bactérias dentro desses córregos podem ser usadas como indicadores de saúde do córrego, já que as bactérias presentes e sua abundância em um fluxo perturbado seriam esperadas para diferir daquelas em um fluxo de outra forma comparável, mas não perturbada. Portanto, este protocolo visa usar a comunidade bacteriana para determinar se os córregos foram afetados pelo fracking. Para isso, devem ser coletadas sedimentos e amostras de água de córregos próximos à fracking (potencialmente impactados) e rio acima ou em uma bacia hidrográfica diferente da atividade fracking (não espaçada). Essas amostras são então submetidas à extração de ácido nucleico, preparação de bibliotecas e sequenciamento para investigar a composição da comunidade microbiana. A análise correlacional e os modelos de aprendizagem de máquina podem ser posteriormente empregados para identificar quais características são explanativas de variação na comunidade, bem como a identificação de biomarcadores preditivos para o impacto do fracking. Esses métodos podem revelar uma variedade de diferenças nas comunidades microbianas entre os córregos de cabeceira, com base na proximidade com o fracking, e servem de base para futuras investigações sobre o impacto ambiental das atividades de fracking.

Introduction

A fratura hidráulica (HF), ou “fracking”, é um método de extração de gás natural, que tem se tornado cada vez mais prevalente à medida que a demanda por combustíveis fósseis continua a aumentar. Esta técnica consiste em usar equipamentos de perfuração de alta potência para injetar uma mistura de água, areia e produtos químicos em depósitos de xisto ricos em metano, geralmente para liberar gases presos1.

Como essas técnicas de colheita não convencionais são relativamente novas, é importante investigar os efeitos dessas práticas nas vias navegáveis próximas. As atividades de fracking obrigam a limpeza de grandes faixas de terra para transporte de equipamentos e construção de poços. Aproximadamente 1,2-1,7 hectares de terra devem ser desmatados para cada poçobloco 2,potencialmente impactando o escoamento e a qualidade da água do sistema3. Há uma falta de transparência em torno da composição química exata do fluido fracking, incluindo quais biocidas são usados. Além disso, a fracking de águas residuais tende a ser altamente salina2. Além disso, as águas residuais podem conter metais e substâncias radioativas de ocorrência natural2. Portanto, a possibilidade de vazamentos e derramamentos de fluido de fracking devido a erro humano ou mau funcionamento do equipamento é preocupante.

Os ecossistemas de córregos são conhecidos por serem muito sensíveis às mudanças nas paisagens circundantes4 e são importantes para manter a biodiversidade5 e o ciclismo de nutrientes adequados6 dentro de toda a bacia hidrográfica. Os micróbios são os organismos mais abundantes em correntes de água doce e, portanto, são essenciais para o ciclismo de nutrientes, biodegradação e produção primária. A composição e a função da comunidade microbiana servem como ótimas ferramentas para obter informações sobre o ecossistema devido à sua sensibilidade à perturbação, e pesquisas recentes têm mostrado mudanças distintas nas montagens bacterianas observadas com base na proximidade com a atividade fracking7,8. Por exemplo, Beijerinckia, Burkholderiae Methanobacterium foram identificados como enriquecidos em córregos próximos à fracking, enquanto Pseudonocardia, Nitrospirae Rhodobacter foram enriquecidos nos córregos não próximos ao fracking7.

O sequenciamento da próxima geração do gene RNA ribossômico 16S (rRNA) é um método acessível para determinar a composição da comunidade bacteriana que é mais rápida e barata do que o sequenciamento de genoma inteiro se aproxima9. Uma prática comum no campo da ecologia molecular é usar a região V4 altamente variável do gene 16S rRNA para resolução de sequenciamento, muitas vezes até o nível do gênero com um amplo escopo de identificação9,pois é ideal para amostras ambientais imprevisíveis. Esta técnica tem sido amplamente implementada em estudos publicados e tem sido utilizada com sucesso para identificar o impacto das operações de fracking em ambientes aquáticos7,8. No entanto, vale a pena notar que as bactérias possuem números de cópias variados do gene 16S rRNA, que afeta suas abundâncias detectadas10. Existem algumas ferramentas para explicar isso, mas sua eficácia é questionável10. Outra prática que está crescendo rapidamente na prevalência e não tem essa fraqueza é o sequenciamento metatranscriômico, no qual todo o RNA é sequenciado, permitindo que os pesquisadores identifiquem tanto bactérias ativas quanto sua expressão genética.

Portanto, em contraste com os métodos em estudos publicados anteriormente7,8,11,12, este protocolo também abrange coleta de amostras, preservação, processamento e análise para investigar a função comunitária microbiana (metatranscriptomia). As etapas aqui detalhadas permitem que os pesquisadores vejam qual o impacto, se houver, fracking teve sobre os genes e caminhos expressos por micróbios em seus fluxos, incluindo genes de resistência antimicrobiana. Além disso, o nível de detalhamento apresentado para coleta de amostras é melhorado. Embora várias das etapas e notas possam parecer óbvias para pesquisadores experientes, elas podem ser inestimáveis para aqueles que estão apenas começando a pesquisa.

Aqui, descrevemos métodos de coleta e processamento de amostras para gerar dados genéticos bacterianos como um meio de investigar o impacto do fracking em córregos próximos com base nos vários anos de experiência de nossos laboratórios. Esses dados podem ser usados em aplicações a jusante para identificar diferenças correspondentes ao status de fracking.

Protocol

1. Coleta de amostras de sedimentos para extração de ácido nucleico Submerse um tubo cônico de 50 mL estéril na água do córrego. Use luvas durante a coleta de amostras para evitar a introdução de contaminação humana indesejada. Realize esta etapa ou da costa ou virada rio acima se estiver na água. Enquanto o tubo cônico estiver submerso, remova a tampa e use-a para colher aproximadamente 3 mL de sedimentos de uma profundidade de 1 a 3 cm no tubo cônico. Remova o tubo cônico da água e despeje toda a água, exceto por uma camada fina que cobre a amostra de sedimentos (aproximadamente 1 mL). Utilizando uma pipeta de 1000 μL e pontas de pipeta apropriadas, adicione 3 mL de conservante de DNA/RNA (ver Tabela de Materiais para as especificações do conservante) à amostra coletada. Mantenha as pontas da pipeta em uma caixa de ponta de pipeta estéril e só as anexe imediatamente antes de usá-las e descartadas após o uso. Inverta o tubo cônico tampado 10 vezes para garantir que o conservante e a amostra estejam completamente misturados.NOTA O passo 1.4 não é necessário, mas é fortemente recomendável se o RNA deve ser extraído dos sedimentos mais tarde. Coloque as amostras no gelo para o resto da coleta de amostras. Ao retornar da coleta, armazene em um congelador a -20 °C se as amostras forem usadas para análise de 16S (DNA), ou -70 °C, se forem usadas para análise metatranscriptômica (RNA). 2. Coleta de filtro para extração de ácido nucleico Remova a tampa de uma garrafa 1 L estéril. Enquanto estiver de frente rio acima ou da costa, encha a garrafa com água do córrego até o topo e depois despeje-a. Repita este processo mais duas vezes para condicionar a garrafa. Encha a garrafa inteira uma quarta vez e tampe-a.NOTA: Se reutilizar uma garrafa de 1 L, ela pode ser esterilizada enxaguando com alvejante de 10% por 2 min, seguida por enxaguar três vezes com água desionizada e, em seguida, uma vez com 70% de etanol, e finalmente autoclaving com ajustes: 30 min tempo de exposição a 121,1 °C e 15 min tempo de secagem. Durante a autoclavagem, a tampa da garrafa deve estar muito solta para evitar que a garrafa seja comprimida no processo. Uma vez em uma superfície estável, use uma seringa de bloqueio Luer estéril e elasenhe um volume completo. Em seguida, conecte a seringa a um filtro poliethersulfone de 1,7 cm de diâmetro estéril e sem DNA/RNA com um tamanho de poros de 0,22 μm e empurre todo o volume através do filtro pressionando o êmbolo todo o caminho para baixo. Repita este processo até que o volume total coletado na garrafa (1 L) seja empurrado através do filtro.NOTA: O volume da seringa pode ser variável, se, a quantidade total de água empurrada através do filtro for rastreada. No entanto, geralmente, 60 mL é o preferido. Enquanto 1 L é ideal, anedotamente, um volume de pelo menos 200 mL provavelmente ainda coletaria biomassa suficiente (assumindo ~20.000 células por mL) para a extração de DNA e RNA. Remova o excesso de água do filtro, elaborando cerca de 20 mL de ar na seringa e empurrando-a através do filtro.NOTA: Isso ajudará a evitar a perda do conservante se a etapa 2.4 for realizada. Usando uma micropipette P1000, adicione 2 mL de um conservante de DNA/RNA descarregando-o através da abertura maior do filtro (onde estava preso à seringa) enquanto segurava o filtro horizontalmente. A ponta da pipeta deve estar dentro do cano do filtro quando a pipeta estiver deprimida para garantir que o conservante entre no filtro. Troque a ponta após cada uso.NOTA: Assim como na coleta de sedimentos, esta etapa não é necessária, mas é fortemente recomendada para o aumento da produção de ácido nucleico mais tarde, especialmente para o RNA. Retire um quadrado de filme de parafina e enrole-o firmemente em cada abertura/extremidade do filtro para selar. Coloque o filtro embrulhado do filme de parafina em um saco de amostra estéril e, em seguida, coloque todo o saco no gelo durante a coleta.NOTA: Certifique-se de que o lado usado para embrulhar o filtro é estéril, ou seja, não exposto anteriormente ao ambiente. Após o retorno da amostragem, armazene os filtros a -20 °C para 16S ou -70 °C para meta-transcrição. 3. Extração e quantificação de ácido nucleico Limpe a área de trabalho com 10% de alvejante e 70% de etanol antes de iniciar a transferência amostral. Para sedimentos (a partir do passo 1.5), geralmente, use ~0,25 g de amostra. A chama esteriliza uma ferramenta metálica mergulhando-a em um béquer de 70% de etanol e queimando o etanol entre as amostras. Para filtros (a partir da etapa 2.6), mova o papel filtro para um tubo estéril para extração. Para isso, siga os passos abaixo. Crie uma superfície livre estéril, DNA e RNA dobrando a folha de alumínio para que a parte interna da dobra não seja exposta ao ambiente externo e autoclaving a peça dobrada com as configurações: 121,1 °C e 5 min de tempo de secagem. Esterilize um aperto de víse com 70% de etanol e uma chama aberta. Em seguida, use o aperto de víse para quebrar o invólucro do filtro na superfície estéril e remova o núcleo da carcaça. Use um bisturi estéril para cortar o papel filtro do núcleo cortando a parte superior e inferior e, em seguida, ao longo da costura. Dobre o papel do filtro usando pinças estéreis e, em seguida, corte o filtro em pequenos pedaços usando o bisturi. Coloque as peças do filtro em um tubo de microcentrifuuagem para extração. Certifique-se de que o papel filtro não entre em contato com nenhuma superfície que não esteja esterilizada ou que possa ter ácido nucleico presente, pois isso levaria à contaminação indesejada da amostra. Realize o isolamento de DNA como descrito anteriormente13 ou usando um kit baseado em colunas comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais). As etapas para o kit comercial listado são brevemente descritas abaixo. Lise as células dentro da amostra transferindo-as para um tubo de contas e submetendo-as a um disruptor celular em alta velocidade por pelo menos 5 minutos. Centrifugar e transferir o supernatante para um tubo de microcentrifusidade estéril. Adicione o tampão de lise ao supernasciente (volume 1:1) e transfira para o filtro fornecido (amarelo). Centrifugar o filtro. Transfira o filtro para um novo tubo de microcentrifuuge estéril. Adicione o tampão de preparação (400 μL), centrífuga e descarte o fluxo através. Adicione o tampão de lavagem (700 μL), centrífuga e descarte o fluxo através. Em seguida, adicione o tampão de lavagem (400 μL), centrífuga e descarte o fluxo novamente. Transfira o filtro para um novo tubo de microcentrifuuge estéril. Elute com 50 μL de dNase/RNase água livre e deixe sentar-se por 5 minutos à temperatura ambiente antes de centrifuging. Durante esse período de cubação, prepare o filtro III-HRC colocando-o em um tubo de coleta e adicionando a solução de preparação HRC (600 μL) a ele, seguido por uma etapa de centrifugação de 3 min a 8.000 x g. Mova o filtro preparado para um tubo de microcentrifuge estéril. Transfira o DNA elucido da etapa 3.4.5 para este filtro e centrífuga a 16.000 x g por 3 min. O fluxo contém o DNA extraído. Armazene extratos de DNA para sedimentos e filtros a -20 °C.NOTA: Extratos de DNA podem ser armazenados por cerca de 8 anos a -20 °C assumindo temperatura estável, exposição limitada à luz e sem contaminantes nocivos14. Realize o isolamento do RNA de acordo com o protocolo do fabricante. Armazene extratos de RNA a -80 °C. Lise as células dentro da amostra transferindo-as para um tubo de contas e submetendo-as a um disruptor celular em alta velocidade por pelo menos cinco minutos. Centrifugar e transferir o supernatante para um tubo de microcentrifusidade estéril. Adicione tampão de lise ao supernasciente (volume 1:1) e transfira para a coluna fornecida (amarela). Centrifugar a coluna. Adicione um volume igual de 95-100% de etanol ao fluxo e misture por tubulação para cima e para baixo cinco vezes. Coloque a Coluna IICG (verde) em um tubo de microcentrifuus estéril. Transfira a solução mista para a coluna e a centrífuga. Adicione o tampão de lavagem (400 μL), centrífuga e descarte o fluxo através. Adicione 5 μL de DNase I e 75 μL de tampão de digestão de DNA à coluna e incubar à temperatura ambiente por 15 minutos. Adicione o buffer de preparação (400 μL), centrífuga e descarte o fluxo através. Adicione o tampão de lavagem (700 μL), centrífuga e descarte o fluxo através. Em seguida, adicione o tampão de lavagem (400 μL), centrífuga e descarte o fluxo novamente. Transfira a coluna para um novo tubo de microcentrifusagem estéril. Elute com 50 μL de água livre DNase/RNase e deixe sentar-se por 5 minutos antes de centrifugar. Durante esse período de incubação, prepare o filtro III-HRC colocando-o em um tubo de coleta e adicionando a solução de preparação hrc (600 μL) a ele, seguido por uma etapa de centrifugação de 3 min a 8.000 x g. Mova o filtro preparado para um tubo de microcentrifuge estéril. Transfira o RNA elucido da etapa 3.6.9 para este filtro e centrífuga a 16.000 x g por 3 min. O fluxo contém o RNA extraído.NOTA: Os extratos de RNA só podem ser armazenados por um ano antes de começarem a degradar15. Ambos os extratos de DNA e RNA são degradados pelo repetido congelamento-descongelamento. Alguns protocolos permitem a extração tanto do DNA quanto do RNA da mesma amostra16,17. Quantifique as amostras de DNA e RNA extraídas usando um fluorômetro ou um espectógrafo. Consulte a Tabela 1, por exemplo, valores de concentração de DNA fluorômetro. Para um exemplo, protocolo de quantificação de espectrofotômetros, consulte referência18. Os valores de concentração de DNA de sedimentos com o kit listado na Tabela de Materiais geralmente variam de 1 a 40 ng/μL, enquanto os valores de concentração de DNA do filtro tendem a variar de 0,5 a 10 ng/μL. Os valores de concentração de RNA de sedimentos com o kit listado na Tabela de Materiais geralmente variam de cerca de 1 a 20 ng/μL, enquanto os valores de concentração de RNA do filtro tendem a ser menores, tipicamente variando de 0,5 a 5 ng/μL. 4. Criação da biblioteca rRNA 16S Limpe a área de trabalho com 10% de Alvejante e 70% de Etanol. A área de trabalho deve ser um espaço fechado capaz de produzir condições de fluxo laminar (capô de fluxo laminar). Use os extratos de DNA (a partir da etapa 3.5) e prepare amostras para sequenciamento de amplicon de 16S rRNA com um protocolo PCR padrão, como o descrito no site do Microbioma da Terra que amplifica a região hipervariável V4 de 16S rRNA19 sob condições de fluxo laminar. Prepare um gel de 2% de agarose como descrito anteriormente e deixe solidificar17. Misture 7 μL de produto PCR e 13 μL de água livre DNase. Adicione um corante de carregamento de gel a uma concentração final de 1x. Uma vez que a agarose é solidificada, carregue este mix de produtos PCR em um gel de 2% de agarose.NOTA: Alternativamente, um gel pré-fundido pode ser usado em vez disso, pois esses géis correm mais rápido e vêm pré-fabricados. Execute o gel em 90 V por 60-90 min para verificar o tamanho da banda de 386 como amplificação bem sucedida para amplificadores 16S rRNA V4, usando o protocolo do Microbioma da Terra. 5. DNA 16S rRNA library purificação Pool 10 μL de produtos PCR para as amostras que produziram faixas brilhantes e 13 μL para as amostras que produziram faixas fracas em um tubo de microcentrifuge estéril de tamanho apropriado. Verifique a concentração da piscina resultante usando um fluorômetro ou espectotógrafo e prepare um gel de 2% de agarose como antes. Idealmente, a piscina deve ter uma concentração de pelo menos 10 ng/μL, e a maioria das amostras deveria ter tido uma concentração de cerca de 25 ng/μL. Concentração e volume permitindo, carregue em torno de 150-200 ng em um poço de 2% de gel de agarose. Execute o gel por 60-90 min a 90 volts. Purifique a biblioteca agrupada executando um gel de 2% de agarose. Extite a banda de DNA de 386 bp do gel e purifique a biblioteca agrupada usando um kit comercialmente disponível, conforme descrito anteriormente20. Elute o DNA purificado com 30 μL de 10 mM Tris-Cl (pH 8.5). Realize esta etapa em uma área diferente da extração de DNA ou RNA para evitar contaminação futura, pois o corte do gel espalhará amplicons PCR tanto para o experimentador quanto para a área circundante. Verifique a concentração da piscina purificada usando um fluorômetro ou espectotógrafo. Se a purificação correu bem, sua concentração deve ser pelo menos metade da piscina não purificada. Geralmente, a concentração final deve variar de 5 a 20 ng/μL. Envie as bibliotecas purificadas para o sequenciamento da próxima geração. Certifique-se de que eles são mantidos frios durante o transporte, incluindo gelo seco no contêiner de transporte. 6. Criação e purificação da biblioteca RNA Vários kits comerciais podem ser utilizados para criar bibliotecas RNA. Para qualquer um que seja usado, siga o protocolo do fabricante como escrito enquanto trabalha em um ambiente de fluxo laminar estéril. Uma versão muito resumida do protocolo para kit na Tabela de Materiais é apresentada abaixo de21. Faça o primeiro mix mestre de síntese cDNA de fio (8 μL de água sem nuclease e 2 μL de First Strand Synthesis Enyzme Mix) e adicione-o à amostra. Coloque a amostra no termociclador com as condições especificadas no protocolo. Faça o segundo mix de síntese cDNA (8 μL de Second Strand Synthesis Reaction Buffer, 4 μL Second Strand Synthesis Enthesis Enthese Mix, e 48 μL de água sem nuclease) no gelo e adicione-o à amostra. Coloque em um termociclador definido para 16 °C durante uma hora. Purifique a reação adicionando as contas fornecidas (144 μL) e realizando duas lavagens de etanol de 80% (200 μL). Elute com o tampão TE fornecido (53 μL) e transfira 50 μL do supernante para um tubo PCR limpo. Coloque o tubo PCR no gelo. Faça a mistura mestre de preparação final (7 μL de Tampão de Reação de Preparação Final e 3 μL de End Prep Enzima Mix) no gelo e adicione-o ao tubo PCR. Coloque o tubo PCR em um termociclador com as condições especificadas no protocolo. Misture as soluções de Adaptador Diluído (2,5 μL), Ligation Master Mix (30 μL) e Ligation Enhancer (1 μL) no gelo. Adicione as soluções mistas à amostra e coloque em um termociclador por 15 min a 20 °C. Purifique a reação adicionando as contas fornecidas (87 μL) e realizando lavagens de etanol (200 μL) e elução como antes, exceto apenas adicionar 17 μL de TE. Adicione índices (10 μL) e a solução Q5 Master Mix (25 μL) e coloque em um termociclador com as condições descritas no protocolo. Purifique a reação adicionando as contas fornecidas (45 μL) e realizando uma adição de duas lavagens de etanol (200 μL) e elute com 23 μL de TE. Transfira 20 μL para um tubo PCR limpo. Verifique as bibliotecas se há concentrações detectáveis de RNA usando um Bioanalyzer, fluorômetro ou espectrômetro. Acumule as bibliotecas metatranscriptômicas em uma proporção aproximadamente equimolar. Purifique a biblioteca seguindo o mesmo protocolo para a purificação da biblioteca 16S, exceto fragmentos de impostos entre 250 e 400 bp. Enquanto a biblioteca 16S tinha uma banda distinta representando a região amplificada, o resultado aqui é uma mancha. Verifique a concentração da biblioteca purificada como antes. Envie a biblioteca purificada com gelo seco para uma instalação de sequenciamento.NOTA: Alternativamente, os extratos de RNA podem ser enviados a uma universidade ou empresa privada para preparação e sequenciamento da biblioteca. 7. Análise comunitária microbiana Uma vez que o sequenciamento esteja concluído, acesse os dados da amostra. Baixe-o para um computador utilizável.NOTA: Idealmente, o dispositivo deve ter pelo menos 16 gigabytes de RAM. Para uma discussão sobre os requisitos de computação (para Qiime2), consulte https://forum.qiime2.org/t/recommended-specifications-to-run-qiime2/9808. Use softwares, como mothur, QIIME2 e R, para analisar dados de rRNA 16S. Veja aqui https://docs.qiime2.org/2020.11/tutorials/moving-pictures/ para um tutorial de análise QIIME2 16S. Para dados metatranscriptomics (RNA), use HUMAnN2 e ATLAS para determinar quais genes e caminhos estão presentes nas amostras.NOTA: Um exemplo de pipeline metatranscriptomics que culmina em diversidade e análise florestal aleatória é apresentado no arquivo Informações Suplementares. Todos os comandos são executados através da linha de comando, por exemplo, Terminal para usuários de Mac.

Representative Results

O sucesso das extrações de DNA e RNA pode ser avaliado usando uma variedade de equipamentos e protocolos. Geralmente, qualquer concentração detectável de ambos é considerada suficiente para concluir que a extração foi bem sucedida. Examinando a Tabela 1, então, todas as extrações, exceto uma, seriam apelidadas de bem sucedidas. A falha nesta etapa deve-se muitas vezes à baixa biomassa inicial, má preservação da amostra ou erro humano durante a extração. No caso dos filtros, a extração pode ter sido bem sucedida mesmo que a concentração esteja abaixo da detecção. Se esses extratos não renderem faixas para PCR (se estiverem fazendo 16S) ou uma concentração detectável após a preparação da biblioteca (metatranscriptomics), eles provavelmente falharam. Se o protocolo 16S for seguido, bandas brilhantes após a amplificação do PCR, como visto nos poços 4 e 6 na Figura 1,indicam sucesso, enquanto a falta de bandas, como visto nos outros poços da linha superior, indica falha. Além disso, uma faixa brilhante na faixa de gel que contém um controle PCR negativo também indicaria uma falha, uma vez que seria arriscado supor que a contaminação que afeta o controle negativo não afetou as amostras. Tanto para o 16S quanto para a metatranscriptomia, o sucesso do sequenciamento pode ser avaliado olhando para o número de sequências obtidas(Figura 2). As amostras 16S devem ter um mínimo de 1.000 sequências, sendo pelo menos 5.000 ideais(Figura 2A). Da mesma forma, as amostras de metatranscriptomia devem ter um mínimo de 500.000 sequências, sendo pelo menos 2.000.000 ideais(Figura 2B). Amostras com menos sequências do que esses mínimos não devem ser utilizadas para análises, pois podem não representar com precisão sua comunidade bacteriana. No entanto, amostras que caem entre o mínimo e o ideal ainda podem ser utilizadas, embora os resultados devem ser interpretados com mais cautela se muitas amostras caírem nessa faixa. O sucesso da análise subsequente a jusante pode ser determinado simplesmente com base na obtenção ou não dos arquivos de saída esperados. De qualquer forma, programas, como QIIME2 e R (Figura 3),devem permitir a avaliação de potenciais diferenças significativas entre as comunidades bacterianas baseadas no fracking. Os dados da Figura 3 foram obtidos através da coleta de amostras de sedimentos de vinte e um locais diferentes em treze fluxos diferentes para análise 16S e metatranscriptomics. Desses vinte e um locais, doze deles eram a jusante da atividade fracking e classificados como HF+, e nove deles eram a montante da atividade fracking ou em uma bacia hidrográfica onde o fracking não estava ocorrendo; esses fluxos foram classificados como HF-. Além da presença de atividade fracking, os córregos eram comparáveis. Essas diferenças podem assumir a forma de mudanças composicionais consistentes com base no status de fracking. Se esse fosse o caso, hf+ e HF- amostras seriam esperadas para agrupar-se entre si em um lote PCoA, como é o caso da Figura 3A e Figura 3B. Para confirmar que essas mudanças aparentes não são apenas um artefato do método de ordenação, mais análises estatísticas são necessárias. Por exemplo, um teste PERMANOVA22 na matriz de distância que a Figura 3A e a Figura 3B baseiam-se em agrupamento significativo revelado com base no status de fracking, o que significa que a separação observada na trama é consistente com diferenças entre as comunidades bacterianas das amostras, em vez de um artefato de ordenação. Um resultado significativo permanova ou ANOSIM é uma forte indicação de diferenças consistentes entre as amostras de HF+ e HF, o que indicaria que as amostras de HF+ foram impactadas pelo fracking, enquanto um alto valor p indicaria que as amostras não foram impactadas. Os dados metatranscriptômicos também podem ser visualizados e avaliados usando os mesmos métodos. Examinar características diferenciais (micróbios ou funções) pode revelar evidências de que as amostras também foram impactadas. Um método de determinar características diferenciais é criar um modelo florestal aleatório. O modelo florestal aleatório pode ser usado para ver o quão bem o status de fracking das amostras pode ser corretamente classificado. Se o modelo tiver um desempenho melhor do que o esperado por acaso, isso seria uma evidência adicional de diferenças dependentes do status de fracking. Além disso, os preditores mais importantes revelariam quais características eram mais importantes para diferenciar corretamente as amostras(Figura 3C). Esses recursos também teriam, então, valores consistentemente diferentes com base no status de fracking. Uma vez determinadas essas características diferenciais, a literatura pode ser revisada para ver se elas foram previamente associadas ao fracking. No entanto, pode ser desafiador encontrar estudos que determinassem funções diferenciais, já que a maioria só usou dados composicionais de rRNA 16S. Portanto, para avaliar as implicações das funções diferenciais, um método possível seria ver se elas foram previamente associadas à resistência potencial a biocidas comumente usados em fluido de fracking ou se poderiam ajudar a tolerar condições altamente salinas. Além disso, examinar o perfil funcional de um taxon de interesse poderia revelar evidências do impacto do fracking(Figura 3D). Por exemplo, se um taxon é identificado como diferencial pelo modelo florestal aleatório, seu perfil de resistência antimicrobiana em amostras de HF+ poderia ser comparado ao seu perfil em amostras de HF e se elas diferem muito, isso poderia sugerir que o fluido fracking contendo biocidas entrou no fluxo. Amostraid Concentração (ng/μL) 1 1.5 2 1.55 3 0.745 4 0.805 5 7.82 6 0.053 7 0.248 8 0.945 9 1.82 10 0.804 11 0.551 12 1.69 13 4.08 14 Below_Detection 15 7.87 16 0.346 17 2.64 18 1.15 19 0.951 Tabela 1: Exemplos de concentrações de DNA baseadas no teste de dna fluorômetro 1x DSde alta sensibilidade . Extrações para todas essas amostras, com exceção de 14, seriam consideradas bem sucedidas devido a ter quantidades detectáveis de DNA. Figura 1: Exemplo de e-gel com produtos PCR. O gel foi pré-manchado e visualizado sob uma luz UV, fazendo com que qualquer DNA presente nele brilhasse. PcR trabalhou para as amostras nos poços 4 e 6 na primeira linha, pois ambos tinham uma única faixa brilhante do tamanho esperado (com base na escada). PcR para as amostras nos outros seis poços falhou, pois eles não produziram nenhuma faixa. O controle positivo (primeiro bem, segunda linha) teve uma faixa brilhante, indicando que o PCR foi executado corretamente, e os controles negativos (poços 6 e 7, segunda linha) não possuíam faixas, indicando que as amostras não estavam contaminadas. Se um negativo tivesse uma faixa tão brilhante quanto as amostras, o PCR teria sido considerado um fracasso, pois seria arriscado supor que as amostras tinham amplicons que não eram apenas o resultado da contaminação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: A sequência de exemplo conta. (A) 16S contagem de sequência de exemplo. Quase todas essas amostras de 16S tinham mais de 1.000 sequências. Os poucos que tiveram menos de 1.000 sequências devem ser excluídos das análises a jusante, pois tinham sequências insuficientes para representar com precisão suas comunidades bacterianas. Várias sequências tiveram entre 1.000 e 5.000 sequências; embora não seja o ideal, eles ainda seriam utilizáveis, uma vez que excedem o mínimo, e a maioria das amostras excedem o mínimo ideal de 5.000 também. (B) Conta o exemplo de metatranscriptomia. Todas as amostras excederam o número mínimo (500.000) e o mínimo ideal (2.000.000) de sequências. Portanto, o sequenciamento foi bem sucedido para todos eles, e todos eles poderiam ser usados em análises a jusante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Análise de exemplo. (A) Trama PCoA baseada em coordenadas calculadas com uma matriz de distância Unifrac ponderada criada e visualizada através do QIIME2. (B) Parcela PCoA baseada em coordenadas calculadas com a matriz de distância Unifrac ponderada exportada a partir de QIIME2. As coordenadas foram visualizadas usando os pacotes Phyloseq e ggplot2 em vetores R. Metadados foram instalados na trama usando o pacote Vegan. Cada ponto representa a comunidade bacteriana de uma amostra, com pontos mais próximos indicando composições comunitárias mais semelhantes. Foram observados clustering com base no estado de fracking dessas amostras de sedimentos 16S (PERMANOVA, p=0,001). Além disso, os vetores revelam que as amostras de HF+ tendiam a ter níveis mais elevados de Bário, Brometo, Níquel e Zinco, o que correspondia a diferentes composiçãos da comunidade bacteriana em comparação com as amostras de HF. (C) Gráfico dos melhores preditores para um modelo florestal aleatório que testou onde abundâncias bacterianas poderiam ser usadas para prever o status de fracking entre as amostras. O modelo de floresta aleatória foi criado através de R usando o pacote randomForest. Os 20 principais preditores são mostrados, bem como as consequentes reduções de impureza (medida do número de amostras de HF+ e HF agrupadas) na forma de Redução Média no Índice de Gini quando são utilizadas para separar amostras. (D) Gráfico de tortas mostrando o perfil de resistência antimicrobiana do perfil Burkholderiales com base em dados metatranscriptômicos. As sequências foram anotadas pela primeira vez com Kraken2 para determinar a que taxa pertenciam. O BLAST foi então usado com essas sequências anotadas e o banco de dados MEGARes 2.0 para determinar quais genes de resistência antimicrobiana (na forma de “MEG_#”) estavam sendo ativamente expressos. Genes de resistência antimicrobiana expressos por membros de Burkholderiales foram então extraídos para ver quais eram mais prevalentes entre esse imposto. Embora mais cara e demorada, a metatranscriptomia permite análises funcionais, como esta, que não podem ser feitas com dados 16S. Notavelmente, kraken2 foi usado para esta análise de exemplo, em vez de HUMAnN2. Kraken2 é mais rápido que HUMAnN2; no entanto, ele só produz informações composicionais, em vez de composição, contribuição e funções (genes) e caminhos como o HUMAnN2 faz. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Arquivo Suplementar: Um exemplo de duto metatranscriptômico. Clique aqui para baixar este arquivo. 

Discussion

Os métodos descritos neste artigo foram desenvolvidos e refinados ao longo de diversos estudos publicados pelo nosso grupo entre 2014 e 20187,8,10 e foram empregados com sucesso em um projeto colaborativo para investigar os impactos da fracking em comunidades aquáticas em um projeto de três anos que em breve enviará um artigo para publicação. Esses métodos continuarão a ser utilizados ao longo do restante do projeto. Além disso, outra literatura atual que investiga o impacto do fracking em córregos e ecossistemas descrevem métodos semelhantes para coleta, processamento e análise de amostras7,8,10,11. No entanto, nenhum desses artigos utilizou análise metatranscriptômica, tornando este artigo o primeiro a descrever como essas análises podem ser usadas para elucidar o impacto do fracking em córregos próximos. Além disso, os métodos aqui apresentados para coleta de amostras são mais detalhados, assim como as medidas tomadas para evitar a contaminação.

Um dos passos mais importantes do nosso protocolo é a coleta e preservação inicial da amostra. A amostragem e a coleta de campo vêm com certos desafios, pois manter um ambiente asséptico ou estéril durante a coleta pode ser difícil. Durante esta etapa, é vital evitar contaminar amostras. Para isso, as luvas devem ser usadas, e apenas recipientes e ferramentas estéreis devem ser autorizados a entrar em contato com amostras. As amostras também devem ser imediatamente colocadas no gelo após a coleta para mitigar a degradação do ácido nucleico. A adição de um conservante comercial de ácido nucleico após a coleta também pode aumentar a produção de ácido nucleico e permitir que as amostras sejam armazenadas por períodos mais longos de tempo após a coleta. Sempre que a extração de ácido nucleico é realizada, é importante usar a quantidade adequada de amostra, muito pode entupir filtros de spin usados para extração (para aqueles protocolos que fazem uso deles), mas muito pouco pode resultar em baixos rendimentos. Certifique-se de seguir as instruções para qualquer kit que for usado.

Semelhante à coleta de campo, evitar ou minimizar a contaminação também é importante durante a extração nucleico de ácido e preparação de amostras, especialmente quando se trabalha com amostras de baixo rendimento de ácido nucleico, como amostras de sedimentos subótimos (amostras contendo uma grande quantidade de cascalho ou rochas) ou amostras de água. Portanto, como na coleta de amostras, as luvas devem ser usadas durante todas essas etapas para reduzir a contaminação. Além disso, todas as superfícies de trabalho utilizadas durante os procedimentos laboratoriais devem ser esterilizadas antecipadamente, limpando com uma solução de alvejante de 10%, seguida de uma solução de 70% de etanol. Para as etapas de pipetação (3-6), as pontas do filtro devem ser usadas para evitar contaminação devido à própria pipeta, com as pontas sendo trocadas toda vez que tocam em uma superfície não estéril. Todas as ferramentas utilizadas para o trabalho em laboratório, incluindo pipetas, devem ser apagadas antes e depois com as soluções de alvejante e etanol. Para avaliar a contaminação, os espaços em branco de extração e negativos (líquido estéril) devem ser incluídos durante cada conjunto de extrações de ácido nucleico e reações de PCR. Se a quantificação após as extrações revelar uma quantidade detectável de DNA/RNA nos negativos, as extrações podem ser repetidas se houver amostra suficiente. Se as amostras negativas para PCR mostrarem amplificação, a solução de problemas deve ser realizada para determinar a fonte e, em seguida, as amostras devem ser reprisadas. Para explicar os baixos níveis de contaminação, recomenda-se que os espaços de extração e os negativos pcr sejam sequenciados para que os contaminantes possam ser identificados e removidos, se necessário, durante a análise computacional. Por outro lado, a amplificação do PCR também pode falhar devido a uma variedade de causas. Para amostras ambientais, a inibição da reação do PCR é frequentemente a culpada, o que pode ser devido a uma variedade de substâncias que interferem com a polimerase Taq23. Se houver suspeita de inibição, a água de grau PCR (ver Tabela de Materiais) pode ser usada para diluir os extratos de DNA.

Este protocolo tem algumas limitações notáveis e possíveis dificuldades. A coleta de amostras pode ser um desafio tanto para amostras de água quanto para sedimentos. Para obter biomassa suficiente, idealmente 1 L de água do córrego precisa ser empurrada através de um filtro. Os poros do filtro precisam ser pequenos para capturar micróbios, mas também podem prender sedimentos. Se muitos sedimentos estão na água devido às chuvas recentes, o filtro pode entupir dificultando a empurrar todo o volume através do filtro. Para a coleta de sedimentos, pode ser desafiador estimar a profundidade dos sedimentos durante a coleta. Além disso, é importante garantir que o sedimento coletado seja predominantemente solo, pois pedras e rochas levarão a menor rendimento de ácido nucleico e podem não ser uma representação precisa da comunidade microbiana. Por fim, é vital também que as amostras sejam mantidas no gelo após a coleta, especialmente se um conservante não for utilizado.

Embora este protocolo cubra tanto os protocolos de laboratório metatranscriptomics quanto os 16S, deve-se enfatizar que esses dois métodos são muito diferentes tanto no processo quanto no tipo de dados que fornecem. O gene 16S rRNA é uma região comumente visada, altamente conservada em bactérias e arqueias, e útil para caracterizar a comunidade bacteriana em uma amostra. Embora uma abordagem específica e direcionada, a resolução do nível das espécies é muitas vezes inatingível, e caracterizar espécies ou cepas recém-divergidas é difícil. Ao contrário, metatranscriptomia é uma abordagem mais ampla que captura todos os genes ativos e micróbios presentes dentro de uma amostra. Considerando que o 16S fornece apenas dados para identificação, a metatranscriptomia pode fornecer dados funcionais, como genes expressos e vias metabólicas. Ambos são valiosos e, quando combinados, podem revelar quais bactérias estão presentes e quais genes estão expressando.

Este artigo descreve métodos de coleta de campo e processamento de amostras para análises de rRNA e metatranscriômicas 16S no contexto do estudo da fracking. Além disso, detalha os métodos de coleta para DNA/RNA de alta qualidade a partir de amostras de baixa biomassa e para armazenamento a longo prazo. Os métodos descritos aqui são o ápice de nossas experiências com coleta e processamento de amostras em nossos esforços para aprender como o fracking impacta os córregos próximos através da análise da estrutura e função de suas comunidades microbianas. Micróbios respondem rapidamente a distúrbios e, consequentemente, quais micróbios estão presentes e os genes que expressam podem fornecer informações sobre os efeitos do fracking nos ecossistemas. No geral, esses métodos podem ser inestimáveis em nossa compreensão de como o fracking impacta esses importantes ecossistemas.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostariam de reconhecer as fontes de financiamento para os projetos que levaram ao desenvolvimento desses métodos, sendo essas fontes: o Howard Hughes Medical Institute (http://www.hhmi.org) por meio do Programa de Educação em Ciências Pré-Graduação e Pré-Graduação, bem como pela Fundação Nacional de Ciência (http://www.nsf.gov) através dos prêmios NSF DBI-1248096 e CBET-1805549.

Materials

200 Proof Ethanol Thermo Fisher Scientific A4094 400 mL need to be added to Buffer PE (see Qiagen QIAQuck Gel Extraction kit protocol) and 96 mL needs to be added to the DNA/RNA Wash Buffer (see ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep kit protocol).
Additional ethanol is needed for the ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep and NEBNext® Ultra™ II RNA Library Prep with Sample Purification Beads kits.
Agarose Thermo Fisher Scientific BP1356-100 100 g per bottle. 0.6 g of agarose would be needed to make one 2% 30 mL gel.
Disinfecting Bleach Walmart (Clorox) No catalog number Use a 10% bleach solution for cleaning the work area before and after lab procedures
DNA gel loading dye Thermo Fisher Scientific R0611 Each user-made (i.e. non-e-gel) should include loading dye with all of the samples in the ratio of 1 µL dye to 5 µL sample
DNA ladder MilliporeSigma D3937-1VL A ladder should be run on every gel/e-gel
DNA/RNA Shield (2x) Zymo Research R1200-125 3 mL per sediment sample (50 mL conical) and 2 mL per water sample (filter)
Ethidium bromide Thermo Fisher Scientific BP1302-10 Used for staining user-made e-gels
Forward Primer Integrated DNA Technologies (IDT) 51-01-19-06 0.5 µL per PCR reaction
Isopropanol MilliporeSigma 563935-1L Generally less than 2 mL per library. Volume needed varies by mass of excised gel fragment (see Qiagen QIAQuick Gel Extraction kit protocol). 
PCR-grade water MilliporeSigma 3315932001 13 µL per PCR reaction (assuming 1 µL of sample DNA template is used)
Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x) Thermo Fisher Scientific 13000012 10 µL per PCR reaction
Reverse Primer Integrated DNA Technologies (IDT) 51-01-19-07 0.5 µL per PCR reaction
TBE Buffer (Tris-borate-EDTA) Thermo Fisher Scientific B52 1 L of 10x TBE buffer (30 mL of 1x TBE buffer would be needed to make one 30 mL gel)
1 L bottle Thermo Fisher Scientific 02-893-4E One needed per stream (the same bottle can be used for multiple streams if it is sterilized between uses)
1.5 mL Microcentrifuge tubes MilliporeSigma BR780400-450EA 5 microcentrifuge tubes are needed per DNA extraction and an additional 3 are needed to purify RNA (see ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep kit protocol)
2% Agarose e-gel Thermo Fisher Scientific G401002 Each gel can run 10 samples (so 9 with a PCR negative and 8 if the extraction negative is run on the same gel)
50 mL Conicals CellTreat 229421 1 50 mL conical needed per sediment samples
500 mL Beaker MilliporeSigma Z740580 Only 1 needed (for flame sterilization)
Aluminum foil Walmart (Reynolds KITCHEN) No number Aluminum foil can be folded and autoclaved. The part not exposed to the environment can then be used as a sterile, DNA and RNA free surface for processing filters
(one folded piece per filter to avoid cross-contamination)
Autoclave Gettinge LSS 130 Only one needed
Centrifuge MilliporeSigma EP5404000138-1EA Only 1 needed
Cooler ULINE S-22567 Just about any cooler can be used. This one is listed due to being made of foam, making it lighter and thus easier to take along for field sampling.
Disruptor Genie Bio-Rad 3591456 Only one needed
Electrophoresis chamber Bio-Rad 1664000EDU Only 1 needed
Electrophoresis power supply Bio-Rad 1645050 Only 1 needed
Freezer (-20 C) K2 SCIENTIFIC K204SDF One needed to store DNA extracts
Freezer (-80 C) K2 SCIENTIFIC K205ULT One needed to store RNA extracts
Gloves Thermo Fisher Scientific 19-020-352 The catalog number is for Medium gloves.
Heat block MilliporeSigma Z741333-1EA Only one needed
Lab burner Sterlitech 177200-00 Only one needed
Laminar Flow Hood AirClean Systems AC624LFUV Only 1 needed
Library purification kit Qiagen 28704 One kit has enough for 50 reactions
Magnet Plate Alpaqua A001219 Only one needed
Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75004061 Only one needed
Micropipette (1000 µL volume) Pipette.com L-1000 Only 1 needed
Micropipette (2 µL volume) Pipette.com L-2 Only 1 needed
Micropipette (20 µL volume) Pipette.com L-20 Only 1 needed
Micropipette (200 µL volume) Pipette.com L-200R Only 1 needed
NEBNext Ultra II RNA Library Prep with Sample Purification Beads New England BioLabs Inc. E7775S One kit has enough reagents for 24 samples.
Parafilm MilliporeSigma P7793-1EA 2 1" x 1" squares are needed per filter
PCR Tubes Thermo Fisher Scientific AM12230 One tube needed per reaction
Pipette tips (for 1000 µL volume) Pipette.com LF-1000 Pack of 576 tips
Pipette tips (for 20 µL volume) Pipette.com LF-20 Pack of 960 tips
Pipette tips (for 200 µL volume) Pipette.com LF-250 Pack of 960 tips
PowerWulf ZXR1+ computer cluster PSSC Labs No number This is just an example of a supercomputer powerful enough to perform metatranscriptomics analysis in a timely manner. Only one needed. 
Qubit fluorometer starter kit Thermo Fisher Scientific Q33239 Comes with a Qubit 4 fluorometer, enough reagent for 100 DNA assays, and 500 Qubit tubes
Scoopula Thermo Fisher Scientific 14-357Q Only one needed
Sterile blades AD Surgical A600-P10-0 One needed per filter
Sterivex-GP Pressure Filter Unit MilliporeSigma SVGP01050 1 filter needed per water sample
Thermocycler Bio-Rad 1861096 Only one needed
Vise-grip Irwin 2078500 Only one needed (for cracking open the filters)
Vortex-Genie 2 MilliporeSigma Z258415-1EA Only 1 needed
WHIRL-PAK bags ULINE S-22729 1 needed per filter
ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep kit Zymo Research R2002 One kit has enough reagents for 50 samples. 
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References

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Chen See, J. R., Wright, O., Unverdorben, L. V., Heibeck, N., Techtmann, S. M., Hazen, T. C., Lamendella, R. Evaluating the Impact of Hydraulic Fracturing on Streams using Microbial Molecular Signatures. J. Vis. Exp. (170), e61904, doi:10.3791/61904 (2021).
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