使用封闭的 Y 迷宫来评估爬行动物中的化学感官行为

所有涉及使用活脊椎动物的程序都得到了美国农业部和美国地质调查局机构动物护理和使用委员会的批准。 注：由于这些研究侧重于侵入性脊椎动物，因此还必须遵守遏制标准，这对实验的设计和执行施加了具体限制。虽然许多方法在两个研究地点和夜间研究时间之间相似，但以下两个部分中的每一个都描述了不同的方法。 1.美国农业部（USDA）动物植物健康检查局（APHIS）野生动物服务国家野生动物研究中心佛罗里达实地站的Y-maze设置和日间协议：野生捕获、圈养特古斯现场测试 注：Y迷宫和密封结构的所有组成部分的计划都提供补充文件1。 Y 迷宫尺寸和设计 使用底部片（1.22 米 x 2.44 米纤维水泥壁板）锚定 Y 迷宫。在顶层钻孔，让马车螺栓向上传递，以连接迷宫片。有关特定方向，请参阅补充文件 1。 用白色PVC装饰板建造迷宫的墙壁：底座的内部尺寸为 120 厘米 L（侧壁） x 42 厘米 W x 14 厘米 H。注：通道宽度设计为可容纳2倍焦动物宽度。额外的宽度允许灵活创建两个动物沉积的气味小径。 确保手臂的内部尺寸为 120 厘米 L（侧壁） x 40 厘米 W x 14 厘米 H。 在运行试用之前，使用单独的底部、侧面和顶部组件组装迷宫。使顶部的透明丙烯酸，使迷宫内的动物可视化。有关特定方向，请参阅补充文件 1。 创建单个气味轨迹时，使用底座中的内部分区来限制散发出气味的特古的空间访问。有关特定方向，请参阅补充文件 1。 当两个气味小径被不同的动物按顺序沉积时，使用分区系统来阻挡迷宫的交替手臂，并排除每种动物的基底交替的一半。有关特定方向，请参阅补充文件 1。 使用盒子，允许运输和收集用于Y迷宫试验的动物。确保所有盒子不透明，并配有易于固定的可拆卸盖子和丙烯酸门。 确保基盒（109 厘米 L x 56 厘米 W x 46 厘米 H）位于 Y 迷宫底座的开口处。使用它将香味或焦点动物转移到迷宫中，并在打开门并允许动物自愿进入迷宫之前进行适应。 确保臂箱（83 厘米 L x 50 厘米 W x 44 厘米 H）位于 Y-maze 手臂的末端，以便于捕捉嗅闻动物或焦点动物。 有关构建和组装的具体说明，请参阅补充文件 1。 用于日间视频采集的摄像机设置 相机规格：确保项目摄像机可以在可变光线条件下录制连续视频，并适合在当前温度和湿度条件下进行户外使用。 将摄像机安装在研究外壳的底面，确保整个 Y 迷宫都能在相机的视野中拍摄。调整镜头或相机的高度，以增加或减少视野。设置视场时，确保捕获足够的行为细节（如舌尖）。注：如果研究外壳的高度是固定的（例如，180 厘米 H），从而限制对视场的调整，则可以使用多个摄像头获得 Y-maze 内部的完全覆盖。确保摄像机在户外应用中使用时能够实现”宽动态范围”。 电源规格：确保每个摄像机都有足够的电源，以便在计划试用期间录制连续视频（例如，使用带内置备用电池的不间断电源 （UPS）以确保连续供电）。注意：如果没有交流电源可用，POE（以太网供电）摄像机可以通过连接到数字录像机 （DVR） 或使用网络录像机 （NVR） 的 POE 开关的网络电缆供电。 录制规格：在选择 DVR 或 NVR 时，请确保它符合项目要求，包括足够的存储容量和足够的 POE 连接器 （DVR） 或摄像机通道 （NVR），以适应使用的摄像机数量。选择适合所需视频质量的录制参数，牢记数据文件的大小（例如，H264 压缩速率和每秒 10 帧的图像速率 [FPS]）。 获取和处理视频的协议： 从动物开始进入迷宫的那一刻开始录制视频，到捕捉或预设时间框架（1.3.3.4）。 使用可安装在一台或多台计算机上的软件，并允许观看实时或录制的视频，使用选择的视频格式导出文件。 请务必为用于允许同时查看多个源的摄像机导出相同的时间窗口和视频持续时间。 请务必定期导出数据，因为如果 DVR/NVR 文件存储容量有限，许多系统将用新数据覆盖旧数据。 运行散香动物的协议偏见评估 在进行实验试验之前，通过组装迷宫来评估Y迷宫的偏差，如下所述，但没有在纸上呈现气味。适应焦点动物，并开始试验。注：根据研究的设计（例如，每次使用相同的焦点动物与对新型焦点动物的测试进行反复测量），偏置试验将确定迷宫本身在设计上不会偏向焦点动物的选择。许多因素导致偏差，如高程、阳光和视觉标记。 如果重新定向或调整迷宫的其他物理方面不能消除侧偏差，则随机随机调整指定在给定试验中接收实验气味的手臂。注：在一定数量的试验中，不偏不倚的迷宫导致任何一只手臂的选择概率为 0.5，并进行了二元测试（图 2）。 试制和Y迷宫组装 在处理动物可以探索的任何表面以避免气味污染时，始终佩戴亚硝酸盐手套。如果创建多个气味痕迹，在试验之间和在试验设置中更换手套。 在干净的表面上准备新的、干净的香味纸（白屠夫纸，至少61厘米宽）。切成适当的长度，使每个部分的纸张可以在 Y 的交界处重叠，并延伸到基地和手臂的末端，以安装在盒子下。 扫过迷宫底部，然后直接用纸或纸和底部之间的边界层（如塑料布）覆盖，以便于清理，如果动物在迷宫中排便或粘液。 通过在底部用马车螺栓穿孔，从一端到另一端工作，以保持表面光滑，从而将纸张固定在原位。重叠在交界处的文件，使基础纸是在上面。 将迷宫的两侧放置在马车螺栓上，但不要将其固定在底部。 插入并固定要测试的试用类型所需的分区（参见单香味 1.3.3 与双香味试验 1.3.4）。 将丙烯酸顶部件滑入槽中，用扁平的头钉固定。 通过将机翼螺母拧紧到车厢螺栓上，确保车底两侧安全。 将干净的手臂盒固定到位，用拇指螺丝固定。使用电缆带固定箱盖。确保门已拆下。 单香味试验注：这些试验的目的是在Y-maze中呈现一条从基地穿过一只手臂的气味痕迹。 在安装丙烯酸顶部之前，固定隔板以阻挡未经处理的手臂。随机选择有香味的手臂（例如，掷硬币，随机数生成器）。 将散香动物放入干净干燥的底箱中。固定底箱盖（如电缆带、螺栓）和门（例如拇指螺丝）。将托持有箱运送到学习外壳，用拇指螺丝将其固定到 Y 迷宫底部的末端。注意：在装载动物之前，确保底箱的门就位。 将动物放在盒子里一组，持续一段时间（例如，60分钟）。取下底箱门，让动物自由进入迷宫。 使用视频源远程监控动物活动（见下文）。动物从底箱到手臂盒后，随着气味的散发，将动物从迷宫中取出。 如果动物在任何盒子内，插入并固定可移动的门，取出盒子，并将动物送回其外壳。 如果动物回到迷宫中，请在迷宫附近等待，直到看到动物返回到盒子，然后取出盒子。注意：蹲下排便防御，并产生报警线索，污染正在测试的气味，所以避免吓到动物。 如果动物没有回到盒子里，慢慢接近迷宫，使用视觉提示（例如，慢手挥舞）鼓励动物进入盒子，然后移开盒子。 清洁和干燥底箱 （1.5.5）。 如果发生排便，用纸巾收集和吸收尽可能多的水分，但不要擦拭以防止传播。 部分拆卸迷宫，以允许拆除内部分区，然后重新组装。清洁隔板（1.5.5）。 继续到第 1.4 节，用于运行焦点动物的协议。 双香味试验注：这些试验的目的是在Y-maze中同时呈现两条不同的气味轨迹，两条气味轨迹都通过各自随机选择的手臂从基地跑开。 在安装丙烯酸顶部之前，固定隔板以阻挡未选定为第一气味的手臂和与被阻塞的手臂相对的底座的一半。 遵循上述程序进行单一气味试验（1.3.3 至 1.3.3.8），但有一个例外。当丙烯酸门被移除（1.3.3.3）时，将半尺寸的门插入侧面的开口，保持阻塞状态，以确保香味动物只能在迷宫的开放部分移动。 部分拆解迷宫，拆除隔板，清洁（1.5.5）。用干净的毛巾晾干。 重新安装隔板，但翻转它们以阻挡迷宫中现在香味的区域。重新安装丙烯酸顶部。 重复步骤 1.3.4.2 为第二个气味铺设动物。 部分拆解迷宫并拆除隔板。重新组装迷宫。 继续到第 1.4 节，用于运行焦点动物的协议。 在白天运行焦点动物的协议 按照步骤 1.3.3.2 到 1.3.3.3 与重点动物计划进行该试验。 使用视频远程监控动物活动。如果在设定的探索时间窗口上观察，则当动物完全从基箱中浮现时启动定时器。 试验结束后，移除动物（1.3.3.4）。 细分和清理 将剩余的箱子从迷宫中分离并拆解所有箱子。在整个拆卸和清洁过程中佩戴新鲜的氮化物手套。 取出丙烯酸顶部件，放在安全位置进行清洁，以避免刮伤或开裂。删除时一定要避免刮伤（必须保持视频监控行为的清晰视场）。拆开迷宫的两侧，放在一边清洗。注意：通过始终保持 Y 迷宫材料的阴影，最大限度地减少划痕和紫外线退化。 以一致的运动移除纸张（和塑料），将其向上滚动以避免底部污染并丢弃。 使用无味的实验室级肥皂和软磨砂刷或微纤维布清洁 Y 迷宫件和所有盒子的所有表面。用同样的肥皂清洁丙烯酸上衣和可拆卸门，但用柔软的海绵或微纤维布防止刮伤。注：鳞状爬行动物中已知的化学信号是脂溶性化合物，用洗涤剂清洗是陆地脊椎动物研究11、12、21中清除聚合物仪器脂质线索和其他气味的标准协议。注：在实地应用中，可能需要卫生规程。如果是这样，用适当的卫生解决方案喷洒迷宫的所有内部表面（地板、墙壁、隔板、丙烯酸片、盒子），让它坐10分钟，然后用微纤维布擦拭。 用干净、潮湿的微纤维毛巾擦拭表面，用水冲洗清洁的部件，避免在冲洗前让肥皂残留物干燥：不要把水倒进迷宫里。 让碎片晾干或用新鲜的微纤维布拍干。 干燥后，如果立即进行另一次试验，则重新组装迷宫片。 2.美国地质调查局（USGS）与国家公园管理局合作进行的Y-maze设置和裂隙定时协议：相对远程的野生捕获缅甸巨蛇测试 注：Y迷宫和密封结构的所有组成部分的计划都提供补充文件2。 Y 迷宫组件和改变美国农业部设计的理由注：描述的Y-迷宫被显著改变，以扩大潜在的研究物种和孤立的条件。垂直深度增加，以适应各种物种，并使用不同的材料和施工方法，以提高户外耐久性和清洁。有关已完成迷宫的可视化，请参阅图 1。有关构建和组装的具体说明，请参阅补充文件 2。 从白色聚丙烯中切割 Y 迷宫组件，并加热焊接所有要永久固定的切割部件（例如迷宫底部和侧壁）。 锚定Y-maze的底部（244厘米L x 122厘米W），由胶合板与甲板螺丝固定在一起，通过铝角支架连接沿迷宫的外侧墙壁底部铆接。 确保 Y-maze 的基座为 120 厘米 L x 42 厘米 W x 23 厘米 H，并且每个外臂侧壁为 120 厘米 L，内臂侧壁为 108 厘米 L（具体方向，参见补充文件 2）。 使用固定在侧壁上的铝角将丙烯酸顶部插入到位，每 30 厘米使用螺丝（有关特定方向，请参阅补充文件 2）。注：在分析试验视频中的视频并提供比例时，定期放置在 Y-maze 侧壁顶端的螺丝也充当静态视觉标记。 确保 Y-maze（基地、手臂）的每个开口在附着在盒子的侧壁末端有一个额外的基板（42 厘米 W x 30 厘米 H），以便基板框架一个中央开口（34 厘米 W x 16 厘米 H;有关特定方向，请参阅补充文件 2）。 使用分区件来限制气味动物的访问（有关特定方向，请参阅补充文件 2）。使用紧固件胶带固定固定板（46 厘米 W x 22 厘米 H）到位。使用简易、易于清洁的重量锚定隔板和板材（例如，装满水的塑料壶;2.3.6：图1）。 确保丙烯酸片构成迷宫的顶部（0.6厘米厚，清晰）。有关特定方向，请参阅补充文件 2。 使用装有滑动门和盖子的不透明盒子，这些盒子很容易固定，以便在Y-maze试验中运输和收集动物（图1）。 修改底部有排水孔的箱子（21.6 厘米 L x 27.9 厘米 W），用小螺丝和螺母安装盖子，并为入口/入口（门）提供单一开口。有关特定方向，请参阅补充文件 2。 使用螺栓、翼螺或锁将盒子面板连接到 Y 迷宫面板上，将盒子固定在 Y 迷宫的末端。注意：当到位时，盒子也会将丙烯酸顶部固定到位。 用于拍摄视频采集的相机设置：请参阅图 1了解摄像机视场的快照。 相机规格：确保项目摄像机可以在可变的光线和温度条件下录制连续视频，以适应皱褶和夜间研究物种。 项目相机安装在外壳的天花板横梁上，确保整个 Y-maze 都能在摄像机的视野内拍摄。提高或降低帐篷的高度，以增加或减少视野（项目摄像机安装在约3米的高度）。确保从相机发射的丙烯酸顶部的红外光反射不会遮挡隔夜镜头中帧的关键部分。 电源规格：确保每个项目摄像机都有足够的电源来录制夜间拍摄的连续视频（约 20 h）。注意：如果没有交流电源，可以使用深循环密封铅酸 12 伏电池（例如，两个 12-V 20-Ah 凝胶电池并行连接）供电。 录制规格：为了最大限度地减少文件存储量，录制质量最低的视频，这些视频仍然足以计数 Y-maze 中的舌笔。注意：高分辨率素材需要大量的存储量，降低分辨率是确保文件大小可控的一种非常有效的方法。 将素材的帧速率（每秒帧，FPS）限制为检测舌弹所需的最小值（例如，记录分辨率为 800 x 450，最大帧速率为 25 FPS，每次试验的帧速率大约为 120 GB）。 获取和处理视频的协议 在每个香味事件（2.3.10）的开始时臂臂相机，并让它连续记录到焦点事件的结束（约20小时）。 每次试用完成后，关闭摄像机并检索 SD 卡 （2.4.4）。将素材传输到所需的存储位置。 由于 SD 卡经常强制录制设备在 5 分钟剪辑中录制素材，因此使用电影处理软件将这些剪辑组合在一起，便于处理。 使用允许可变播放速度和可自定义的前跳间隔的媒体文件审查程序查看素材。注意：如果在视频处理过程中不需要精细的分辨率，则将审查时间从大约 20 小时缩短到最多 1 小时。 运行散香动物的协议注意：由于野生爬行动物的适应时间更长，本节中的步骤大约需要 1.5 天才能完成。 请参阅第 1.3.1 节中的偏见前言，以确保在迷宫中不会发现偏差。 在处理任何表面或研究动物时，要始终佩戴亚硝酸盐手套，以避免气味污染。 在试用适应之前，将香味或焦化动物放入其盒子中至少 24 小时。注意：为了尽量减少压力影响，盒子被留在尽可能靠近迷宫的阴影区域，而不会受到清洁或其他活动的干扰。确保所有测试的动物（香味、焦距）都以这种方式适应。 在干净的表面和足够长度的清洁香味纸上准备新的、干净的香味纸，以在 Y 的交界处重叠，并覆盖整个底部表面（2 个臂纸 = 121.9 厘米;1 个底纸 = 152.4 厘米）。 用遮蔽胶带固定盒子附近的纸张和 Y 形结的末端。 安装隔板，用长隔板阻挡底臂的一半（左侧或右侧），用短隔板阻挡对面手臂的入口。安装障碍物时，不要撕破香味纸。对于大型香味动物，在屏障后面贴一个易于拆卸和清洁的重物，作为防止屏障失灵的支撑物（2.1.1.5）。注意：气味轨迹必须始终从底座的一侧开始，然后交叉到对面的手臂，以便焦点动物的选择清晰。 将丙烯酸顶部滑入原位，一次一节，并确保角度完全相约。使用透明塑料胶带覆盖任何缝隙。 使用翼鼻和/或挂锁连接面板，将手臂盒连接到迷宫上，并确保门被锁上。 日落前两小时，将底箱（包含有香味的动物）连接，并确保所有动作都缓慢而稳定，以尽量减少对动物的压力。 臂臂摄像头，并打开底箱的门，确保用两个桶螺栓锁锁定门到位。离开动物的视线，离开该地区。 3小时后（日落后1小时），注意动物在迷宫中的位置以及环境条件。如果动物在运输途中，请等待，直到它进入盒子。 如果动物在任何盒子里，关闭并固定盒子的门，取出盒子，然后移除动物，小心防止盒子中的防御性气味沉积。 如果动物在迷宫体内一动不动，请使用视觉提示（如长棒或手挥舞）刺激其进入盒子的运动。如果动物遗骸，取出臂箱，以便去除丙烯酸顶部，并手动收集动物并转移到袋子中。注意：在处理大型动物时，应始终佩戴适当的个人防护装备（如防穿刺手套、眼睛保护）。 部分拆解迷宫，以允许拆除内部隔板（避免干扰气味纸），然后重新组装。如果发生排便，用干净的微纤维布收集和吸收尽可能多的，但不要清洗区域。 继续到第 2.4 节，用于运行焦点动物的协议。 运行皱褶焦点动物的议定书注：本节中的步骤大约需要 2 天才能完成，并且必须与第 2.3 节的开始时间相同开始。 在迷宫中运行之前，在盒子里将预定的焦点动物放大至少 24 小时。 在焦点动物适应的最后几个小时，在移动到下一步之前运行散发气味的动物（2.3.9）。注意：时间的气味铺设步骤尽可能接近时间介绍的重点动物迷宫，以减少气味退化。 使用翼螺母和/或挂锁将底箱（包含焦动物）连接到 Y-maze 的底座上。在握住/运输盒子时，使用缓慢、稳定的运动，以尽量减少对焦点动物的压力。 确保两个臂箱门都锁上。开始焦点试验，使用桶螺栓打开和锁定底箱门。离开动物的视线，离开该地区。注：通过野生夜间爬行动物试验，中心动物可以隔夜探索迷宫。 日出后四小时，返回迷宫，按照第2.3.11.1节移除焦点动物。 收集相机 SD 卡，并在需要时为电池充电。从迷宫中丢弃废纸，然后继续清洁（第1.5节）。 图1。美国地质调查局Y迷宫的布局。 在左侧，示意图显示 Y 迷宫的组件，并带有透视比例条。在右侧，摄像机的快照演示了行为记录的视场。请单击此处查看此图的较大版本。