阵列断层扫描工作流程，用于使用扫描电子显微镜有针对性地采集体积信息

以下示例旨在演示推荐工作流的多功能性。案例研究插图是我们很难用任何其他技术获得满意结果的项目。我们选择了成虫果蝇来说明人们在许多类型的样本中可能遇到的典型挑战。这个管状器官长约6mm，横截面500-1000μm，分为具有独特功能和细胞组成的不同区域（图4A）33。根据切片方向，肠道轮廓的尺寸及其在切片上的外观会有所不同。横向或纵向取向的部分相对较大，并且只能将一对部分放置在单个TEM网格上（图2F）。只有一小部分组织可以在FIB中成像，对于SBF-SEM，难度与任何非均质样品相似。AT为此类样品的分析提供了有效的权衡，而扁平包埋有助于ROI定位。仔细修剪选定区域周围多余的树脂（图4B）对于从相关区域有效收集阵列非常重要（图4C）。可以在单个晶圆上按顺序或随机收集数百个切片（图4D）。根据研究问题，样品筛选和获取将需要不同的策略，我们将其任意分为几种场景。为了更有针对性的方式说明不同的场景，我们从不同的研究项目中选择了几个案例研究。 分析许多随机分布的大结构1-10μm范围（图4E）通常，需要超微结构数据来验证由几种实验方法产生的假设，比较标准和实验改变的条件。在这些情况下，通常会在网格上随机收集多个部分，并对其进行筛选以定位和成像感兴趣的区域。这种策略通常不太系统化，仅限于少数分析部分。我们建议从给定的色带中记录数十个/数百个中等分辨率部分的概述（图4D）。对于70nm的典型切片，200个切片将跨越约14μm，其中将包含许多细胞，全部或部分，在半小时内完成。作为第一步，记录整个色带的低分辨率概览，并且概述有助于省略显示制备伪影（例如，褶皱，污垢）的部分。之后，可以使用单个或镶嵌成像手动或直接在截面的选定部分或整个截面上进行手动或自动采集，然后进行拼接（图4E）。之后，可以使用高分辨率参数从所选区域获取图像。例如，线粒体，细胞核和微绒毛可以从这种统计改进的方法中受益（图4Ei-iii）。 分析500-1，000 nm范围内的多个小的，稀疏分布的结构（补充电影1）在这种情况下，无法简单地在低放大倍率概览扫描中识别ROI，并且需要高分辨率图像。在传统的TEM样品中，在找到所需的特征之前，必须对部分进行繁琐的放大和缩小。通常，在统计上，对多个样本中的多个独立位置进行成像比生成单个大体积更相关。在这种情况下，手动获取的复杂性呈指数级增长。虽然一些TEM解决方案可以自动采集或筛选多个网格，但网格的大小和串行切片挑战经常使该方法与许多样品不兼容。对于类似情况，我们生成一个完整的中分辨率图，其中包含多个部分的整体投资回报率，其分辨率足以识别感兴趣的结构。在这个横向筛选步骤中，建议一次跳跃几个部分，目的是在随机接近时至少击中感兴趣的结构的一部分。这在很大程度上取决于结构的整体尺寸：例如，如果结构的整体尺寸为500nm，部分厚度为50nm，则连续至少九个连续部分可能包含感兴趣的结构的一部分。这样，跳过6-7个部分可以有效地在多个区域中找到许多不同类型的结构。自动获取所选部分的已解析镶嵌贴图，可以在获取后仔细筛选这些部分。一旦获得这种高分辨率的地图，就可以裁剪出多个ROI或用于在ROI上定义额外的局部成像区域（补充电影1）。高尔基体，中心粒，连接点，微管，不同类型的囊泡是可能从这种情况中受益的结构的很好的例子（补充电影1）。 分析大样本中稀疏分布的大型ROI（图4F-4H）这种情况涉及罕见的事件，这些事件通常被描述为”大海捞针”，其中问题不在于ROI识别，而在于其定位。对于许多样品，相关方法不是一个有效的选择，但ROI通常具有揭示性的超微结构，并且在局部化时可以以高可靠性进行识别。对于这些样品，必须应用多级采集，从预筛选的样品开始，以中等分辨率进行数十至数百个切片。在此处使用的软件中，有两种不同的策略可用于获取多个部分的图像集：以更高的分辨率录制预览图像或获取具有适当设置的阵列图块集（图4F）。果蝇肠道中的不同特殊细胞类型随机分布（例如茎，肠内分泌细胞），并以随机方向进行薄切片。然而，在筛选使用高分辨率参数从单个部分或作为串行图像集合获得的图像后，可以在视觉上区分它们（图4G）。对齐后，可以使用不同的软件解决方案渲染堆栈（图4H，补充视频2）。 场景1：肠道类器官（图5A）类器官正迅速成为现代生命科学中最前沿的工具之一。这种近生理3D干细胞衍生的器官模型使得对一系列体内生物过程的准确研究成为可能，包括组织更新，对药物的反应和再生医学。最近推出的微型肠管34开辟了新一代类器官技术，与体内组织生理学，细胞类型组成和稳态非常相似，为疾病建模，宿主 – 微生物相互作用和药物发现提供了广阔的视野。然而，当需要超微结构表征时，使用随机样品在如此大的组织中定位不同的细胞类型可能具有挑战性。此外，在可变的”感染”测定中，确保分析揭示影响组织的不同发育阶段至关重要。对于此类研究，样本的统计显着覆盖率是核心，但使用传统的TEM并网方法很难实现。在这种情况下，AT-scenario 1是有益的：可以在晶圆上生成许多连续的部分（图5Aii），并使用低分辨率参数进行筛选，以定位一般感兴趣的区域（图5Aiii;箭头）。可以使用高级采集参数（图5Aiv 和 图5Av）将这些区域作为进一步分析的目标。当检测到相关结构（通常每100-300个截面中一次为5-10个截面的集群）时，很容易将注意力集中在每个感兴趣的结构上并手动获取单个图像，或者使用自动化功能跨多个截面获取图像量。 场景2：果蝇蛹（图5B）研究细胞分裂和控制细胞周期进展的机制对于理解多细胞生物中的标准和改变过程至关重要。存在的信息通常来自单细胞系统;然而，该解决方案缺乏组织中细胞之间3D相互作用的关键背景。果蝇幼虫发育中的背部的单细胞单层是一般上皮细胞与细胞分裂之间相互作用的完美模型35。它是分子和细胞相互作用研究的既定模型，使用荧光显微镜和遗传操作提供的数据的组合。脱落是细胞分裂的最后一步，可确保两个分裂细胞之间的最终分离，并且表征脱落期间发生的结构变化对于我们理解有丝分裂至关重要。然而，notum中的有丝分裂不容易在超微结构水平上定位：与脱落区相比，细胞相对较大（图5B）。脱落区的整体大小与要覆盖的部分的表面之间的比率很大（图5Bi）。尽管使用TEM或SBF-SEM方法36可以定位脱落区，但这项任务是费力的。在这种情况下，可以使用20-40个部分的跳跃的自动中分辨率概览图像来定位分割单元格（图5Bii）。当识别出这样的细胞时，这些部分可以作为更仔细检查附近部分的锚点，并且可以找到并选择许多分裂的细胞进行进一步分析。这样，可以定位并整个脱落区成像（图5Biii）。根据问题的不同，可以收集单个高分辨率图像或3-7个图像序列以覆盖结构的深度（图5Biv）。 场景3：小鼠单核细胞神经元（图5C）小鼠为大脑发育提供了一个完善的模型，并在不同水平上得到了很好的记录，包括EM。尽管不同的自动串行块面方法已被广泛用于研究脑组织，但在某些情况下，AT更适合收集必要的数据。下丘脑是一种成熟的神经科学模型，是大脑中包含多种神经元类型功能的一部分。下丘脑小丘脑细胞代表第三脑室底部的室管膜胶质细胞的特定亚群，具有异常长的过程（高达300μm）和大的端脚（〜5μm）37。这使得它们不方便通过TEM或FIB方法进行分析。当需要定位和分析几个独立的tanycytes时，任务进一步复杂。促进这项任务的方法之一可以是半相关靶向，其中荧光图在固定和嵌入EM之前从荧光标记的样品中获得。通过结合来自荧光样品的位置信息和平埋塑料复制品，对捕获的区域进行切片。之后，可以使用 AT 方案 3：生成高级概览镶嵌图像以显示具有 tanycyte endfeet 簇的区域。随后，软件中的自动化功能用于设置在单个图像或平铺模式下从一个或多个区域采集图像序列。这些图像可以单独分析，作为对齐的堆栈或在此之后渲染。 AT方法的强大功能允许相对轻松地将数据从2D”升级”到3D：地图可从主要采集中获得，并且可以从所选区域及其附近获得体积。生成的堆栈可以对齐并随后呈现。必须事先确定需要哪种分辨率和图像质量才能找到投资回报率。成像应该能够识别ROI，但不能超过此值，因为采集时间与像素停留时间和像素大小的平方反比成比例。 图1：EM样品制备和体积采集的挑战（A）由于样品制备过程中的高重金属浓度和脱水而导致荧光和收缩的损失。（i） 在LM（ii）下观察到的标本的示意图，该标本是为EM准备的同一标本，该标本变得完全不透明，并损失了其体积的10%左右。（B） 样品包埋通常使用环氧树脂或丙烯酸树脂完成。传统模块（i）可以成功地用于不需要特定方向的均质样品。当必须在显微镜下瞄准和定向时，扁平块（ii）是有帮助的，显微镜是一个旨在切片的精确区域，例如，在非均匀样品或相关显微镜程序中。（C）在整个样品体积中，只有有限的部分在单个50nm切片上表示，提供3D样品的2D图像，通常在不熟悉的方向上。（D） 为了说明记录过大体积与精确瞄准的问题，我们选择了三个面为1000，500和50μm的同心立方体，以包括假设的1000 x 500 x 500μm样品（深栗色）。如果用50 nm切片彻底切割这些假设的样品立方体，以覆盖整个体积，则需要总共20，000，10，000和1，000个切片，以及800 tb，100 tb和100 gb（成像分辨率5 nm x 5 nm x 50 nm，8位数据）。这表明了仅为了获取最小必要数量而规划获取EM数据的重要性。（E）以高分辨率覆盖大样品表面积会带来类似于大体积的问题。将多个高分辨率图像拼凑为一个是解决此类问题的有用解决方案。但是，要以10，000x的放大倍率使用2024 x 1048框架覆盖1 mm x 1 mm的表面，将需要大量的瓷砖，这可能变得具有挑战性。此外，如果在切割过程中切片被可变压缩或扭曲，则生成的数据堆栈几乎不可能对齐。请点击此处查看此图的放大版本。 图2：在大支架上直接生成切片阵列的工作流程 （A）为了使用修剪工具进行紧密修剪，块固定在切片机支架内。该步骤有助于确保块的平行侧面，并减少样品周围的空树脂。 （B） 用于AT截面采购的改装刀。一艘大船便于在样品切片和支撑上转移过程中转移截面及其操作。一个大盆地可以操纵截面;排水系统限制了排水步骤中碳带的运动，平坦的底部使支撑的逐渐干燥变得可靠。（C） 将刀，准备切片，将辉光放电的晶圆放置在盆的底部，并将水水平到边缘。刀的结构使针保持嵌入，而不会干扰支撑。（D） 阵列生成，切片机切片区域的顶视图。（i）第一部分通常很容易获得，因为它们彼此粘附并形成规则的丝带。（ii）当向色带中添加更多截面并且变长时，色带将失去稳定性并经常弯曲。保持序列轨迹按顺序组织至关重要，以便为图像采集步骤做准备。（iii）当一条带状部分达到所需长度时，用睫毛小心地将其从刀刃上取下。（四） 水从盆地排出;晶圆留在内部，直到完全风干。这一步是必不可少的，因为它有助于拉直部分并避免形成微褶皱。将晶圆置于60°C的烤箱中至少30分钟，以将部分固定在支撑物上。（E） 具有转移部分的示例晶圆。虽然获得笔直而准确的色带很方便，但在大多数情况下，实际样品可以防止形成这种理想的色带。然而，即使是”草率”的丝带对于大量案例来说也是非常有益的，而”整洁”丝带的重要性将取决于收集这些部分的研究策略。比例尺 1 cm. （F） 带有串行部分的示例插槽网格。即使许多部分被收集在一个网格上，它仍然只是单个晶圆上可以收集的一小部分。掌握网格（特别是狭缝网格）上切片转移所需的技能是掌握电子显微镜样品制备的重要瓶颈。比例尺 500 μm. （G） 无论使用哪种截面采集方法，与并网采集相比，AT 方法的优势在于生成顺序截面的相对容易程度。如果考虑1000 μm x 500 μm样品块，则在2 cm x 4 cm晶圆（i）上安装约100个切片没有问题。插槽网格上相同大小的部分最多只能容纳三个部分/网格（ii）。我们提供了一个缩放图像来显示可能需要多少个网格才能覆盖相同数量的部分，而没有提到在网格上收集串行部分的难度。比例尺 = 1 cm。 请单击此处查看此图的放大版本。 图 3：阵列断层扫描工作流程的关键步骤。 无人值守采集高分辨率图像堆栈的工作流程示意图。所有准备步骤都是自动化的（绿色齿轮符号），不需要逐节手动执行任何操作。图像堆栈可以在任何能够自动刚性或仿射对齐的图像分析软件中对齐。 请点击此处查看此图的放大版本。 图4：以果蝇成虫肠道为示范模型的三种采集场景。（A）剖析的果蝇中肠的图画，有三个主要区域由不同的颜色指定：前部，中间和后部。（B） 修剪过的扁平块，其中肠胃定向进行横向切片。请注意，在含有感兴趣区域（白色矩形）的组织周围仔细平衡空树脂量。（C）横向连续段漂浮在AT刀的盆地内的水面上。所有图像均使用具有反对比度的镜面探测器在次级电子扫描电镜模式下采集。（D） 晶圆上横向串行部分的拼接马赛克图像。比例尺是1000μm.（E）横截面穿过果蝇肠道。比例尺 20 μm。该图像是7 x 7中档图像的拼接马赛克。插图 – 特定感兴趣区域的更高放大倍率和分辨率图像：（ii）细胞核，（iii）刷子边界和（i）线粒体。比例尺 5 μm 适用于所有。（F） 一个穿过肠道的横向截面的中程图像，其目标是发育中细胞的位置（正方形）。比例尺为 20 μm。（G） 根据在分析面板 F 中存在的部分期间的局部区域收集的串行切片的目标阵列。比例尺为 10 μm。（H） 3D 模型是根据从面板 G 中的目标串行采集中获得的 50 个部分堆栈序列呈现的。请单击此处查看此图的放大版本。 图5：AT应用场景的案例研究（A）肠道类器官中不同细胞结构的定位。（i） 嵌入式硅微芯片。比例尺 = 200 μm. （ii） 通过芯片中央部分的 127 个横截面的拼接马赛克图像。比例尺= 1500μm（iii）通过肠道类器官部分的完整横向截面的四个低分辨率图像。箭头指向潜在的感兴趣地点。（iv）不同的ROI，针对选择用于进一步分析的低分辨率显微照片。比例尺= 10μm.（v）目标感染细胞的高分辨率图像。如果需要，对相邻部分中的同一区域进行分析可以提供有针对性的 3D 信息。比例尺 = 5 μm. （B） 黑腹果蝇蛹蛹的中体定位。（i） 解剖果蝇蛹的示意图。Notum在去除保护性角质层的部分（棕色）后暴露于解剖（米色）。黑线表示剖面的方向（ii）穿过图中显示的区域的横截面。该图像将 3×7 连续拍摄的高分辨率 SEM 图像拼接到一个镶嵌面板上。黑色矩形分隔包含分隔单元格的区域。比例尺为15μm.（iii）从面板ii中分频的单元格上的缩放图像。在这种放大倍率和分辨率下，中体是显而易见的（白色箭头）。分析整个部分以找到分裂的单元格。在横向筛选步骤中，以20-30个截面间隔在不同的切片带之间跳跃，可以定位许多分裂的细胞对。当分割细胞被定位时，比例尺为5μm（iv），从中间体周围的四个部分收集的中体的顺序图像，在面板（iii）中以黄色方块分隔。比例尺为1μm.（C）Tanycytes端脚定位在小鼠下丘脑。（一） 振动切片的荧光图像。Tanycytes表达tdTomato荧光蛋白（红色）。白色矩形分隔感兴趣区域。比例尺500μm.（ii）为EM制备的相同振动切片机部分将根据来自面板（i）的荧光信息的间接相关性在感兴趣区域周围仔细修剪。白色虚线表示超薄切片的区域。两块面板的比例尺均为 50 μm。（iii）在感兴趣区域通过振动切片的横截面。SEM镶嵌图像由75个拼接图像组成。通过横向筛查靶向几个切片，并使用相似的参数进行成像。这些部分被”离线”分析，以找到ROI – tanycyte endfeet。黑色矩形表示包含 tanycyte 端脚的区域。本节将作为进一步分析的锚点。比例尺为15μm.（iv）血管周围单胞细胞端脚的高分辨率，高放大倍率图像。在一个截面上对ROI进行初始定位后，z序列从上游的相邻截面收集到锚点截面（图iii）。比例尺 5 μm.请单击此处查看此图的放大版本。 图6：超切片术，切片收集和切片存储过程中的问题可能导致伪影。 大部分空树脂从组织中分离并折叠在自身（棕褐色）上。虚线黑框表示用于包含整个部分的区域。比例尺500μm.（B）在50nm厚的斑马鱼切片表面上的小的局部褶皱。比例尺1μm（C）在70nm小鼠大脑切片的表面上的刀痕。比例尺5μm.（D）晶圆表面上的头发（星号），部分覆盖斑马鱼肌肉部分。在黄色中，组织是分析的目标。粉红色，用于作为受影响区域大小的参考的细胞。比例尺50μm.（E）斑马鱼在右下角有皱纹（黑色箭头），其中致密的神经组织（蓝色阴影）与较软的肌肉组织和空树脂（黑色箭头）接壤。比例尺10μm.（F）对50张图像的堆叠进行体积分割，如E所示，显示该区域在大多数部分都显示出皱纹。虚线多边形勾勒出 G. 比例尺 10 μm. （G） XY 视图中显示的区域，其体积分割与 F 中相同，将褶皱显示为块右半部分的短黑色笔触。请注意，组织其余部分的堆叠对齐不受皱纹的影响。比例尺5μm.（H）XZ投影与G中的相同区域，显示所有50个部分的皱纹。比例尺 5 μm.请单击此处查看此图的放大版本。 补充影片1：通过果蝇前中肠横截面的高分辨率蒙太奇图像。倒置 SE-MD 扫描电镜图像的镶嵌图像。以5 nm分辨率自动采集352个单独的图像图块，并拼接以呈现整个横截面。可以放大以获取更多详细信息，并使用相同的图像获得数据的详尽覆盖。紧密的连接，微管，不同类型的囊泡可以在放大时。比例尺为10μm，请点击这里下载这部电影。 补充电影2： 果蝇 肠道细胞渲染。 五十个对齐的马赛克图像，在分裂肠细胞的区域。细胞边界（蓝色、绿松石色和橙色）和细胞核（白色）的 IMOD 渲染。请按此下载短片。 补充材料。 请点击此处下载此文件。