使用下一代测序的 T 和 B 细胞受体免疫再剧目分析
Summary
当前协议描述了从血液样本和肠道活检中分离脱氧核糖核酸的方法、用于下一代测序的 TCR® 和 IGH PCR 库的生成、NGS 运行的性能和基本数据分析。
Abstract
免疫记忆是适应性免疫的标志，由T和B淋巴细胞编排。在循环和不同的器官中，有数十亿个独特的T细胞和B细胞克隆，每个克隆可以结合特定的抗原，导致增殖、分化和/或细胞因子分泌。T细胞和B细胞中巨大的异质性是由不同基因片段的随机重组产生的。近十年来开发的下一代测序技术，使T和B细胞受体免疫剧目能够史无前例地深入观察。对各种炎症条件、免疫缺陷、感染和恶性肿瘤的研究表明，免疫资源在克隆性、基因使用和生物物理特性方面发生了显著变化，为适应性免疫反应在不同疾病中的作用提供了重要的见解。
在这里，我们为来自血液和组织的T细胞和B细胞的免疫剧目NGS提供详细的协议。我们通过图书馆准备、NGS测序仪测序和基本分析，提出从 DNA 分离开始的管道。这种方法能够在核苷酸或氨基酸水平上探索特定的T和B细胞，从而能够识别淋巴细胞种群的动态变化和不同疾病的多样性参数。该技术正在慢慢进入临床实践，具有识别新型生物标志物、风险分层和精密医学的潜力。
Introduction
自适应免疫系统由T和B淋巴细胞组成，利用免疫记忆识别以前遇到的抗原并启动快速反应。淋巴细胞在骨髓中生成，在胸腺（T细胞）或骨髓（B细胞）中成熟。T细胞受体 （TCR） 和 B 细胞受体 （BCR） 都显示独特的配置，允许识别特定的抗原。在平衡中，T细胞和B细胞不断循环和测量抗原呈现细胞上出现的数万亿种不同的肽。TCR 或 BCR 结对具有高亲和力的特定抗原，以及适当的共同刺激，导致细胞活化，导致细胞因子分泌、克隆扩张和抗体生成，在 B 细胞的情况下。
不同T或B细胞的巨大阵列统称为免疫剧目，能够识别无数不同的表皮。为了产生如此庞大的剧目，不同基因片段的随机组装过程非常复杂，产生几乎无穷无尽的受体组合，可以结合独特的抗原1。这个过程称为V（D）J重组，包括不同变量（V）、多样性（D）和连接（J）基因的重新排列，同时在2号路口随机删除和插入核苷酸。
几十年来，适应性免疫系统的架构一直让不同领域的科学家感兴趣。过去，桑格测序、互补确定区域 3 （CDR3） 光谱和流动细胞测量用于描述免疫剧目，但分辨率较低。在过去十年中，下一代测序 （NGS） 方法的进步使人们能够深入了解个人 TCR 和 BCR 剧目3、4的特征和组成。这些高通量系统 （HTS） 序列和处理数百万重新排列的 TCR 或 BCR 产品，并允许高分辨率分析核苷酸或氨基酸水平的特定 T 和 B 细胞。NGS 提供了一个新的策略来研究健康和疾病的免疫剧目。利用HTS的研究表明，在自身免疫性疾病5、原发性免疫力6、7和恶性肿瘤（如急性骨髓性白血病8）中，TCR和BCR的病变。使用NGS，我们和其他人已经显示寡头球扩大特定的T和B细胞克隆，在炎症性肠病（IBD）患者，包括溃疡性结肠炎和克罗恩病9，10，11，12，13，14。总的来说，来自不同领域的研究表明，剧目的变化在免疫介质紊乱的发病机理中起着至关重要的作用。
当前协议描述了从肠道活检和血液中分离脱氧核糖核酸的方法、为 NGS 生成 TCR® 和 IGH PCR 库以及测序运行的性能。我们还提供免疫剧目数据分析的基本步骤。此协议也适用于 TCR®、TCRγ和 IGL 库的生成。只要使用组织特定的消化方案，该方法还与其他器官（如淋巴结、肿瘤、突触液、脂肪组织等）兼容。
Protocol
这项研究得到了谢巴医疗中心机构审查委员会的批准，并获得了所有参与主体的书面同意。 1. DNA分离和量化 肠道活检的消化和细胞裂解 检索肠道活检，无论是新收集的还是储存在-20°C或-80°C的活检。 如果使用冷冻活检，在冰上解冻。 在无菌的1.7mL微离心管中加入600微L核裂解溶液，在冰上冷却。 将活检放入带裂解溶液的微中性管中，在 65 °C 下…
Representative Results
在此，我们描述了一种从肠道组织和血液中分离DNA的方法，NGS的库的准备，以及免疫排泄测序测序运行的基本步骤。运行将生成 fastq 文件，可进一步转换为 fasta 文件，用于国际免疫基因 （IMGT） /HighV-QUEST 平台。此 HTS 在核苷酸级别15上执行和管理数万个重新排列的 TCR® 和 IGH 序列的许多分析。IMGT/高V-QUEST 能够分析健康和疾病中的不同 TCR 和 IGH 剧目。这可以导致新的”疾病特异性…
Discussion
B和T淋巴细胞的丰度和功能的变化经常遇到不同的恶性肿瘤18，慢性炎症性疾病（如溃疡性结肠炎和类风湿关节炎）10，19，并在各种免疫缺陷17，20。当前方法利用 NGS 促进对 TCR 和 BCR 剧目的深入观察，从而能够检测 T 和 B 细胞克隆的细微变化、克隆共享、V（D）J 基因的使用以及 B 细胞体细?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
没有。
Materials
| 2-propanol | Sigma | I9516-500ML | |
| 1.7 mL micro-centrifuge tubes | Axygen | 8187631104051 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Greiner | 188261 | |
| Absolute ethanol | Merck | 1.08543.0250 | |
| Amplitaq Gold | Thermo Fisher | N8080241 | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Heat block | Bioer | Not applicable | |
| High Sensitivity D1000 Sample Buffer | Agilent | 5067-5603 | For Tapestation |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | For Tapestation. Tubes sold seperately |
| Lymphotrack Assay kit | Invivoscribe | TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019 | Each includes 24 indexes |
| MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle) | Illumina | MS-102-2003 | Includes standard flow cell type and all reagents required |
| MiSeq Sequencer | Illumina | SY-410-1003 | |
| PCR strips | 4titude | 4ti-0792 | |
| Proteinase K | Invitrogen | EO0491 | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher | Q33226 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32854 | Includes buffer, dye, standards, and specialized tubes |
| Shaker | Biosan | Not applicable | |
| Tapestation 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2940CA | |
| ultra pure water | Bio-lab | 7501 | |
| Wizard DNA isolation kit | Promega | A1120 | Includes cell lysis solution, nuclei lysis solution, and protein precipitation buffer |
References
- Bassing, C. H., Swat, W., Alt, F. W. The mechanism and regulation of chromosomal V(D)J recombination. Cell. 109, 45-55 (2002).
- Roth, D. B. V(D)J Recombination: Mechanism, Errors, and Fidelity. Microbiology Spectrum. 2 (6), (2014).
- Heather, J. M., Ismail, M., Oakes, T., Chain, B. High-throughput sequencing of the T-cell receptor repertoire: pitfalls and opportunities. Brief Bioinformatics. 19 (4), 554-565 (2018).
- Pabst, O., Hazanov, H., Mehr, R. Old questions, new tools: does next-generation sequencing hold the key to unraveling intestinal B-cell responses. Mucosal Immunology. 8 (1), 29-37 (2015).
- Bashford-Rogers, R. J. M., Smith, K. G. C., Thomas, D. C. Antibody repertoire analysis in polygenic autoimmune diseases. Immunology. 155 (1), 3-17 (2018).
- Lee, Y. N., et al. Characterization of T and B cell repertoire diversity in patients with RAG deficiency. Science Immunology. 1 (6), (2016).
- Werner, L., et al. Alterations in T and B Cell Receptor Repertoires Patterns in Patients With IL10 Signaling Defects and History of Infantile-Onset IBD. Frontiers Immunology. 11, 109 (2020).
- Zhang, J., et al. Immune receptor repertoires in pediatric and adult acute myeloid leukemia. Genome Medicine. 11 (1), 73 (2019).
- Chapman, C. G., et al. Characterization of T-cell Receptor Repertoire in Inflamed Tissues of Patients with Crohn’s Disease Through Deep Sequencing. Inflammatory Bowel Diseases. 22 (6), 1275-1285 (2016).
- Werner, L., et al. Altered T cell receptor beta repertoire patterns in pediatric ulcerative colitis. Clinical and Experimental Immunology. 196 (1), 1-11 (2019).
- Bashford-Rogers, R. J. M., et al. Analysis of the B cell receptor repertoire in six immune-mediated diseases. Nature. 574 (7776), 122-126 (2019).
- Wu, J., et al. Expanded TCRbeta CDR3 clonotypes distinguish Crohn’s disease and ulcerative colitis patients. Mucosal Immunology. 11 (5), 1487-1495 (2018).
- Rosati, E., et al. Identification of disease-associated traits and clonotypes in the T-cell receptor repertoire of monozygotic twins affected by inflammatory bowel diseases. Journam of Crohn’s and Colitis. , (2019).
- Allez, M., et al. T cell clonal expansions in ileal Crohn’s disease are associated with smoking behaviour and postoperative recurrence. Gut. 68 (11), 1961-1970 (2019).
- Li, S., et al. IMGT/HighV QUEST paradigm for T cell receptor IMGT clonotype diversity and next generation repertoire immunoprofiling. Nature Communications. 4, 2333 (2013).
- H, I. J., et al. Strategies for B-cell receptor repertoire analysis in primary immunodeficiencies: from severe combined immunodeficiency to common variable immunodeficiency. Frontiers Immunology. 6, 157 (2015).
- Ghraichy, M., Galson, J. D., Kelly, D. F., Truck, J. B-cell receptor repertoire sequencing in patients with primary immunodeficiency: a review. Immunology. 153 (2), 145-160 (2018).
- Zhuang, Y., et al. Application of immune repertoire sequencing in cancer immunotherapy. International Immunopharmacology. 74, 105688 (2019).
- Liu, X., et al. T cell receptor beta repertoires as novel diagnostic markers for systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis. Annual Rheumatic Diseases. 78 (8), 1070-1078 (2019).
- Wong, G. K., Heather, J. M., Barmettler, S., Cobbold, M. Immune dysregulation in immunodeficiency disorders: The role of T-cell receptor sequencing. Journal of Autoimmunity. 80, 1-9 (2017).
- Delhalle, S., Bode, S. F. N., Balling, R., Ollert, M., He, F. Q. A roadmap towards personalized immunology. NPJ System Biology and Applications. 4, 9 (2018).
- Laubli, H., et al. The T cell repertoire in tumors overlaps with pulmonary inflammatory lesions in patients treated with checkpoint inhibitors. Oncoimmunology. 7 (2), 1386962 (2018).
- Hogan, S. A., et al. Peripheral Blood TCR Repertoire Profiling May Facilitate Patient Stratification for Immunotherapy against Melanoma. Cancer Immunology Research. 7 (1), 77-85 (2019).
- Aversa, I., Malanga, D., Fiume, G., Palmieri, C. Molecular T-Cell Repertoire Analysis as Source of Prognostic and Predictive Biomarkers for Checkpoint Blockade Immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), (2020).
- Hirsch, P., et al. Precision and prognostic value of clone-specific minimal residual disease in acute myeloid leukemia. Haematologica. 102 (7), 1227-1237 (2017).
- De Simone, M., Rossetti, G., Pagani, M. Single Cell T Cell Receptor Sequencing: Techniques and Future Challenges. Frontiers Immunology. 9, 1638 (2018).
- Zemmour, D., et al. Single-cell gene expression reveals a landscape of regulatory T cell phenotypes shaped by the TCR. Nature Immunology. 19 (3), 291-301 (2018).
- Zheng, C., et al. Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing. Cell. 169 (7), 1342-1356 (2017).
Cite This Article
Werner, L., Dor, C., Salamon, N., Nagar, M., Shouval, D. S. T and B Cell Receptor Immune Repertoire Analysis using Next-generation Sequencing. J. Vis. Exp. (167), e61792, doi:10.3791/61792 (2021).