Isolamento e Análise de Lipoproteínas plasmáticas por Ultracentrifugação
Summary
Vários métodos têm sido utilizados para analisar lipoproteínas plasmáticas; no entanto, a ultracentrifugação ainda é um dos métodos mais populares e confiáveis. Aqui, descrevemos um método sobre como isolar as lipoproteínas do plasma usando ultracentrifugação de densidade sequencial e como analisar as apolipoproteínas para fins diagnósticos e de pesquisa.
Abstract
A análise de lipoproteínas plasmáticas e apolipoproteínas é parte essencial para o diagnóstico de dislipidemia e estudos de metabolismo lipídico e aterosclerose. Embora existam vários métodos para analisar lipoproteínas plasmáticas, a ultracentrifugação ainda é um dos métodos mais populares e confiáveis. Devido ao seu procedimento de separação intacto, as frações de lipoproteína isoladas por este método podem ser utilizadas para análise de lipoproteínas, apolipoproteínas, proteomes e estudo funcional de lipoproteínas com células cultivadas in vitro. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para isolar sete frações de lipoproteína, incluindo VLDL (d<1.006 g/mL), IDL (d=1,02 g/mL), LDLs (d=1,04 e 1,06 g/mL), HDLs (d=1,08, 1,10, e 1,21 g/mL) do plasma de coelho usando ultracentrifugação flutuante sequencial. Além disso, apresentamos aos leitores como analisar apolipoproteínas como apoA-I, apoB e apoE por SDS-PAGE e mancha ocidental e mostrar resultados representativos de perfis de lipoproteína e apolipoproteína usando modelos de coelho hiperlipidêmica. Este método pode se tornar um protocolo padrão tanto para médicos quanto cientistas básicos analisarem as funções de lipoproteína.
Introduction
A dislipidemia é o principal fator de risco da doença aterosclerótica no mundo. Altos níveis de lipoproteínas de baixa densidade (LDLs) e baixos níveis de lipoproteínas de alta densidade (HDLs) estão intimamente associados a um alto risco de doença cardíaca coronariana (CHD)1,2. No cenário clínico, tanto o LDL-colesterol (LDL-C) quanto o HDL-colesterol (HDL-C) são medidos rotineiramente usando um analisador automatizado em um laboratório clínico3,4. Apesar disso, é essencial analisar os perfis de lipoproteína em detalhes para o diagnóstico de dislipidemia e o estudo do metabolismo lipídico e da aterosclerose em animais humanos e experimentais. Vários métodos foram relatados para analisar lipoproteínas plasmáticas, como ultracentrifugação, cromatografia de exclusão de tamanho [cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC) e cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC)], eletrofose por géis de agarose e poliacrilamida, ressonância magnética nuclear e precipitação química seletiva usando polianões e cára divalentes ou outros produtos químicos. Na década de 1950, o grupo de Havel propôs pela primeira vez o conceito de lipoproteínas definidas por densidades usando ultracentrifugação e as classificou em chylomicrons (CM), lipoproteínas de baixa densidade (VLDL), lipoproteínas de densidade intermediária (IDL), LDL e HDL5 e posteriormente, o método foi modificado por outros grupos6,7. Até agora, a ultracentrifugação é o método mais popular e confiável, enquanto o protocolo prático ainda não está disponível. Neste artigo, tentamos descrever um protocolo fácil de usar para isolar uma pequena escala de plasma usando ultracentrifugação flutuante de densidade sequencial originalmente descrita anteriormente8. Isolamento de sete frações de lipoproteína plasmáticas [VLDL (d<1,006 g/mL), IDL (d=1,02 g/mL), LDLs (d=1,04 e 1,06 g/mL), HDLs (d=1,08, 1.10, e 1,21 g/mL)] permite que os pesquisadores façam uma análise extensiva das lipoproteínas e suas apolipoproteínas composicionais9,10,11. As sete lipoproteínas de densidade consecutiva podem ser usadas para analisar funções de lipoproteína e também servir para estratégias in vitro baseadas em células. Este protocolo deve ser útil tanto para o diagnóstico clínico quanto para a pesquisa básica. Aqui usamos o plasma de coelho como exemplo para demonstrar essa técnica, enquanto o plasma de outras espécies pode ser aplicado da mesma forma.
Protocol
Representative Results
Discussion
A hiperlipidemia é um dos fatores de risco mais importantes da doença aterosclerótica. Assim, a análise de lipoproteínas plasmáticas não é apenas essencial para o diagnóstico de pacientes com dislipidemia, mas também importante para a investigação de mecanismos moleculares de metabolismo de lipoproteína e aterosclerose. Neste estudo, descrevemos o protocolo de isolamento e análise de lipoproteínas plasmáticas que podem ser aplicadas nos laboratórios onde a ultracentrifugação está disponível. As infor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado em parte por uma bolsa de pesquisa do JSPS KAKENHI Grant Number JP 20K08858, a National Natural Science Foundation of China (nº 81941001 e 81770457), JSPS-CAS sob o Programa Cooperativo de Pesquisa Japão-China.
Materials
| 22-gauge needle | Terumo | NN-2232S | For blood collection |
| 96-well microplate | greiner bio-one | 655101 | For lipids measurment |
| Anti-apolipoprotein A-I antibody | LifeSpan BioSciences | LS-C314186 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein B antibody | ROCKLAND | 600-101-111 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein E antibody | Merck Millipore | AB947 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| CBB staining kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 299-50101 | For apolipoprotein analysis |
| Centrifuge | HITACHI | himac CF15RN | |
| Closure | Spectrum | 132736 | For lipoprotein dialysis |
| Dialysis tubing | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 043-30921 | For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000 |
| Dry heat block | Major Science | MD-01N | For SDS-PAGE sample preparation |
| ECL Western blotting detection reagents | GE Healthcare | RPN2209 | For Western blotting |
| Electrophoresis Chamber | BIO-RAD | Mini-PROTEAN Tetra Cell | |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 345-01865 | For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM) |
| Filter paper | ADVANTEC | 590 | For Western blotting |
| Fixed angle ultracentrifuge rotor | BECKMAN COULTER | 357656 | TLA-120.2 |
| Fixing solution | For SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid) | ||
| Immun-Blot PVDF menbrane | BIO-RAD | 1620177 | For Western blotting |
| Lumino image analyzer | GE Healthcare | For Western blotting, ImageQuant LAS 4000 | |
| Magnetic stirrer | ADVANTEC | SR-304 | For lipoprotein dialysis |
| Microplate reader iMARK | BIO-RAD | For lipids measurment | |
| Microtube | INA-OPTIKA | SC-0150 | |
| Orbital agitator USBDbo | Stovall Life Science | ||
| Peroxidase congugated anti goat IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 705-035-003 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Peroxidase congugated anti mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Phospholipids assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 433-36201 | For lipids measurment |
| Polycarbonate ultracentrifuge Tubes | BECKMAN COULTER | 343778 | |
| Potassium Bromide | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 168-03475 | For density solution |
| Power Supply | BIO-RAD | For SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC | |
| Protein standards Precidion Plus Protein Dual Xtra | BIO-RAD | 161-0377 | For SDS-PAGE and Western blotting |
| Rabbit restrainer | Natsume Seisakusho | KN-318 | For blood collection |
| Rotor | HITACHI | T15A43 | |
| SDS-PAGE running buffer | 25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS | ||
| SDS-PAGE sample buffer (2x) | 0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol | ||
| SDS-polyacrylamide gel | 4-20% gradient polyacrylamide gel | ||
| Skim milk powder | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-12865 | For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS) |
| Total cholesterol assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 439-17501 | For lipids measurment |
| Triglyicerides assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 432-40201 | For lipids measurment |
| Tube slicer for thick-walled tube | BECKMAN COULTER | 347960 | For lipoprotein isolation |
| Tween 20 | SIGMA-ALDRICH | P1379 | For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS) |
| Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A95761 | Optima MAX-TL |
| Western blotting wet transfer system | BIO-RAD | Mini Trans-Blot Cell |
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