Isolierung und Analyse von Plasmalipoproteinen durch Ultrazentrifugation
Summary
Mehrere Methoden wurden zur Analyse von Plasma-Lipoproteinen verwendet; Ultrazentrifugation ist jedoch nach wie vor eine der beliebtesten und zuverlässigsten Methoden. Hier beschreiben wir eine Methode, wie Lipoproteine aus Plasma mit sequenzieller Dichte-Ultrazentrifugation isoliert werden und wie die Apolipoproteine sowohl für diagnostische als auch für Forschungszwecke analysiert werden können.
Abstract
Die Analyse von Plasmalipoproteinen und Apolipoproteinen ist ein wesentlicher Bestandteil für die Diagnose von Dyslipidämie und Studien des Fettstoffwechsels und der Arteriosklerose. Obwohl es mehrere Methoden zur Analyse von Plasma-Lipoproteinen gibt, ist die Ultrazentrifugation immer noch eine der beliebtesten und zuverlässigsten Methoden. Aufgrund seines intakten Trennverfahrens können die mit dieser Methode isolierten Lipoproteinfraktionen zur Analyse von Lipoproteinen, Apolipoproteinen, Proteomen und funktionellen Untersuchungen von Lipoproteinen mit kultivierten Zellen in vitro verwendet werden. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll zur Isolierung von sieben Lipoproteinfraktionen, einschließlich VLDL (d<1.006 g/ml), IDL (d=1,02 g/ml), LDLs (d=1,04 und 1,06 g/ml), HDLs (d=1,08, 1,10 und 1,21 g/ml) aus Kaninchenplasma unter Verwendung sequenzieller schwimmender Ultrazentrifugation. Darüber hinaus stellen wir den Lesern vor, wie man Apolipoproteine wie ApoA-I, ApoB und ApoE von SDS-PAGE und Western Blotting analysiert und repräsentative Ergebnisse von Lipoprotein- und Apolipoproteinprofilen mit hyperlipidemischen Kaninchenmodellen zeigt. Diese Methode kann ein Standardprotokoll für Ärzte und Grundlegende Wissenschaftler werden, um Lipoproteinfunktionen zu analysieren.
Introduction
Dyslipidämie ist der Hauptrisikofaktor für atherosklerotische Erkrankungen in der Welt. Hohe Konzentrationen von Lipoproteinen mit geringer Dichte (LDLs) und niedrige Konzentrationen von Lipoproteinen mit hoher Dichte (HDLs) sind eng mit einem hohen Risiko für koronare Herzerkrankungen (CHD)1,2verbunden. Im klinischen Umfeld werden sowohl LDL-Cholesterin (LDL-C) als auch HDL-Cholesterin (HDL-C) routinemäßig mit einem automatisierten Analysator in einem klinischenLabor3,4gemessen. Trotzdem ist es wichtig, Lipoproteinprofile im Detail für die Diagnose von Dyslipidämie und die Untersuchung des Fettstoffwechsels und der Arteriosklerose bei menschlichen und experimentellen Tieren zu analysieren. Es wurden mehrere Methoden zur Analyse von Plasmalipoproteinen wie Ultrazentrifugation, Größenausschlusschromatographie [schnelle Proteinflüssigkeitschromatographie (FPLC) und Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)], Elektrophorese durch Agarose und Polyacrylamidgele, Kernspinresonanz und selektive chemische Ausfällung mit Polyanionen und divalenten Kationen oder anderen Chemikalien beschrieben. In den 1950er Jahren schlug Havels Gruppe erstmals das Konzept der Lipoproteine vor, die durch Dichten mittels Ultrazentrifugation definiert wurden, und klassifizierte sie in Chylomicrons (CM), Lipoproteine mit sehr niedriger Dichte (VLDL), Lipoproteine mit mittlerer Dichte (IDL), LDL und HDL5 und später wurde die Methode von anderen Gruppen6,7weiter modifiziert. Bisher ist ultrazentrifugation die beliebteste und zuverlässigste Methode, während das praktische Protokoll noch nicht verfügbar ist. In diesem Artikel haben wir versucht, ein benutzerfreundliches Protokoll zur Isolierung eines kleinen Plasmamaßstabs mit sequenzieller Dichte schwebender Ultrazentrifugation zu beschreiben, die ursprünglichzuvor beschriebenwurde 8 . Isolierung von sieben Plasma-Lipoproteinfraktionen [VLDL (d<1.006 g/ml), IDL (d=1,02 g/ml), LDLs (d=1,04 und 1,06 g/ml), HDLs (d=1,08, 1.10 und 1.21 g/mL)] ermöglicht es den Forschern, eine umfassende Analyse sowohl der Lipoproteine als auch ihrer kompositorischen Apolipoproteine9,10,11zu machen. Die intakten sieben aufeinanderfolgenden Dichte-Lipoproteine können zur Analyse von Lipoproteinfunktionen und auch zur Analyse zellbasierter In-vitro-Strategien verwendet werden. Dieses Protokoll sollte sowohl für die klinische Diagnose als auch für die Grundlagenforschung nützlich sein. Hier haben wir Kaninchenplasma als Beispiel verwendet, um diese Technik zu demonstrieren, während Plasma von anderen Arten auf die gleiche Weise angewendet werden kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hyperlipidämie ist einer der wichtigsten Risikofaktoren für atherosklerotische Erkrankungen. Daher ist die Analyse von Plasmalipoproteinen nicht nur für die Diagnose von Dyslipidämie-Patienten wichtig, sondern auch wichtig für die Untersuchung molekularer Mechanismen des Lipoproteinstoffwechsels und der Arteriosklerose. In dieser Studie haben wir das Protokoll der Isolierung und Analyse von Plasma-Lipoproteinen beschrieben, das in Laboratorien angewendet werden kann, in denen Ultrazentrifugation verfügbar ist. Die …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde teilweise durch ein Forschungsstipendium von JSPS KAKENHI Grant Number JP 20K08858, der National Natural Science Foundation of China (Nr. 81941001 und 81770457), JSPS-CAS im Rahmen des Japan-China Research Cooperative Program unterstützt.
Materials
| 22-gauge needle | Terumo | NN-2232S | For blood collection |
| 96-well microplate | greiner bio-one | 655101 | For lipids measurment |
| Anti-apolipoprotein A-I antibody | LifeSpan BioSciences | LS-C314186 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein B antibody | ROCKLAND | 600-101-111 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein E antibody | Merck Millipore | AB947 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| CBB staining kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 299-50101 | For apolipoprotein analysis |
| Centrifuge | HITACHI | himac CF15RN | |
| Closure | Spectrum | 132736 | For lipoprotein dialysis |
| Dialysis tubing | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 043-30921 | For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000 |
| Dry heat block | Major Science | MD-01N | For SDS-PAGE sample preparation |
| ECL Western blotting detection reagents | GE Healthcare | RPN2209 | For Western blotting |
| Electrophoresis Chamber | BIO-RAD | Mini-PROTEAN Tetra Cell | |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 345-01865 | For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM) |
| Filter paper | ADVANTEC | 590 | For Western blotting |
| Fixed angle ultracentrifuge rotor | BECKMAN COULTER | 357656 | TLA-120.2 |
| Fixing solution | For SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid) | ||
| Immun-Blot PVDF menbrane | BIO-RAD | 1620177 | For Western blotting |
| Lumino image analyzer | GE Healthcare | For Western blotting, ImageQuant LAS 4000 | |
| Magnetic stirrer | ADVANTEC | SR-304 | For lipoprotein dialysis |
| Microplate reader iMARK | BIO-RAD | For lipids measurment | |
| Microtube | INA-OPTIKA | SC-0150 | |
| Orbital agitator USBDbo | Stovall Life Science | ||
| Peroxidase congugated anti goat IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 705-035-003 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Peroxidase congugated anti mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Phospholipids assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 433-36201 | For lipids measurment |
| Polycarbonate ultracentrifuge Tubes | BECKMAN COULTER | 343778 | |
| Potassium Bromide | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 168-03475 | For density solution |
| Power Supply | BIO-RAD | For SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC | |
| Protein standards Precidion Plus Protein Dual Xtra | BIO-RAD | 161-0377 | For SDS-PAGE and Western blotting |
| Rabbit restrainer | Natsume Seisakusho | KN-318 | For blood collection |
| Rotor | HITACHI | T15A43 | |
| SDS-PAGE running buffer | 25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS | ||
| SDS-PAGE sample buffer (2x) | 0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol | ||
| SDS-polyacrylamide gel | 4-20% gradient polyacrylamide gel | ||
| Skim milk powder | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-12865 | For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS) |
| Total cholesterol assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 439-17501 | For lipids measurment |
| Triglyicerides assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 432-40201 | For lipids measurment |
| Tube slicer for thick-walled tube | BECKMAN COULTER | 347960 | For lipoprotein isolation |
| Tween 20 | SIGMA-ALDRICH | P1379 | For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS) |
| Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A95761 | Optima MAX-TL |
| Western blotting wet transfer system | BIO-RAD | Mini Trans-Blot Cell |
References
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