Combinazione dell'ibridazione in situ a fluorescenza multiplex con immunoistochimica fluorescente su sezioni cerebrali di topo fresche, congelate o fisse
Summary
Questo protocollo descrive un metodo per combinare l’ibridazione in situ a fluorescenza (FISH) e l’immunoistochimica a fluorescenza (IHC) in sezioni cerebrali di topo sia fresche congelate che fisse, con l’obiettivo di ottenere FISH multimarca e segnale IHC di fluorescenza. IHC ha preso di mira le proteine citoplasmatiche e attaccate alla membrana.
Abstract
L’ibridazione fluorescente in situ (FISH) è una tecnica molecolare che identifica la presenza e la distribuzione spaziale di specifici trascritti di RNA all’interno delle cellule. La fenotipizzazione neurochimica di neuroni funzionalmente identificati di solito richiede la marcatura simultanea con più anticorpi (proteina bersaglio) utilizzando l’immunoistochimica (IHC) e l’ottimizzazione dell’ibridazione in situ (RNA mirato), in tandem. Una “firma neurochimica” per caratterizzare particolari neuroni può essere raggiunta, tuttavia i fattori di complicazione includono la necessità di verificare i bersagli FISH e IHC prima di combinare i metodi e il numero limitato di RNA e proteine che possono essere presi di mira simultaneamente all’interno della stessa sezione di tessuto.
Qui descriviamo un protocollo, che utilizza sia preparazioni cerebrali di topo fresche congelate che fisse, che rileva più mRNA e proteine nella stessa sezione cerebrale utilizzando RNAscope FISH seguito da immunocolorazione a fluorescenza, rispettivamente. Utilizziamo il metodo combinato per descrivere il pattern di espressione di mRNA a bassa abbondanza (ad esempio, il recettore 1 della galanina) e mRNA ad alta abbondanza (ad esempio, il trasportatore della glicina 2), nei nuclei del tronco encefalico identificati immunoistochimicamente.
Le considerazioni chiave per l’etichettatura delle proteine a valle del test FISH vanno oltre la preparazione dei tessuti e l’ottimizzazione dell’etichettatura della sonda FISH. Ad esempio, abbiamo scoperto che la specificità del legame e dell’etichettatura degli anticorpi può essere influenzata negativamente dalla fase della proteasi all’interno del test della sonda FISH. Le proteasi catalizzano la scissione idrolitica dei legami peptidici, facilitando l’ingresso della sonda FISH nelle cellule, tuttavia possono anche digerire la proteina bersaglio dal successivo saggio IHC, producendo un legame fuori bersaglio. La posizione subcellulare della proteina bersaglio è un altro fattore che contribuisce al successo dell’IHC dopo il saggio della sonda FISH. Abbiamo osservato che la specificità dell’IHC viene mantenuta quando la proteina bersaglio è legata alla membrana, mentre l’IHC che prende di mira la proteina citoplasmatica ha richiesto un’ampia risoluzione dei problemi. Infine, abbiamo riscontrato che la manipolazione del tessuto congelato fisso montato su vetrino è più impegnativa rispetto al tessuto congelato fresco, tuttavia la qualità dell’IHC è risultata complessivamente migliore con il tessuto congelato fisso, quando combinato con l’RNAscope.
Introduction
Le proteine e gli mRNA che definiscono neurochimicamente le sottopopolazioni di neuroni sono comunemente identificati rispettivamente con una combinazione di immunoistochimica (IHC) e/o ibridazione in situ (ISH). La combinazione di ISH con tecniche IHC facilita la caratterizzazione di modelli di colocalizzazione unici per i neuroni funzionali (codifica neurochimica) massimizzando la capacità di marcatura multiplex.
I metodi ISH fluorescenti (FISH), incluso l’RNAscope, hanno una maggiore sensibilità e specificità rispetto ai precedenti metodi di rilevamento dell’RNA come l’ISH radioattivo e l’ISH cromogenico non radioattivo. La FISH consente la visualizzazione di singoli trascritti di mRNA come macchie colorate con puntini1. Inoltre, il test RNAscope consente di marcare un numero maggiore di bersagli di RNA alla volta, utilizzando diversi tag fluorofori. Nonostante questi vantaggi, le limitazioni tecniche possono influenzare il numero di fluorofori/cromogeni che possono essere utilizzati in un singolo esperimento. Questi includono la disponibilità di set di filtri per microscopio; tali considerazioni sono aggravate quando l’identificazione neurochimica utilizza la combinazione di FISH e IHC, rispetto all’utilizzo di ciascuna tecnica in modo isolato, poiché i passaggi intrinseci ottimali per un metodo possono essere dannosi per l’altro.
Precedenti applicazioni di FISH in combinazione con IHC hanno dimostrato l’espressione di specifici bersagli cellulari nei linfomi umani a cellule B2, negli embrioni di pulcino3, negli embrioni di zebrafish4, nella retina di topo5 e nelle cellule dell’orecchio interno di topo6. In questi studi, la preparazione del tessuto è stata incorporata in paraffina fissata in formalina (FFPE)2,3,5 o a monte intero fresco 4,6. Altri studi hanno applicato l’RNAscope cromogenico su preparati cerebrali fissi di topo e ratto 7,8,9. In particolare, Baleriola et al.8 hanno descritto due diverse preparazioni tissutali per la combinazione ISH-IHC; corrette le sezioni cerebrali di topo e le sezioni di cervello umano FFPE. In una recente pubblicazione, abbiamo combinato FISH e IHC fluorescente su sezioni fresche congelate, per visualizzare simultaneamente mRNA a bassa abbondanza (recettore 1 della galanina, GalR1), mRNA ad alta abbondanza (trasportatore della glicina 2, GlyT2) e proteina10 del trasportatore vescicolare dell’acetilcolina (vAChT) nella formazione reticolare del tronco encefalico.
Il nucleo del tratto solitario (NTS) è una delle principali regioni del cervello coinvolte nella funzione autonomica. Situata nel rombencefalo, questa popolazione eterogenea di neuroni riceve e integra un vasto numero di segnali autonomi, compresi quelli che regolano la respirazione. L’NTS ospita diverse popolazioni neuronali, che possono essere fenotipicamente caratterizzate dal pattern di espressione di bersagli dell’mRNA, tra cui GalR1 e GlyT2 e marcatori proteici per l’enzima tirosina idrossilasi (TH) e il fattore di trascrizione Paired-like homeobox 2b (Phox2b).
Il titolare dell’RNAscope raccomanda preparazioni di tessuto fresco congelato, ma il tessuto preparato mediante fissazione per perfusione transcardica di animali interi, insieme alla crioprotezione a lungo termine (conservazione a -20 °C) di sezioni fisse di tessuto congelato, è comune in molti laboratori. Pertanto, abbiamo cercato di stabilire protocolli per la FISH in combinazione con l’IHC utilizzando preparati di tessuti freschi congelati e congelati fissi. Qui, forniamo sezioni di cervello fresco congelato e congelato fisso: (1) un protocollo per FISH combinato e IHC fluorescente (2) una descrizione della qualità dell’mRNA e della marcatura delle proteine prodotte, quando si utilizza ogni preparazione (3) una descrizione dell’espressione di GalR1 e GlyT2 nell’NTS.
Il nostro studio ha rivelato che, se combinato con la metodologia RNAscope, il successo dell’IHC variava nelle preparazioni fresche congelate e surgelate fisse e dipendeva dalla localizzazione delle proteine bersaglio all’interno della cellula. Nelle nostre mani, l’etichettatura delle proteine legate alla membrana ha sempre avuto successo. Al contrario, l’IHC per la proteina citoplasmatica richiedeva la risoluzione dei problemi anche nei casi in cui la proteina citoplasmatica era sovraespressa in un animale transgenico (Phox2b-GFP)11. Infine, mentre GalR1 è espresso nei neuroni non catecolaminergici nell’NTS, l’espressione di GlyT2 è assente nell’NTS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nelle neuroscienze, FISH e IHC sono abitualmente utilizzati per studiare l’organizzazione spaziale e il significato funzionale dell’mRNA o delle proteine all’interno delle sottopopolazioni neuronali. Il protocollo descritto in questo studio migliora la capacità di rilevamento simultaneo di mRNA e proteine nelle sezioni cerebrali. Il nostro saggio combinato multiplex FISH-IHC ha permesso l’identificazione fenotipica di sottopopolazioni neuronali distinte nell’NTS sia in preparazioni cerebrali fresche congelate che fisse….
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dall’Australian Research Council Discovery Project grant DP180101890 e dalla Rebecca L Cooper Medical Research Foundation project grant PG2018110
Materials
| ANIMALS | |||
| C57BL/6 mouse | Australian BioResources, Moss Vale | MGI: 2159769 | |
| Phox2b-eGFP mouse | Australian BioResources, Moss Vale | MGI: 5776545 | |
| REAGENTS | |||
| Cyanoacrylate | Loctite | ||
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Heparin-Sodium | Clifford Hallam Healthcare | 1070760 | Consult local veterinary supplier or pharmacy. |
| Lethabarb (Sodium Pentabarbitol) Euthanasia Injection | Virbac (Australia) Pty Ltd | N/A | Consult a veterinarian for local pharmaceutical regulations regarding Sodium Pentabarbitol |
| Molecular grade agarose powder | Sigma Aldrich | 5077 | |
| OCT Compound, 118mL | Scigen Ltd | 4586 | |
| Paraformaldehyde, prilled, 95% | Sigma-Aldrich | 441244-1KG | |
| Polyvinylpyrrolidone, average mol wt 40,000 (PVP-40) | Sigma-Aldrich | PVP40 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36930 | With or without DAPI |
| RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit (up to 3-plex capability) | Advanced Cell Diagnostics, Inc. (ACD Bio) | ADV320850 | Includes 50x Wash buffer and Protease III |
| RNase Away | Thermo-Fisher Scientific | 7003 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 | |
| Tween-20, for molecular biology | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| EQUIPMENT | |||
| Benchtop incubator | Thermoline scientific micro incubator | Model: TEI-13G | |
| Brain Matrix, Mouse, 30g Adult, Coronal, 1mm | Ted Pella | 15050 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| Drawing-up needle (23 inch gauge) | BD | 0288U07 | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector labs | H-4000 | |
| Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes | Kimberley Clark Professional | 34120 | |
| Olympus BX51 | Olympus | BX-51 | |
| Peristaltic pump | Coleparmer Masterflex | L/S Series | |
| Retiga 2000R Digital Camera | QImaging | RET-2000R-F-CLR | colour camera |
| SuperFrost Plus Glass Slides (White) | Thermo-Fisher Scientific | 4951PLUS4 | |
| Vibrating Microtome (Vibratome) | Leica | VT1200S | |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 1, 110 mm diameter | Merck | WHA1001110 | |
| SOFTWARES | |||
| CorelDRAW | Corel Corporation | Version 7 | |
| FIJI (ImageJ Distribution) | Open Source/GNU General Public Licence (GPL) | N/A | ImageJ 2.x: Rueden, C. T.; Schindelin, J. & Hiner, M. C. et al. (2017), "ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data", BMC Bioinformatics 18:529, PMID 29187165, doi:10.1186/s12859-017-1934-z and Fiji: Schindelin, J.; Arganda-Carreras, I. & Frise, E. et al. (2012), "Fiji: an open-source platform for biological-image analysis", Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772, doi:10.1038/nmeth.2019 |
| PRIMARY ANTIBODIES | |||
| Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody | Millipore Sigma | AB1542 | Sheep polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_90755 |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody, clone LNC1 | Millipore Sigma | MAB318 | Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2201528 |
| Anti-Vesicular Acetylcholine Transporter (VAchT) Antibody | Sigma-Aldrich | ABN100 | Goat polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2630394 |
| GFP Antibody | Novus Biologicals | NB600-308 | Rabbit polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_10003058 |
| Phox2b Antibody (B-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc-376997 | Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2813765 |
| SECONDARY ANTIBODIES | |||
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | Donkey anti-Rabbit (1:400 dilution), RRID: AB_2313584 |
| AMCA AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 713-155-147 | Donkey anti-Sheep (1:400 dilution), RRID: AB_AB_2340725 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 705-175-147 | Donkey anti-Goat (1:400 dilution), RRID: AB_2340415 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Rb, Rat, Shp Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 715-175-151 | Donkey anti-Mouse (1:400 dilution), RRID: AB_2619678 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 713-175-147 | Donkey anti-Sheep (1:400 dilution), RRID: AB_2340730 |
| RNASCOPE PROBES | |||
| Galanin Receptor 1 oligonucleotide probe | ACDBio | 448821-C1 | targets bp 482 – 1669 (Genebank ref: NM_008082.2) |
| Glycine transporter 2 oligonucleotide probe | ACDBio | 409741-C3 | targets bp 925 – 2153 (Genebank ref: NM_148931.3) |
| Phox2b oligonucleotide probe | ACDBio | 407861-C2 | targets bp 1617 – 2790 (Genebank ref: NM_008888.3) |
References
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