Tache occidentale à très grande vitesse utilisant la technologie d’amélioration de l’immunoréaction
Summary
Une technique de ballonnement occidental à très grande vitesse est développée en améliorant la cinétique de la liaison antigène-anticorps grâce à la technologie cyclique de drainage et de réapprovisionnement (CDR) en conjonction avec un agent améliorant l’immunoréaction.
Abstract
Une tache occidentale (également connue sous le nom d’immunoblot) est une méthode canonique pour la recherche biomédicale. Il est couramment utilisé pour déterminer la taille relative et l’abondance de protéines spécifiques ainsi que les modifications des protéines post-translationnelles. Cette technique a une histoire riche et reste largement utilisée en raison de sa simplicité. Cependant, la procédure occidentale de ballonnement prend des heures, voire des jours, pour terminer, avec un goulot d’étranglement critique étant les longs temps d’incubation qui limitent son débit. Ces étapes d’incubation sont nécessaires en raison de la lente diffusion des anticorps de la solution en vrac aux antigènes immobilisés sur la membrane : la concentration d’anticorps près de la membrane est beaucoup plus faible que la concentration en vrac. Ici, nous présentons une innovation qui réduit considérablement ces intervalles d’incubation en améliorant la liaison antigène par drainage cyclique et réapprovisionnement (CDR) de la solution d’anticorps. Nous avons également utilisé une technologie d’amélioration de l’immunoréaction pour préserver la sensibilité de l’essai. Une combinaison de la méthode CDR avec un agent d’amélioration de l’immunoréaction commerciale a stimulé le signal de sortie et considérablement réduit le temps d’incubation des anticorps. La tache occidentale à très grande vitesse qui en résulte peut être réalisée en 20 minutes sans aucune perte de sensibilité. Cette méthode peut être appliquée aux taches occidentales en utilisant à la fois la détection chemiluminescente et fluorescente. Ce protocole simple permet aux chercheurs de mieux explorer l’analyse de l’expression des protéines dans de nombreux échantillons.
Introduction
Une tache occidentale (également connue sous le nom d’immunoblot) est une technique puissante et fondamentale dans un large éventail de disciplines scientifiques et cliniques. Cette technique est utilisée pour examiner la présence, l’abondance relative, la masse moléculaire relative et les modifications post-translationnelles des protéines1. Combinée à l’analyse d’images numériques, cette méthode peut analyser de manière fiable l’abondance des protéines et des modificationsprotéiques 2. Bien que la tache occidentale soit exécutée régulièrement, c’est une méthode longue et laborique. De longues incubations de l’anticorps avec membranes sont nécessaires. Ici, nous décrivons une modification de la méthode d’incubation qui surmonte cette limitation sans sacrifier la sensibilité.
Pendant l’incubation de la membrane, les anticorps flottent en solution tandis que les antigènes sont immobilisés sur la membrane. En raison de leur affinité élevée, le taux d’anticorps se liant à l’antigène est plus rapide que la diffusion d’anticorps de la solution en vrac à la membrane. Cela crée une « couche d’épuisement » à faible concentration (figure 1). Il peut prendre des heures pour que des anticorps plus éloignés atteignent la membrane par diffusion passive, qui est le principal facteur responsable des longs temps d’incubation dans cette technique. Cet effet est appelé la limitation de transport de masse (MTL)3. Il a été proposé que le drainage répétitif et le réapprovisionnement de la solution contenant des anticorps puissent perturber la couche d’épuisement et surmonter le MTL4. Ici, nous avons conçu une technique unique qui met en œuvre ce concept cyclique de drainage et de réapprovisionnement (CDR) pour diminuer l’effet du MTL dans un protocole traditionnel de ballonnement occidental et raccourcir de façon remarquée la période d’incubation requise.
Afin de maintenir la sensibilité à la détection avec un temps d’incubation court, nous avons utilisé une technologie d’amélioration de l’immunoréaction qui accélère la réaction antigène-anticorps, améliorant ainsi le rapport signal-bruit5. De nombreux agents d’amélioration de l’immunoréaction disponibles dans le commerce (IRE) se composent de 2 composants (solution 1 et 2, voir tableau des matériaux). La composition propriétaire ou le mécanisme d’action de l’IRE n’a pas été divulgué, mais nous avons déjà constaté que l’IRE a diminué la constante de dissociation entre l’antigène et l’anticorps dans les essais de liaison de phase solide, indiquant que l’affinité accrue est, au moins en partie, responsable de l’effet d’amélioration de l’IRE6. La combinaison du CDR et de l’IRE donne un protocole de ballonnement occidental à très grande vitesse qui réduit tout le temps de procédure sans sacrifier la sensibilité.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tache occidentale est une technique d’analyse largement utilisée pour détecter des protéines spécifiques qui a été développé ~ il ya 40 ans7,8. Depuis lors, la technique a continué d’évoluer, avec des innovations ultérieures améliorant la sensibilité, la vitesse et la quantitation de la technique2,9,10,11,<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été appuyés par la Division de la recherche intra-muros, le National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health. S.H. a reçu l’appui du Japan Public-Private Partnership Student Study Abroad Program, et H.N. et K.Y. ont reçu une bourse d’études valor et v drug overseas training scholarship.
Materials
| 14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, Graduated, with Snap Cap | Falcon | 352059 | |
| Apollo Transparency Film for Laser Printers | N/A | N/A | Any kinds of Laser Printer Transparency Film are fine. |
| Azure Imaging System 600 | Azure Biosystems | Azure 600 | Any kind of Image Acquiring Sytem is fine for chemiluminescent and/or fluorescent detection. |
| Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution | TOYOBO | NKB-101 | |
| CARNATION Instant Nonfat Dry Milk | Carnation | N/A | |
| ECL anti-mouse IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from sheep | GE Healthcare | NA9310V | |
| ECL anti-rabbit IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from donkey | GE Healthcare | NA9340V | |
| HYBAID Micro-4 | N/A | N/A | Any hybridization oven is fine as long as the tubes are rotated evenly at a horizontal position. |
| Immobilon-P PVDF Membrane, 0.45 µm pore size | Millipore Sigma | IPVH304F0 | |
| IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody | LICOR | 926-68070 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody | LICOR | 926-32211 | |
| KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrate | seracare | 5430-0049 | |
| Mouse anti-ß actin antibody | Millipore Sigma | A5316 | |
| Odyssey Blocking Buffer (PBS) | LICOR | 927-40100 | Blocking Buffer for fluorescent detection |
| OXO Salad Spinner | OXO | 32480V2B | Any salad spinner is fine as long as the PVDF membranes are rinsed vigorously without tear. |
| Parafilm Sealing Film | Bemis | Parafilm M PM996 | semi-transparent flexible film |
| Polyethylene Flat-Top Screw Caps for 50 mL Conical Bottom Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| Rings to hold 14 ml tube in the center of 50 ml tube | N/A | N/A | Prepared in a machine shop |
| Rabbit anti-6X His tag antibody | Abcam | ab9108 | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P2287 |
References
- MacPhee, D. J. Methodological considerations for improving Western blot analysis. Journal of Pharmacol Toxicology Methods. 61 (2), 171-177 (2010).
- Janes, K. A. An analysis of critical factors for quantitative immunoblotting. Science Signaling. 8 (371), (2015).
- Schuck, P., Zhao, H. The role of mass transport limitation and surface heterogeneity in the biophysical characterization of macromolecular binding processes by SPR biosensing. Methods in Molecular Biology. 627, 15-54 (2010).
- Li, J., Zrazhevskiy, P., Gao, X. Eliminating Size-Associated Diffusion Constraints for Rapid On-Surface Bioassays with Nanoparticle Probes. Small. 12 (8), 1035-1043 (2016).
- Higashi, S. L., et al. Old but not Obsolete: An Enhanced High Speed Immunoblot. Journal of Biochemistry. 168 (1), 15-22 (2020).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
- Burnette, W. N. “Western blotting”: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112 (2), 195-203 (1981).
- Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).
- Ciaccio, M. F., Wagner, J. P., Chuu, C. P., Lauffenburger, D. A., Jones, R. B. Systems analysis of EGF receptor signaling dynamics with microwestern arrays. Nature Methods. 7 (2), 148-155 (2010).
- Treindl, F., et al. A bead-based western for high-throughput cellular signal transduction analyses. Nature Communications. 7, 12852 (2016).
- Sajjad, S., Do, M. T., Shin, H. S., Yoon, T. S., Kang, S. Rapid and efficient western blot assay by rotational cyclic draining and replenishing procedure. Electrophoresis. 39 (23), 2974-2978 (2018).
- Kurien, B. T., Scofield, R. H. A brief review of other notable protein detection methods on blots. Methods in Molecular Biology. 536, 557-571 (2009).
- Nagase, H., et al. Reliable and Sensitive Detection of Glycosaminoglycan Chains with Immunoblots. Glycobiology. , (2020).
