Ultra-High-Speed Western Blot met behulp van Immunoreaction Enhancing Technology
Summary
Een ultrasnelle westerse blotting-techniek wordt ontwikkeld door de kinetiek van antigeen-antilichaambinding te verbeteren door middel van cyclische draining- en replenishing (CDR)-technologie in combinatie met een immunoreactieverhogend middel.
Abstract
Een westerse vlek (ook wel immunoblot) is een canonieke methode voor biomedisch onderzoek. Het wordt vaak gebruikt om de relatieve grootte en overvloed van specifieke eiwitten te bepalen, evenals post-translationele eiwitaanpassingen. Deze techniek heeft een rijke geschiedenis en wordt nog steeds op grote schaal gebruikt vanwege de eenvoud. De westelijke vlekprocedure duurt echter uren, zelfs dagen, om te voltooien, met een kritiek knelpunt zijn de lange incubatietijden die de doorvoer beperken. Deze incubatiestappen zijn nodig vanwege de langzame diffusie van antilichamen van de bulkoplossing naar de geïmmobiliseerde antigenen op het membraan: de antilichaamconcentratie in de buurt van het membraan is veel lager dan de bulkconcentratie. Hier presenteren we een innovatie die deze incubatie-intervallen drastisch vermindert door de antigeenbinding te verbeteren via cyclische afvoer en aanvulling (CDR) van de antilichaamoplossing. We gebruikten ook een immunoreactieverhogende technologie om de gevoeligheid van de test te behouden. Een combinatie van de CDR-methode met een commercieel immunoreactieverhogend middel verhoogde het uitgangssignaal en verminderde de incubatietijd van antilichamen aanzienlijk. De resulterende ultrasnelle westerse vlek kan in 20 minuten worden bereikt zonder verlies van gevoeligheid. Deze methode kan worden toegepast op westerse vlekken met behulp van zowel chemiluminescente als fluorescerende detectie. Dit eenvoudige protocol stelt onderzoekers in staat om de analyse van eiwitexpressie in veel monsters beter te onderzoeken.
Introduction
Een westerse vlek (ook bekend als een immunoblot) is een krachtige en fundamentele techniek in een breed scala aan wetenschappelijke en klinische disciplines. Deze techniek wordt gebruikt om de aanwezigheid, relatieve overvloed, relatieve moleculaire massa en post-translationele modificaties van eiwitten te onderzoeken1. In combinatie met digitale beeldanalyse kan deze methode op betrouwbare wijze de overvloed aan eiwitten en eiwitmodificaties analyseren2. Hoewel western blot routinematig wordt uitgevoerd, is het een tijdrovende en arbeidsintensieve methode. Lange incubaties van het antilichaam met membranen zijn vereist. Hier beschrijven we een wijziging van de incubatiemethode die deze beperking overwint zonder de gevoeligheid op te offeren.
Tijdens incubatie van het membraan zweven antilichamen in oplossing terwijl antigenen op het membraan worden geïmmobiliseerd. Vanwege hun hoge affiniteit is de snelheid van antilichaambinding aan het antigeen sneller dan de diffusie van antilichamen van de bulkoplossing naar het membraan. Hierdoor ontstaat een lage concentratie “uitputtingslaag” (figuur 1). Het kan uren duren voordat meer verre antilichamen het membraan bereiken via passieve diffusie, wat de belangrijkste factor is die verantwoordelijk is voor lange incubatietijden in deze techniek. Dit effect wordt de massatransportbeperking (MTL)3genoemd. Er is voorgesteld dat het herhaaldelijk aftappen en aanvullen van de antilichaambevattende oplossing de uitputtingslaag kan verstoren en MTL4kan overwinnen . Hier hebben we een unieke techniek ontwikkeld die dit cyclische draining and replenishing (CDR) concept implementeert om het effect van MTL in een traditioneel westers blotting protocol te verminderen en de vereiste incubatietijd te verkorten.
Om de detectiegevoeligheid met een korte incubatietijd te behouden, hebben we gebruik gemaakt van een immunoreactieverhogende technologie die de antigeen-antilichaamreactie versnelt, waardoor de signaal-ruisverhouding5wordt verbeterd. Veel in de handel verkrijgbare immunoreactieverhogende middelen (IRE) bestaan uit 2 componenten (oplossing 1 en 2, zie tabel met materialen). De eigen samenstelling of werkingsmechanisme van IRE is niet bekendgemaakt, maar we hebben eerder vastgesteld dat IRE de dissociatieconstante tussen het antigeen en het antilichaam in vastefasebindende tests heeft verminderd, wat erop wijst dat verhoogde affiniteit ten minste gedeeltelijk verantwoordelijk is voor het versterkende effect van IRE6. De combinatie van CDR met IRE levert een ultrasnel westers vlekkenprotocol op dat de hele proceduretijd vermindert zonder in te boeten aan gevoeligheid.
Protocol
Representative Results
Discussion
Western blot is een veel gebruikte analytische techniek om specifieke eiwitten te detecteren die ~40 jaar geleden werd ontwikkeld7,8. Sindsdien is de techniek verder geëvolueerd, waarbij latere innovaties de gevoeligheid, snelheid en kwantificering van de techniekverbeterden 2,9,10,11,12,<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de afdeling Intramuraal Onderzoek, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health. S.H. werd ondersteund door Japan Public-Private Partnership Student Study Abroad Program, en H.N. en K.Y. waren door Valor en V Drug Overseas Training Scholarship.
Materials
| 14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, Graduated, with Snap Cap | Falcon | 352059 | |
| Apollo Transparency Film for Laser Printers | N/A | N/A | Any kinds of Laser Printer Transparency Film are fine. |
| Azure Imaging System 600 | Azure Biosystems | Azure 600 | Any kind of Image Acquiring Sytem is fine for chemiluminescent and/or fluorescent detection. |
| Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution | TOYOBO | NKB-101 | |
| CARNATION Instant Nonfat Dry Milk | Carnation | N/A | |
| ECL anti-mouse IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from sheep | GE Healthcare | NA9310V | |
| ECL anti-rabbit IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from donkey | GE Healthcare | NA9340V | |
| HYBAID Micro-4 | N/A | N/A | Any hybridization oven is fine as long as the tubes are rotated evenly at a horizontal position. |
| Immobilon-P PVDF Membrane, 0.45 µm pore size | Millipore Sigma | IPVH304F0 | |
| IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody | LICOR | 926-68070 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody | LICOR | 926-32211 | |
| KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrate | seracare | 5430-0049 | |
| Mouse anti-ß actin antibody | Millipore Sigma | A5316 | |
| Odyssey Blocking Buffer (PBS) | LICOR | 927-40100 | Blocking Buffer for fluorescent detection |
| OXO Salad Spinner | OXO | 32480V2B | Any salad spinner is fine as long as the PVDF membranes are rinsed vigorously without tear. |
| Parafilm Sealing Film | Bemis | Parafilm M PM996 | semi-transparent flexible film |
| Polyethylene Flat-Top Screw Caps for 50 mL Conical Bottom Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| Rings to hold 14 ml tube in the center of 50 ml tube | N/A | N/A | Prepared in a machine shop |
| Rabbit anti-6X His tag antibody | Abcam | ab9108 | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P2287 |
References
- MacPhee, D. J. Methodological considerations for improving Western blot analysis. Journal of Pharmacol Toxicology Methods. 61 (2), 171-177 (2010).
- Janes, K. A. An analysis of critical factors for quantitative immunoblotting. Science Signaling. 8 (371), (2015).
- Schuck, P., Zhao, H. The role of mass transport limitation and surface heterogeneity in the biophysical characterization of macromolecular binding processes by SPR biosensing. Methods in Molecular Biology. 627, 15-54 (2010).
- Li, J., Zrazhevskiy, P., Gao, X. Eliminating Size-Associated Diffusion Constraints for Rapid On-Surface Bioassays with Nanoparticle Probes. Small. 12 (8), 1035-1043 (2016).
- Higashi, S. L., et al. Old but not Obsolete: An Enhanced High Speed Immunoblot. Journal of Biochemistry. 168 (1), 15-22 (2020).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
- Burnette, W. N. “Western blotting”: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112 (2), 195-203 (1981).
- Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).
- Ciaccio, M. F., Wagner, J. P., Chuu, C. P., Lauffenburger, D. A., Jones, R. B. Systems analysis of EGF receptor signaling dynamics with microwestern arrays. Nature Methods. 7 (2), 148-155 (2010).
- Treindl, F., et al. A bead-based western for high-throughput cellular signal transduction analyses. Nature Communications. 7, 12852 (2016).
- Sajjad, S., Do, M. T., Shin, H. S., Yoon, T. S., Kang, S. Rapid and efficient western blot assay by rotational cyclic draining and replenishing procedure. Electrophoresis. 39 (23), 2974-2978 (2018).
- Kurien, B. T., Scofield, R. H. A brief review of other notable protein detection methods on blots. Methods in Molecular Biology. 536, 557-571 (2009).
- Nagase, H., et al. Reliable and Sensitive Detection of Glycosaminoglycan Chains with Immunoblots. Glycobiology. , (2020).
