הדמיה של דינמיקה דיפוזיונית של ננו-ירדס זהב על קרום התא באמצעות מיקרוסקופיה אחת של ננו-חלקיקים בדארקפילד
Summary
כאן, אנו מראים את השימוש במיקרוסקופיה מסורתית של שדה כהה כדי לפקח על הדינמיקה של nanorods זהב (AuNRs) על קרום התא. המיקום והכיוון של AuNRs יחיד מזוהים באמצעות ImageJ ו- MATLAB, והמדינות המפוזרות של AuNRs מאופיינים בניתוח מעקב אחר חלקיקים בודדים.
Abstract
ניתוח הדינמיקה הדיפוזיונית של חלקיקים על קרום התא ממלא תפקיד משמעותי בהבנה טובה יותר של תהליך הספיגה התאית ומספק בסיס תיאורטי לעיצוב הרציונלי של אספקת ננו-רפואה. ניתוח מעקב חלקיקים יחיד (SPT) יכול לחקור את המיקום והכיוון של חלקיקים בודדים על קרום התא, ולחשוף את מצבי התרגום והסיבוב שלהם. כאן, אנו מראים כיצד להשתמש מיקרוסקופיה שדה כהה מסורתי כדי לפקח על הדינמיקה של nanorods זהב (AuNRs) על קרום תא חי. אנו גם מראים כיצד לחלץ את המיקום והכיוון של AuNRs באמצעות ImageJ ו- MATLAB, וכיצד לאפיין את המצבים המפוזרים של AuNRs. ניתוח סטטיסטי של מאות חלקיקים מראים כי AuNRs יחיד לבצע תנועה בראונית על פני השטח של קרום התא U87 MG. עם זאת, ניתוח מסלול ארוך בודדים מראה כי AuNRs יש שני סוגים שונים במובהק של מצבי תנועה על הממברנה, כלומר תחבורה ארוכת טווח וכליאה באזור מוגבל. שיטות SPT שלנו יכול לשמש פוטנציאל לחקור את פני השטח או דיפוזיה חלקיקים תאיים בתאים ביולוגיים שונים והוא יכול להיות כלי רב עוצמה לחקירות של מנגנונים תאיים מורכבים.
Introduction
הדינמיקה של חלקיקים (NPs) על הממברנה קשורה קשר הדוק עם תהליך ספיגת הסלולר, אשר חיוני להבנת תפקודי התא, זיהומים ויראליים או חיידקיים ופיתוח של מערכות משלוח ננו רפואי מלאכותי1,2. טכניקת מעקב חלקיקים בודדים (SPT) היא כלי חזק לאפיון ההתנהגויות ההטרוגניות של NPs3,4. באופן כללי, קרום התא הוא נוזלי, כלומר הרכיבים כגון חלבונים ושומנים יכולים לנוע לרוחב במישור קרום הפלזמה5,6,7. המורכבות המרחבית של ארגון ומבנה הממברנה עלולה להוביל להטרוגניות מרחבית של האינטראקציה בין NPs לקרום. לפיכך, הדמיה ישירה של התנועה של NPs על הממברנה דורשת רזולוציה מרחבית וטמפורלית גבוהה.
מיקרוסקופ מעקב חלקיקים יחיד המנטר לוקליזציה של חלקיקים בודדים בתאים חיים עם רזולוציה מרחבית של עשרות ננומטר ורזולוציית זמן של אלפיות שנייה פותחה היטב כדי לחקור את NPs או מולקולות קרוםדינמיקה 8,9. טכניקות הדמיה מיקרוסקופיות מבוססות פלואורסצנטיות הפכו לכלים יקרי ערך להתבוננות ב- NPs /מולקולות בסביבת תאיםחיים 9,10,11,12. לדוגמה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי השתקפות פנימית הכוללת, אשר תמונות שכבות דקות (~ 100 ננומטר) של המדגם בממשק מצע / פתרון עם רזולוציה spatiotemporal גבוהה כבר בשימוש נרחב במחקרים של מולקולות קרוםדינמיקה 13,14. עם זאת, החסרונות הטבועים בפלואורופורים בודדים, כגון אינטנסיביות נמוכה וצילום מהיר ובלתי הפיך מפחיתים את הדיוק ומשך המעקב13. לכן, NPs פלסמוניים שאינם פלואורסצנטיים, אשר מחליפים את הבדיקות הפלואורסצנטיות, משכו יותר ויותר תשומת לב במחקרי הדמיה ארוכי טווח בשל המאפיינים האופטיים הייחודיים שלהם15. בהתבסס על אותות הפיזור של בדיקות NP פלסמוניות, נעשה שימוש במספר סוגים של טכנולוגיות הדמיה מיקרוסקופיות אופטיות כדי לחקור את המנגנון של תהליכים ביולוגיים, כגון מיקרוסקופיה שדה כהה (DFM)16, פיזור אינטרפרומטרי (iSCAT) מיקרוסקופיה17 ומיקרוסקופיית ניגוד הפרעה דיפרנציאלית (DICM)18. בנוסף, ניתן להשיג את דינמיקת התנועה והסיבוב של AuNRs באמצעות DFM ו DICM18,19,20,21,22. בדרך כלל, בניסוי SPT, התנועה של האובייקט נרשמת על ידי המיקרוסקופ האופטי, ולאחר מכן מנותחת על ידי שיטות ניתוח SPT3. המסלולים שנפתרו בזמן וזוויות האוריינטציה שנוצרו על ידי NPs בודדים הם בדרך כלל סטוכסטיים והטרוגניים, ולכן יש צורך להציג מידע דינמי בשפע עם שיטות ניתוח שונות.
כאן, אנו מספקים פרוטוקול משולב המנטר את הדינמיקה של AuNRs על קרום התא באמצעות DFM, מחלץ את המיקום והכיוון של AuNRs עם ImageJ ו- MATLAB ומאפיין את הדיפוזיה של AuNRs עם שיטות ניתוח SPT. כהדגמה, אנו מראים כאן כיצד להשתמש בפרוטוקול SPT כדי לדמיין את הדינמיקה של AuNRs ללא שינוי (CTAB-AuNRs, מסונתז על ידי מולקולת אמוניום ברומיד cetyltrimethylammonium כסוכן מגן) על קרום התא U87 MG. הוכח כי CTAB-AuNRs יכול לתסלח חלבונים בסביבה ביולוגית, לנוע על קרום התא ולאחר מכן להזין תאים2,20,22. תא U87 MG הוא הגידול הנפוץ והממאיר ביותר של מערכת העצבים המרכזית, קולטני הממברנה שלו באים לידי ביטוי באופן חריג. קולטני הממברנה יכולים לקיים אינטראקציה עם חלבונים על AuNRs, אשר משפיעים על הדינמיקה של AuNRs. הפרוטוקול שלנו ישים בדרך כלל לניסויי SPT אחרים בתחום הביולוגיה.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המוצג משמש כדי ללמוד את הדינמיקה של AuNRs על קרום התא. הפרוטוקול מורכב מארבעה חלקים, כולל הדמיה מיקרוסקופית, חילוץ נתונים, חישוב פרמטרים דינמיים ושיטות ניתוח נתונים, וכל חלק הוא גמיש ואוניברסלי. לכן, ישנם יישומים עתידיים אפשריים רבים, למשל, לימוד תנועה של מולקולות קרום הקשורות NP על ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין עם מספרי מענקים של 21425519, 91853105 ו 21621003.
Materials
| CTAB coated gold nanorods(CTAB-AuNRs) | Nanoseedz | NR-40-650 | 85 nm * 40 nm |
| Color CMOS camera | Olympus | DP74 | Japan |
| Coverslips | Citoglas | z10212222C | 22*22 mm |
| Dark-field microscopy | Nikon | 80i | upright microscope |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099141 | |
| Fiji | National Institutes of Health | 2.0.0-rc-69/1.52 p | a distribution of ImageJ |
| Grooved glass slide | Sail brand | 7103 | Single concave |
| Image J | National Institutes of Health | 1.52 j | |
| MATLAB | MathWorks | R2019b | |
| MATLAB Code | https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020 | ||
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 10-010-CVR | with phenol red |
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 51200038 | no phenol red |
| Origin | OriginLab | Origin Pro 2018C | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Plastic cell culture dishes | Falcon | 353002 | |
| Plastic cell culture dishes | Falcon | 353001 | 35*10 mm |
| U87 MG cell | American Type Culture Collection | ATCC HTB-14 | a human primary glioblastoma cell line |
References
- Rees, P., Wills, J. W., Brown, M. R., Barnes, C. M., Summers, H. D. The origin of heterogeneous nanoparticle uptake by cells. Nature Communication. 10 (1), 2341 (2019).
- Behzadi, S., et al. Cellular uptake of nanoparticles: journey inside the cell. Chemical Society Reviews. 46 (14), 4218-4244 (2017).
- Shen, H., et al. Single Particle Tracking: From Theory to Biophysical Applications. Chemical Reviews. 117 (11), 7331-7376 (2017).
- Saxton, M. J. Single-particle tracking: connecting the dots. Nature Methods. 5 (8), 671-672 (2008).
- Kusumi, A., et al. Dynamic organizing principles of the plasma membrane that regulate signal transduction: commemorating the fortieth anniversary of Singer and Nicolson’s fluid-mosaic model. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 215-250 (2012).
- Jacobson, K., Liu, P., Lagerholm, B. C. The Lateral Organization and Mobility of Plasma Membrane Components. Cell. 177 (4), 806-819 (2019).
- Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).
- von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking. Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).
- Rosenberg, J., Huang, J. Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (155), e59914 (2020).
- Kusumi, A., Tsunoyama, T. A., Hirosawa, K. M., Kasai, R. S., Fujiwara, T. K. Tracking single molecules at work in living cells. Nature Chemical Biology. 10 (7), 524-532 (2014).
- Rocha, J. M., Gahlmann, A. Single-Molecule Tracking Microscopy – A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules. Journal of Visualized Experiments. (151), e59387 (2019).
- Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. Visualizing protein-DNA interactions in live bacterial cells using photoactivated single-molecule tracking. Journal of Visualized Experiments. (85), e511177 (2014).
- Pinaud, F., Clarke, S., Sittner, A., Dahan, M. Probing cellular events, one quantum dot at a time. Nature Methods. 7 (4), 275-285 (2010).
- Mehidi, A., et al. Transient Activations of Rac1 at the Lamellipodium Tip Trigger Membrane Protrusion. Current Biology. 29 (17), 2852-2866 (2019).
- Ye, Z., Wang, X., Xiao, L. Single-Particle Tracking with Scattering-Based Optical Microscopy. Analytical Chemistry. 91 (24), 15327-15334 (2019).
- Pan, Q., Zhao, H., Lin, X., He, Y. Spatiotemporal Heterogeneity of Reactions in Solution Observed with High-Speed Single-Nanorod Rotational Sensing. Angewandte Chemie. International Ed. in English. 58 (25), 8389-8393 (2019).
- Taylor, R. W., et al. Interferometric scattering microscopy reveals microsecond nanoscopic protein motion on a live cell membrane. Nature Photonics. 13 (7), 480-487 (2019).
- Chen, K., et al. Characteristic rotational behaviors of rod-shaped cargo revealed by automated five-dimensional single particle tracking. Nature Communication. 8 (1), 887 (2017).
- Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. Y. Direct observation of the orientation dynamics of single protein-coated nanoparticles at liquid/solid interfaces. Angewandte Chemie. International Ed. in English. 53 (27), 6951-6955 (2014).
- Lehui, X., Yan, H., Edward, S. Y. Three Dimensional Orientational Imaging of Nanoparticles with Darkfield Microscopy. Analytical Chemistry. 82, 5268-5274 (2010).
- Ge, F., Xue, J., Wang, Z., Xiong, B., He, Y. Real-time observation of dynamic heterogeneity of gold nanorods on plasma membrane with darkfield microscopy. Science China Chemistry. 62, 1072-1081 (2019).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Janczura, J., Weron, A. Ergodicity testing for anomalous diffusion: small sample statistics. The Journal of Chemical Physics. 142 (14), 144103 (2015).
- Kim, D. H., et al. Single particle tracking-based reaction progress kinetic analysis reveals a series of molecular mechanisms of cetuximab-induced EGFR processes in a single living cell. Chemical Science. 8 (7), 4823-4832 (2017).
- Kurzthaler, C., et al. Probing the Spatiotemporal Dynamics of Catalytic Janus Particles with Single-Particle Tracking and Differential Dynamic Microscopy. Physical Review Letters. 121 (7), 078001 (2018).
- Lin, X., Pan, Q., He, Y. In situ detection of protein corona on single particle by rotational diffusivity. Nanoscale. 11 (39), 18367-18374 (2019).
- Wei, L., et al. Sub-diffraction-limit localization imaging of a plasmonic nanoparticle pair with wavelength-resolved dark-field microscopy. Nanoscale. 9 (25), 8747-8755 (2017).
- Cheng, X., Dai, D., Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. Subdiffraction-limited plasmonic imaging with anisotropic metal nanoparticles. Analytical Chemistry. 86 (5), 2303-2307 (2014).
- Belyy, V., et al. PhotoGate microscopy to track single molecules in crowded environments. Nature Communication. 8, 13978 (2017).
