単一ナノ粒子ダークフィールド顕微鏡を用いた細胞膜上の金ナノロッドの拡散ダイナミクスの可視化

膜上のナノ粒子(NPs)のダイナミクスは、細胞の取り込みプロセスと密接に関連しており、細胞機能、ウイルスまたは細菌感染、および人工ナノ医療デリバリーシステム^1,2の開発の理解に不可欠である。単一粒子追跡(SPT)技術は、NP^3,4の異種挙動を特徴付けるための堅牢なツールです。一般に、細胞膜は流体であり、タンパク質や脂質などの成分が、形質膜面^5、6、7内で横に移動できることを意味する。膜組織と構造の時空間的な複雑さは、NPと膜の相互作用の時空間的不均一性をもたらす可能性がある。したがって、膜上のNPの動きを直接可視化するには、高い空間解像度と時間的解像度の両方が必要です。

数十ナノメートルの空間分解能とミリ秒の時間分解能を有する生細胞における個々の粒子の局在を監視する単一粒子追跡顕微鏡は、NPまたは膜分子ダイナミクス^8,9を研究するために十分に開発されている。蛍光ベースの顕微鏡イメージング技術は、生細胞環境^{9、10、11、12}の中でNPs/分子を観察するための貴重なツールとなっています。例えば、全内部反射蛍光顕微鏡検査は、高い時空間分解能を有する基板/溶液界面で試料の薄層(〜100nm)を画像化する、膜分子ダイナミクス^13,14の研究において広く用いられている。しかし、低強度や急速な不可逆的な光の漂白のような単一の蛍光ホルの固有の欠点は、トラッキング¹³の精度と持続時間を低下させる。したがって、蛍光プローブに代わる非蛍光プラズモニックNPは、そのユニークな光学特性¹⁵による長期イメージング研究においてますます注目を集めている。プラズモニックNPプローブの散乱信号に基づいて、暗視野顕微鏡^(DFM)16、インターフェログメトリック散乱(iSCAT)顕微鏡法^17、差動干渉差影顕微鏡(DICM)18などの生物学的プロセスのメカニズムを研究するために、数種類の光学顕微鏡イメージング技術が使用されている。さらに、DFM および DICM 18、¹⁹、 20^、21、22を使用して、AuNRs のモーションと回転の動き^が得られます。典型的には、SPT実験において、対象物の運動は光学顕微鏡によって記録され、次いでSPT分析方法³によって分析される。個々のNPによって生成される時間分解軌道と向きの角度は、通常、確率的で異種的であるため、さまざまな解析方法で豊富な動的情報を提示する必要があります。

ここでは、DFMを用いて細胞膜上のAuNRsのダイナミクスを監視し、ImageJおよびMATLABでAuNRsの位置と向きを抽出し、SPT分析法によるAuNRsの拡散を特徴付ける統合プロトコルを提供します。このデモンストレーションとして、U87 MG細胞膜上の非修飾AuNRs(CTAB-AuNRs、セチルトリメチルアンモニウムアンモニウム臭化アンモニウム分子によって合成された)のダイナミクスを可視化する方法を示す。CTAB-AuNRsは、生物学的環境でタンパク質を吸引し、細胞膜上を移動し^{、細胞2、20、22}に入ることができることが実証されている。U87 MG細胞は中枢神経系の最も一般的で最も悪性の腫瘍であり、その膜受容体は異常に発現する。膜受容体は、AuNRsのタンパク質と相互作用し、AuNRsのダイナミクスに影響を与えます。我々のプロトコルは、一般に生物学の分野で他のSPT実験に適用されます。