성인 얼룩말 피시에 있는 Cisplatin에 의해 유도된 급성 신장 상해 모형

이 프로토콜에 기술된 절차는 이전에 상파울루 대학의 생물 의학 과학 연구소의 동물 사용 윤리위원회에 의해 제브라피시 모형에 이용되기 위하여 승인되었습니다. 1. 시스플라틴 인트라페론 주입에 의한 AKI 유도 재고 용액을 850 μg/mL로 0.9% NaCl로 희석하여 시스플라틴 작업 솔루션을 준비하십시오. 빛으로부터 보호, 실온에서 유지합니다.주의: 제작은 고글, 장갑 및 실험실 코트를 포함한 개인 보호 장비 (PPE)로 시스플라틴을 조작할 것을 권장합니다. 빛으로부터 보호되는 실온에서 스톡 솔루션을 보관하십시오. 시스템수(45)에서150 mg/L MS-222(트리카인) 마취제를 준비한다. 약 1-2 분 동안 침수하여 성인 얼룩말 피시 (5-9 개월)를 마취합니다.참고 : 효과적으로 마취 된 물고기는 터치에 응답하지 않아야합니다. 효과적인 마취를 테스트하려면 카달 지느러미를 부드럽게 눌러 반응을 관찰합니다.주의: 트리카인은 피부와 눈에 자극제이며 PPE를 사용하여 조작합니다. 플라스틱 숟가락을 사용하여 물고기를 종이 타월과 같은 흡수성 표면으로 옮겨 몸 주위의 과도한 물을 제거합니다. 그런 다음 플라스틱 숟가락으로 물고기를 페트리 접시에 옮기고 물고기를 무게로 옮기습니다. 그것은 복용량 계산에 필요한 것 이다 물고기의 무게의 주의.참고 : 물고기에서 여분의 물을 흡수하면 동물의 체중이 과대 평가되지 않으며 물고기에 대한 편견이기 때문에 지나치게 건조하지 않습니다. 120 μg/g의 중량의 최종 투여량을 달성하기 위해, 시스플라틴 작업 용액(850 μg)의 μg당 최종 용량(120 μg)의 μg를 나누고 이 숫자를 1000μg(μL)로 변환하여 120μg의 부피를 얻습니다(141L). 그런 다음 물고기(g)의 중량에 대해 이 숫자(141.2 μL)를 곱하여 최종 부피를 주입하게 한다. 플라스틱 숟가락으로 젖은 스폰지에 물고기를 옮기고 약간 잘라서 복부 쪽을 위로 올려 다드시게합니다. 스폰지는 시스템 물에 마취와 젖은해야합니다. 31 G 1.0 mL 인슐린 주사기를 cisplatin 작업 용액의계산된 부피로 채웁니다. 바늘을 골반 지느러미 근처의 동물의 복막 부위에 삽입하여 얕은 각도로내장(도 2A)을뚫지 않도록 합니다. 그런 다음 천천히 용액을 주입합니다. 주사 후 마취에서 회복하기 위해 탱크에 물고기를 배치합니다. 정상적인 회복의 징후(예 : 수영 운동, 안구 운동)에 대한 물고기를보십시오.참고: 동물은 다음 3-5분 안에 회복해야 합니다. 필요한 경우 플라스틱 숟가락, 파스퇴르 플라스틱 파이펫으로 움직이거나 거품이있는 호스에 가까이 두어 물고기를 자극하십시오. 제어 물고기의 경우 0.9 % NaCl의 용액을 주입하여 동일한 절차를 수행하십시오. 체급의 비율에 따라 동일한 계산을 사용하십시오: 주입되는 부피는 물고기의 무게(g)를 곱한 141 μL이 됩니다. 다음날(그림 2B)에서하루에 두 번 이상 물고기의 생존을 모니터링합니다. 2. 면역 세포의 유동 세포종에 대한 신장 격리 및 조직 처리 이 절차에 대 한, 면역 세포 형광 표시 형질 형 질 동물을 사용(예를 들어,Tg(mpo:GFP)). 120 μg/g 시스플라틴24마피 후 저열 쇼크(급속한 냉각)로 동물을 안락사시합니다.참고: 저열 쇼크는 MS-222 과다 복용보다 안락사 방법으로 더 효과적인 것으로 입증되었습니다. 저열 쇼크는 MS-222의 사용보다 스트레스가 적고 빠르며 일관적이며 직원에게 안전하며이전에는 46,47을설명했습니다. 외부 횡단 탱크에서 얼음의 5:1 비율로 얼음물을 시스템 물에 넣고 내부 탱크를 얼음 위에 스크린으로 놓고 물이 2-4 °C에 도달 할 때까지 기다립니다.참고: 물고기는 열 화상과 통증을 유발할 수 있기 때문에 얼음과 직접 접촉해서는 안됩니다. 동물을 얼음물로 옮기고, 방향이 손실되고 안구 이동이 없을 때까지 최소 10분 이상 기다립니다. 플라스틱 숟가락으로 생선을 종이 타월에 놓고 여분의 물을 건조시다. 물고기를 3% 아가로즈 해부 판으로 옮기고 상부 조명이 있는 스테레오스코프 아래에 가져가십시오. 가위로, 눈 바로 뒤에 빠른 컷을 만드는 물고기를 참수, 머리를 제거. 미세 한 가위로 클로카에 열린 측면에서 잘라 미세 한 집게와 내부 장기를 제거 합니다. 곤충 핀을 사용하여 신체 벽의 측면을 꼬집어 시체를 열고 백본에 부착 된 신장을 노출하십시오. 미세 한 집게와 신장을 분리 하 고 1 x PBS/2% FBS의 차가운 용액으로 6 웰 플레이트에 장기를 배치 합니다. 얼음을 유지합니다. 파스퇴르 플라스틱 파이펫으로 조직을 집어 들고 50mL 튜브를 통해 40 μm 세포 여과기를 통과하여 주사기 플런저로 부드럽게 선별합니다. 1x PBS/2% FBS1mL로 두 번 세척하고 50mL 튜브로 세포를 수집합니다. 4°C에서 5분 동안 400 × g의 원심분리기 세포. 조심스럽게 1 mL 마이크로 파이프로 모든 상체를 선택하고 폐기. 감기 1x PBS 500 μL을 추가하여 세포를 다시 중단하고 5mL 흐름 세포측정관에 넣습니다. 얼음을 유지합니다. 트리판 블루에서 1:10 희석을 만드는 노이바우어 챔버의 세포를 카운트(예를 들어,샘플의 10 μL을 가지고 트립판 블루의 90 μL와 혼합). 노이바우어 챔버에 혼합물의 10 μL을 추가하고 현미경으로 세포를 계산합니다.참고: 최적의 결과는 1-5 x 106 셀/mL 및 >80% 생존능력으로 예상됩니다.주의: 트라이판 블루는 발암제이며 PPE를 사용하여 처리합니다. 세포계에 의해 읽을 수있는 세포를 가져 가라. 그런 다음 관심 있는 인구를 선택하는 결과를 분석합니다. 3. TUNEL 분석용 성인 제브라피시 신장 조직 처리 이 절차에 대 한, 야생 형 동물(예를 들어,AB, Tübingen, 등) 또는 TUNEL 키트 보다 다른 형광 색을 가진 형질 동물을 사용 하 여, 비슷한 형광TUNE의 분석을 방해할 수 있습니다. 120 μg/g 시스플라틴24마피 후 저열 쇼크(급속한 냉각)로 동물을 안락사시합니다. 2.3-2.4를 참조하십시오. 2.5-2.6에 설명된 대로 물고기를 해부한다. 신장은 고정 절차 도중 백본에 붙어 있어야 합니다 (아래에 설명된). 곤충 핀을 사용하여 신체 벽의 측면을 꼬집어 시체를 열고 코르크 표면에 고정하여 신장을 노출시합니다.참고: 이 절차는 신장이 나중에 분석을 위한 적당한 위치에 남아 있는지 확인합니다. 그런 다음 신장이 6 웰 플레이트에 내려 와 코르크 표면을 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)의 갓 만든 용액 위에 놓습니다. 하룻밤 동안 4 °C로 유지하십시오.주의: PFA는 피부와 점액 표면에 대한 발암성 및 자극성입니다. 눈 보호 장비를 포함하여 PPE를 사용하여 화학 후드 아래에서 PFA 솔루션을 준비하십시오. 다음 날, 2.8에서와 같이 신장을 해부합니다. 신장을 1x PBS로 60mm 페트리 접시에 놓고 1x PBS로 두 번 헹구는 다. 조직에 대한 지지 매트릭스를 생성하기 위해 2 % 아가로즈를 준비합니다. 페트리 접시에서 남은 1x PBS를 모두 버리고 2% 아가로즈를 천천히 부어 전체 장기를 덮습니다. 그런 다음 신장이 접지되는 것을 방지하기 위해 스테레오 현미경으로 미세 한 집게를 사용하여 신장을 배치합니다. 실온에서 아가로즈가 고화시키도록 하십시오.참고: 이 절차는 장기의 잎 모양이 지지 매트릭스 내부에 없는 경우 접는 경향을 일으키기 때문에 조직학적 처리를 통해 장기의 방향과 모양을 유지합니다. 아가로즈 고화 후 메스를 사용하여 조직 주위의 아가로즈를 자르고 작은 큐브를 형성하고 조직 주위의 아가로즈를 제거하십시오. 아가로즈 큐브를 조직학적 처리에 적합한 카세트에 넣습니다.참고: 다음 단계는 수동으로 또는 자동 티슈 프로세서에서 수행할 수 있습니다. 먼저, 실온에서 각각 45분 씩 다음 단계로 카세트에서 티슈를 처리하고, 1개의 목욕50%, 에탄올 70%, 에탄올 95%의 2회 연속 목욕탕, 100% 에탄올3회 연속 목욕. 그 후, 자일렌의 2회 연속 목욕탕과 파라핀 3회 연속 목욕탕에서 조직을 처리한다. 후자는 60 °C에서 각각 1 시간 동안 지속됩니다.주의: 화학 후드 아래에서 변경, 에탄올과 자일렌에서 증기는 자극과 독성입니다. 파라핀 블록을 준비하려면 파라핀 렌틸콩을 60°C로 녹입니다. 내부에 티슈가 있는 플라스틱 카세트를 열고 따뜻한 접시에 보관하십시오. 파라핀을 위한 워밍업 금속 금형. 핀셋으로 조직을 금속 금형 위에 배치하여 신장 길이가 금형 베이스와 평행하도록 합니다. 파라핀을 추가하고 필요한 경우 조직을 재할당합니다. 카세트의 베이스로 금형을 덮고 그리드가 덮일 때까지 파라핀을 추가합니다. 실온에서 고화한 다음 -20°C에 배치하여 더 빠른 응고 공정을 허용합니다. 20-30분 후 금속 금형에서 파라핀 블록을 방출합니다. 마이크로토메를 사용하여 파라핀에 내장된 조직을 5 μm 두께로 섹션화합니다. 조직을 수집하기 위해 사분해 또는 양으로 충전 된 유리 슬라이드를 사용합니다. 4. 튠 분석 참고: 다음 프로토콜은 In Situ 세포 사망 탐지 키트(재료 표)를 사용합니다. 5 분 동안 자일렌의 두 개의 연속 목욕에 배치 탈왁스 조직 슬라이드. 그런 다음 등급이 매겨진 일련의 에탄올을 통해 조직을 수화합니다: 각각 100%-95%-70%-50%, 5분마다. 차가운 수돗물에 슬라이드를 놓아 에탄올을 헹구십시오. 슬라이드를 증류수에 보관하십시오. 어두운 인큐베이터 챔버를 준비합니다. 잠복 단계 동안 수분을 유지하기 위해 바닥에 젖은 종이 타월을 추가합니다.참고: 인큐베이터 챔버가 부족하면 바닥에 촉촉한 종이가 있는 페트리 접시와 슬라이드를 배치하기 위해 두 개의 이쑤시개를 사용할 수 있습니다. 신선한 Proteinase K 작업 용액준비 : 10 mM Tris / HCl, pH 7.4-8에서 10 μg / mL.참고: Proteinase K는 제조업자가 권장하는 투과성 제제로 사용됩니다. 어두운 인큐베이터 챔버에 슬라이드를 놓고 커버 샘플까지 Proteinase K 작업 용액을 추가합니다. 37 °C에서 30 분 동안 배양하십시오. 샘플이 인큐베이팅되는 동안 TUNEL 반응 혼합물을준비하십시오: 450 μL 라벨 용액에 50 μL의 효소 용액을 추가합니다. 빛으로부터 보호하십시오.참고: 준비해야 할 볼륨은 동일한 1:10 비율로 조정할 수 있습니다. 부피는 각 섹션에 대한 혼합물의 50 μL로 계산됩니다. 이는 샘플의 크기에 따라 변경될 수 있습니다. 어두운 챔버를 들고 1x PBS로 슬라이드를 두 번 씻으십시오. 다음으로, 흡수성 종이를 사용하여 시료 주변의 부위를 건조시키고 각 조직 슬라이드에 TUNEL 반응 혼합물의 50 μL을 추가하고, 전체 샘플이 덮여 있도록 용액을 확산시다. 2 시간 동안 37 °C에서 인큐베이션하십시오. 빛으로부터 보호하십시오. 인큐베이션 후 1x PBS로 슬라이드를 세 번 헹구고 종이 타월을 사용하여 시료 주변의 부위를 건조시로 건조시. DAPI 1:1000의 50 μL을 샘플에 추가하고 핵 카운터 스테인링을 위해 실온에서 5 분 동안 인큐베이션하십시오. 빛으로부터 보호하십시오. 1x PBS로 다시 세 번 헹구고 시료 주변의 부위를 건조시하십시오. 페이드 방지 친성 배지로 슬라이드를 마운트하고, 커버슬립을 배치하고, 매니큐어로 밀봉합니다. 4°C에서 빛으로부터 보호된 수평으로 슬라이드를 저장합니다.참고: 마운팅 매체의 페이드 방지 특성은 시료의 형광을 보존하지만 사용 가능한 모든 친성 성 배지를 사용할 수 있습니다. 매니큐어를 가진 마지막 밀봉 단계는 탈수를 피하기 위해 중요합니다. 형광 현미경의 밑에 견본을 시각화합니다. 형광 색소의이 유형의 경우, 520-560 nm (녹색) 범위에서 발산 파장을 사용하고 570-620 nm (빨간색)의 범위에서 검출하십시오.