アエデスアエジプティ蚊における微小胞体寄生虫・エダリア・アダイスの伝播

1. 0日目 ハッチ Ae. aegypti卵は 、1 L脱イオン化(DI)水で幼虫飼育トレイに入れることによって E.アデシス に感染した。魚の食べ物の50mgを追加します。注:公開時点では 、E.aedis の実験室株は 、E.aedis が長期保存に適しておらず、感染した卵が現在リポジトリに保存されていないので、寄生虫を積極的に研究している実験室からしか利用できません。 E.aedis での作業に興味のある研究者は、感染した卵を要求するために対応する著者に連絡することができます。注:感染した卵の多数を孵化することは、一般的に必要ではありません。10 E.aedis感染Ae.aegypti幼虫は、1000≥健康な幼虫を投与するのに十分である。注:このプロトコルのすべての部分について、我々は次の条件で蚊を収容しました:14時間/10時間明暗サイクル、27 °C温度および80%相対湿度。 2. 1日目 孵化後、幼虫の密度をトレイあたり〜100個の幼虫に減らし、必要に応じて新しいトレイを作ります(1 L DI水でも)。 各トレイに乾いたキャットフードを1個ずつ加えます。食べ物を枯渇させたら補充するが、過剰な食料を提供しない。3日ごとに1個のキャットフード(約200mg)で十分です。注:特定の飼育条件に応じて食品量を調整します(すなわち、水が濁ったり幼虫が死んでいる場合は食物を減らし、幼虫が発達に著しく遅れている場合は食物を増やします)。ここで提案されているものよりも他の摂食レジメンおよび/または飼育条件を使用することができますが、この標準プロトコルのタイミングの調整が必要な場合があります。 3. 日 4\u20125 感染した幼虫が3rd – 4th 星である場合、新しいトレイに健康/感染していない Ae.aegypti 卵を孵化させます。 健康な Ae.aegypti が48-72時間で2nd – 3rd instar に達するような密度でリア。私たちの手では、これは食品への アドリビタム アクセスを持つ水の1 Lあたり200\u2012300幼虫の密度を使用して達成することができます。複数の日にわたって健康な卵の孵化バッチは、幼虫が必要なときに正しい段階であることを保証することができます。 4. 7\u20128:水平伝送 注:E.aedisで健康な幼虫のドージングは、単核胞子が感染した幼虫で高い数になるまで行うことができません(1 x 104 – 1 x 10 6 106幼虫あたり)。これは4番目のインスターステージの後半で起こります(図2)。 単核胞子を収穫し、定量化する。 10の感染した幼虫を1.5 mLマイクロ遠心分離管に移すために、移管ピペット(先端を広い直径に切らなければならない場合があります)を使用してください。 移送ピペットで繁殖水を取り除き、1mLのきれいなDI水を加えて1回洗います。洗浄水をピペットで取り出し、500μLのきれいなDI水を10の幼虫に加え、害虫と機械ホモジナイザーを使用して均質化します。 400倍の倍率でヘモサイトメーターを使用して胞子を定量化します。注:単核胞子は、その異なるピリ形状(すなわち、梨の形状)によって識別することができます。 図 2A)。 E.アエディスで健康的なAe.アエジプティ幼虫を投与する。 肝臓パウダー1.2g、醸造酵母0.8g、水100mLを混合して新鮮な幼虫食品スラリーを作ります。注:食品は、オートクレーブされ、使用するまで4°Cで保存されている場合は、新鮮である必要はありません。 100 2nd – 3rd instar ヘルシー Ae.aegypti 幼虫を150 mLビーカーまたは標本カップに移します。 5 x 104 – 1 x 105 5胞子で100の幼虫の各ビーカーを投与する。 100 mLの最終容積に2mLの幼虫食品スラリーとDI水を加えます。 12-24時間の暴露の後、標準的な飼育プロトコル16に従って、幼虫を飼育トレイに移し、後部から成人期に移す。 5. 監視と垂直伝送 彼らはケージ内の出現カップに開発するように子犬と移動子犬のための監視幼虫。砂糖フィード大人のアドリビタム(16、17あたり)。閉鎖的な成人はE.aedisによって感染します。 血液は成人(16、17)に与え、卵を集める。E.aedisの垂直伝達は、このステップで発生する。注:卵子が完了するとすぐに追加の血液食事が提供された場合、女性は成人が(しばしば突然の)高いレベルの死亡率に苦しむ前に、卵の少なくとも1つの追加クラッチを産むことができます。 E.aedisに感染したこれらのAe.aegypti卵を使用して、このプロトコルのステップ1から始まる伝播を続けます。注:卵は、適切な条件16の下で2〜3ヶ月間保存することができます。 E.aedisに接触したすべての材料を10%漂白剤とオートクレーブ(可能であれば)で洗浄して汚染を防ぎます。