JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생화학

Извлечение и количественная оценка растворимых, радиозамазаемых поликомолокаторов инозитолов различных видов растений с использованием SAX-HPLC

Published: June 26, 2020
doi:
10.3791/61495
, , ,
1Department of Plant Nutrition, Institute of Crop Science and Resource Conservation,University of Bonn

Summary

Здесь мы описываем сильный анионный обмен высокой производительностижидкой хроматографии 3H – мио-инозитол помеченные саженцы, который является очень чувствительным методом для обнаружения и количественной оценки инозитол полифосфатов в растениях.myo

Abstract

Фосфатные эфиры мио-инозитол, также называют инозитол фосфатов (InsPs), являются классом клеточных регуляторов, играющих важную роль в физиологии растений. myo Из-за их отрицательного заряда, низкого изобилия и восприимчивости к гидролитической деятельности, обнаружение и количественная оценка этих молекул является сложной задачей. Это особенно касается высоко фосфорилированных форм, содержащих «высокоэнергосбережные» дифосфосфос-связи, также называются инозитол пирофосфатами (PP-InsPs). Из-за своей высокой чувствительности, сильный анионный обмен высокой производительности жидкой хроматографии (SAX-HPLC) растенийпомечены 3H – мио-инозитол в настоящее время метод выбора для анализа этих молекул.myo С помощью3H-myo-inositolдля рассада растений радиолабеля, различные виды InsP, включая несколько неантиомерных изомеров, могут быть обнаружены и дискриминированы с высокой чувствительностью. Здесь описана установка подходящей системы SAX-HPLC, а также полный рабочий процесс от выращивания растений, радиосвязи и извлечения InsP до запуска SAX-HPLC и последующего анализа данных. Протокол, представленный здесь позволяет дискриминации и количественной оценки различных видов InsP, в том числе несколько неантиометрических изомеров и PP-InsPs, InsP7 и InsP8, и могут быть легко адаптированы к другим видам растений. В качестве примеров SAX-HPLC проводятся анализы саженцев арабидопсиса талиана и lotus japonicus и представлены и обсуждены полные профили InsP. Описанный здесь метод представляет собой перспективный инструмент для лучшего понимания биологических ролей insPs в растениях.

Introduction

Почти четыре десятилетия назад, инозитол фосфатов (InsPs) появились в качестве сигнальных молекул, после Ins (1,4,5)P3 (InsP3) был определен в качестве второго посланника, который активирует рецептор опосредованного выпуска Ca2 “в клетках животных 1,2. На сегодняшний день, не InsP3 рецептор (IP3-R) был выявлен в растениях, что ставит под сомнение прямую роль сигнализации для InsP3 в клеткахрастений 3. Несмотря на это, InsP3 служит предшественником для других InsPs, участвующих в нескольких процессах развития растений, в том числерегулирование конкретных сигнальных путей 3,,4,,5,,6,,7,,8. Например, InsP3 может быть дополнительно фосфорилирован в InsP6, также известный как “фитовая кислота”, которая представляет собой основной источник фосфатов,мио-инозитол и cations, и было показано, играют ключевую роль в защите растений от патогенов, экспорт мРНК и фосфат гомеостаз5,9,10,11,12.

Инозитол пирофосфаты (PP-InsPs) являются классом InsPs, которые содержат по крайней мере один высокой энергии ди-фосфо связи, первоначально определены в клетках животных, амебы и дрожжей, где они играют важную рольв различных клеточных процессов 13,14,15. Несмотря на семенную работу по PP-InsPsв растениях 16,17,18,19,20,21, 22,23,24,2524,,26 , биологические функциии изомер идентичности этих молекул по-прежнему остаются в значительной степени загадочным. В модели растения Arabidopsis thaliana, клеточный InsP8 было предложено регулировать защиту от травоядных насекомых и некротрофических грибов с помощью совпадения обнаружения InsP8 и активного ясмоната на ASK1-COI1-JAЗ рецепторногокомплекса 17. Кроме того, роли InsP8 и других PP-InsPs в энергии гомеостаза и зондирования питательных веществ, а также фосфат гомеостазабыли предложены 17,23,24,25,26.

Независимо от используемой биологической системы, одной из основных методологических проблем при изучении InsPs было надежное обнаружение и точная количественная оценка этих молекул. Методы на основе масс-спектрометрии используются для обнаружения insPs, в том числе PP-InsPs, из клеточных экстрактов. Тем не менее, эти исследования не смогли дифференцировать различныеизомеры 26,27. Другой подход к анализу InsPs использует выдвижной InsPs из клеток лизатов с помощью TiO2 бусы, а затем полиакриламинид гель электрофорез (PAGE) из эластитных InsPs. InsPs могут быть окрашены либо толуидин синий или DAPI24,28,29. Тем не менее, это до сих пор не возможно надежно обнаружить InsPs ниже, чем InsP5 из растительных экстрактов с помощью этого метода. Недавно был опубликованметод, использующий 13C-myo-inositolдля анализа ядерных магнитных резонансов (NMR) InsPs в качестве альтернативы высокой асионной жидкой хроматографии (SAX-HPLC)30. Этот метод, как сообщается, достичь аналогичной чувствительности по сравнению с SAX-HPLC и позволяют обнаружения 5-InsP7, а также дискриминации различных неантиомических изомеров InsP5 из клеточных экстрактов. Тем не менее, внедрение метода, основанного на ЯМР, требует химического синтеза и коммерчески недоступен– 13C – мио-инозитол.myo Таким образом, метод, используемый в большинстве случаев является радиолабеляобразцов с No 3H – мио-инозитол, а затем SAX-HPLC31,32,33.myo Этот метод основан на поглощении радиоактивного мио-инозитол в растение и его преобразовании в различные InsPs по комбинированной активности выделенных клеточных киназы и фосфаты. myo

InsPs с маркировкой3H’S затем извлекаются из кислоты и фракционены с помощью SAX-HPLC. Из-за отрицательного заряда InsPs сильно взаимодействуют с положительно заряженной стационарной фазой колонки SAX-HPLC и могут быть эластимы с буферным градиентом, содержащим увеличение концентраций фосфатов, чтобы outcompete InsPs из столбца. Таким образом, время elution зависит от заряда и геометрии видов InsP, которые будут разделены. При отсутствии хиральных столбцов, только неантиомические изомеры могут быть разделены этим протоколом. Тем не менее, радиозапеваемые стандарты могут быть использованы для присвоения изомерного характера конкретного пика InsP. Многочисленные усилия, предпринятые в прошлом различными лабораториями по созданию маркированных и немаркированных стандартов с помощью (био)химических методов или по их очистке от различных клеток и организмов, помогли назначить пики определенным видам InsP, а также сузить изомерикную идентичность отдельных видов InsP5,,7,,21,,34,,35,,36,,37,,38,,39,,40,,41,,42,,43. Кроме того, недавнее выяснение энзиматических путей, ведущих к образованию PP-InsPs в растениях, а также открытие бактериального типа III эффектор с конкретной 1-phytase деятельности, предоставить информацию о том, как генерировать полезныестандарты для этих анализов 10,17,18,22,23.

Полученные фракции могут быть измерены в жидком счетчике сцинтилляции из-β распада трития(3H). С увеличением времени маркировки, устойчивое состояние изотопного равновесия достигнуто, после чего полученные профили InsP должны представлять статус InsP завода31. Основным преимуществом этого протокола по сравнению с другими доступными методами является высокая чувствительность, достигнутая за счет использования прямого прекурсора для InsPs и измерения радиоактивного сигнала.

SAX-HPLC образцов, извлеченныхиз »3 H»–мио-инозитол помеченных растений или других организмов, обычно используется для обнаружения и количественной оценки InsPs, начиная от более низких видов InsP pp-InsPs, представляющих собой ценный инструмент, чтобы лучше понять метаболизм, функции и способы действия InsPs. До сих пор этот метод также является наиболее подходящим выбором для исследователей с особым интересом к более низким видам InsP. Хотя основы этой процедуры, на которых протокол описан здесь строится на, былиранее описаны 7,21,31,34, подробный протокол с учетом анализа растительных insPs и особенно PP-InsPs по-прежнему отсутствует. Предыдущие публикации сообщали о трудностях, связанных с надежной обнаружением низких обильных PP-InsPs, особенно InsP8,из-заодного или нескольких из следующих факторов: относительно низкое количество растительного материала,3H – мио-инозитол с низкой специфической активностью (Nogt; 20 Ci/mmol), использование буферов экстракции, которые либо не основаны на перхлорной кислоте, либо менее сконцентрированы,чем 1 М, различные нейтрализующие буферы, а также неоптимические градиентыили обнаружение детектора. По сравнению с этими исследованиями, представленный здесь протокол предназначен для надежного обнаружения PP-InsPs7,,21,,34.

Здесь мы представляем подробный рабочий процесс, начиная от установки оборудования для выращивания растений и маркировки, извлечения InsP и SAX-HPLC запустить себя. Хотя метод был оптимизирован для модели завода A. thaliana, он может быть легко изменен для изучения других видов растений, как показано здесь с первым сообщил InsP профиль модели бобовых Lotus japonicus. Хотя использование различных видов растений может потребовать некоторой оптимизации, мы предполагаем, что они будут незначительными, что делает этот протокол хорошей отправной точкой для дальнейших исследований в растительных InsPs. Для того, чтобы облегчить возможную оптимизацию, мы указываем каждый шаг в протоколе, в котором возможны изменения, а также все критические шаги, которые могут быть сложными при создании метода в первый раз. Кроме того, мы сообщаем о том, как данные, полученные с помощью этого метода, могут быть использованы для количественной оценки конкретных insPs и как различные образцы могут быть проанализированы и сопоставлены.

Protocol

1. Настройка системы HPLC Настройка системы, состоящей из двух независимых насосов HPLC (двоичный насос), по одному для каждого буфера. Оба насоса должны управляться вместе с помощью компьютера с соответствующим программным обеспечением или с помощью мастер насоса. Осуществление поршневой уплотнения мыть для обоих насосов, либо с помощью гравитационных сил или через третий насос низкого давления. Назначить один насос для буфера А (термин насос А) и один для буфера B (называется насос B).ПРИМЕЧАНИЕ: Оба должны быть в состоянии генерировать давление до 60 бар (6 MPa) и скорость потока, по крайней мере 0,5 мл / мин. Подключите оба насоса к динамическому смеситель. Подключите смеситель к клапану впрыска с пробной петлей емкостью не менее 1 мл. Подключите клапан впрыска к столбец с капилляром через соответствующие конечные фитинги. Подключите столбец к коллектору фракций с помощью капилляра соответствующей длины.ПРИМЕЧАНИЕ: Это описание основано на нашей системе HPLC (см. таблицу материалов), которая требует больше ручных шагов, чем новые и более сложные системы. Наша система позволяет легко получить доступ и модифицию всех компонентов. Четвертичные насосы (с бинарным градиентом, описанным здесь) также могут быть использованы и приведут к элюционным профилям и общему качеству анализов, аналогичных тем, которые достигаются с помощью бинарных насосов. 2. Подготовка буферов, столбца и системы HPLC Подготовь буферы для извлечения растворимых insPs: буфер извлечения (1 M HClO4) и буфер нейтрализации (1 M K2CO3). Подготовь оба буфера с ультра-чистой деионизированной водой. Они стабильны при комнатной температуре в течение нескольких месяцев. Непосредственно перед извлечением добавьте EDTA к обоим решениям к окончательной концентрации 3 мМ (например, из отфильтрованного 250 мМ угота EDTA).ВНИМАНИЕ: HClO4 (перхлорная кислота) сильно коррозионна. Подготовка буферов для запуска SAX-HPLC: буфер A (1 мМ EDTA) и буфер B (1 мМ EDTA, 1,3 М (NH4)2HPO4; рН 3,8 с H3PO4). Подготовьте как с помощью ультра-чистой деионизированной воды с последующим вакуумной фильтрацией с мембранными фильтрами размером с 0,2 мкм. Они стабильны при комнатной температуре в течение нескольких месяцев.ПРИМЕЧАНИЕ: EDTA должны быть включены во все буферы для предотвращения взаимодействия cations с InsPs, что может привести к изменению заряда InsP или даже нерастворимых комплексов соли InsP. Программа градиента следующим образом: 0’u20122 мин, 0% буфер B; 2’u20127 мин, до 10% буфера B; 7’u201268 мин, до 84% буфера B; 68-u201282 мин, до 100% буфера B; 82’u2012100 мин, 100% буфер B, 100’u2012101 мин, до 0% буфера B; 101-u2012125 мин, 0% буфер B. Оптимальная скорость потока для этого градиента составляет 0,5 мл/мин. Во время пробежки, собирать фракции каждую минуту, начиная с минуты 1 до минуты 96. Оставшиеся 30 минут градиента служат для мытья колонны и системы, и не должны быть собраны для подсчета сцинтилляции. Если это возможно, установите максимальное достижимое давление перед аварийным отключением насосов HPLC до 80 бар (8 MPa). Это предотвращает критические повреждения смолы столбца. При использовании новой колонки SAX HPLC перед первым использованием тщательно вымойте ее (50 мл) фильтрованной ультра-чистой деионизированной водой.ПРИМЕЧАНИЕ: Это обеспечит удаление содержащегося метанола, тем самым предотвращая осадки соли в более поздних шагах. Если возможно, используйте отдельный насос HPLC. Если это не доступно, убедитесь, что HPLC покраснел с водой перед стиркой колонки. Скорость потока не должна превышать 2 мл/мин. После мытья, столбец готов к анализу и, при надлежащей работе, может быть использован для 20’u201240 работает. После этого резолюция будет последовательно уменьшаться. Длительное мытье с буфером A (Nogt;1 h) и выполнение шага 2.6 может помочь увеличить срок службы столбца. Если уменьшение разрешения сохраняется, столбец должен быть обменяться. Градиент может быть скорректирован, чтобы увеличить разделение между конкретными видами полифофата инозитол или уменьшить общее время выполнения. Использование различных систем HPLC (с разным объемом пустоты или различным объемом капилляров) сильно повлияет на время удержания. Кроме того, изменения столбца имеют незначительное влияние на время удержания. Выполните “макет запуска”. Вместо извлеченного образца в систему HPLC вводится ультра-чистая деионизированная вода и работает стандартный градиент. Фракции не должны быть собраны.ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 2.6 не является обязательным. Однако она должна быть выполнена, если применяется одна из следующих ситуаций: установлен новый столбец; Система HPLC была использована для другого метода заранее; Система HPLC не используется более 3 дней; Была проблема с предыдущим запуском. 3. Выращивание растений и маркировка с3H’ -мио-инозитол ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги должны быть выполнены с стерильными компонентами и в стерильныхусловиях, в то время как носить перчатки для защиты рук от загрязнения с радиолабелем. Растительные средства массовой информации, особенно при содержании сахарозы, подвержены микробному загрязнению. Стерилизовать семена A. thaliana с 1 мл 1,2% гипохлорита натрия в течение 3 мин с последующим 1 мл 70% этанола в течение 3 мин. Затем добавьте 1 мл 100% этанола, пипетку семена с этанолом на круглую фильтровальную бумагу и дайте им высохнуть под ламинарным потоком на чистой скамейке. При использовании семян L. japonicus поместите их в ступку и скраб семена с наждачной бумагой перед стерилизацией, чтобы обеспечить достаточную скорость прорастания. Посеять семена Арабидопсиса в 1-2 ряда на квадратных чашках Петри, наполненных твердыми средствами роста, состоящими из полутвердых murashige и Skoog (MS) раствор соли, 1% сахарозы, 0,7% гелеобразной резинки в деионизированной воде, приспособленной к рН 5.7 с KOH и позволяют им стратифицировать, по крайней мере 1 день при 4 градусах в темноте. Для семян лотоса, сеять их в 1 ряд на площади Петри блюда заполнены твердыми средствами роста, состоящий из 0,8% бактериологических агара в деионизированной воде и позволяют им стратифицировать, по крайней мере 3 дней при 4 градусов по Цельсию в темноте. Поместите пластины вертикально в инкубатор роста или климатическую камеру и дайте им расти в течение 10-12 дней в условиях короткого дня (8 ч света при 22 градусов по Цельсию, 16 ч темно при 20 градусов по Цельсию). Передача 10-20 саженцев в один колодец из 12-хорошо ясно плоский дном пластины культуры клеток заполнены 2 мл полу прочности MS солевой раствор дополняется 1% сахарозы и скорректированы до рН 5,7. Добавьте 45 ци3 H-мио-инозитол (30-80 Ci/mmol, растворенный в 90% этанола) и смешайте нежным вихрем.myo Обложка пластины с соответствующей крышкой и запечатать его с микропорной хирургической лентой (например, микропор или лейкопор ленты), поместив его обратно в инкубатор роста.ВНИМАНИЕ: – это низкоэнерго-бета-излучатель, который может представлять вредную радиационную опасность при вдыхании, проглатываниях или поглощении через голую кожу.3 Всегда носите перчатки при обращении с радиоактивным материалом или оборудованием, которое имеет прямой или косвенный контакт с радиоактивным материалом. Также следуйте местным правилам безопасного обращения с радиохимическими веществами (например, ношение дополнительной защитной одежды, использование дозиметра и обследования поверхностей на регулярной основе). После 5 дней маркировки, удалить саженцы из средств массовой информации и мыть их кратко с деионизированной водой. Высушите их бумажными полотенцами и перенесите в микроцентрифугную трубку 1,5 мл. Не переполняй трубку, а поместите не более 100 мг FW/tube, что соответствует примерно 10-201220 17-дневным саженцам.ПРИМЕЧАНИЕ: Избыток растительного материала разбавит кислоту в процессе экстракции и сильно снизит эффективность экстракции. Snap-заморозить трубку в жидком азоте и хранить его при -80 градусов по Цельсию до извлечения.ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут храниться при -80 градусов по Цельсию в течение нескольких недель без ущерба для качества образца. Условия роста (медиа, свет, температура, время) могут быть изменены в соответствии с потребностями конкретного эксперимента или видов растений. Тем не менее, следует позаботиться о разбавления3H – мио-инозитол, для того, чтобы обеспечить количественно SAX-HPLC работает хорошего качества.myo Таким образом, рекомендуется начать с 3 Hmyo- мио-инозитол концентрации заявил здесь и уменьшить его шаг за шагом при желании.3 Во время маркировки растения могут быть представлены на различные процедуры (например, экологические стрессы или химические агенты) для оценки воздействия этих условий на глобальные insPs. Для достижения стабильного состояния маркировки, мы рекомендуем маркировать растения, по крайней мере 5 дней. 4. Извлечение растворимых insPs ПРИМЕЧАНИЕ: Храните образцы и реагенты на льду в течение всего процесса экстракции. Всегда носите перчатки и защитные очки из-за высокого риска контакта с радиоактивным материалом, особенно во время измельчения. Все, что сое получает контакт с образцами, рассматривается как радиоактивные отходы и должно быть утилизировано в соответствии с местными правилами безопасной утилизации радиоактивных материалов. Подготовь рабочие решения для буфера извлечения и нейтрализации в шаге 2.1. Для каждого образца потребуется 600 МКЛ буфера и 400 МКЛ буфера нейтрализации. Храните буферы на льду. Возьмите образцы из морозильной камеры -80 градусов по Цельсию и храните их в жидком азоте до дальнейшей обработки. Измельчить образцы с микроцентрифугой трубки пестик, пока они не начнут оттаивать и добавить 500 йл ледяной буфер извлечения. Продолжайте шлифовку до тех пор, пока образец не будет полностью гомогенизирован и раствор не будет иметь глубокий зеленый цвет (если листья присутствуют в образце). Центрифуга образцов в течение 10 мин при 4 градусов по Цельсию ≥ 18000 х г. Перенесите супернатант в свежую трубку 1,5 мл. Имейте в виду, что трубы, используемые для добычи считаются твердыми радиоактивными отходами и должны быть утилизированы соответствующим образом. Аккуратно добавьте в экстракт 300 МКЛ буфера нейтрализации. Осадки белков и пузырьков начнутся немедленно. Смешайте закрученного с наконечником пипетки через минуту и ждать в течение нескольких секунд, прежде чем трубопроводов небольшое количество (5 йл) на бумаге рН (в идеале диапазон рН 6-9). РН должен быть между рН 7 и 8 в конце. При необходимости добавьте небольшие количества (обычно 10–20 йл) буфера нейтрализации или буфера извлечения до достижения желаемого рН. Пусть образцы отдыхают на льду не менее 1 ч с открытой крышкой. Центрифуга образцов в течение 10 мин при 4 градусов по Цельсию ≥ 18000 х г. Перенесите супернатант в свежую трубку 1,5 мл.ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут быть либо непосредственно использованы в SAX-HPLC перспективе или храниться на льду (если используется позже в тот же день) или заморожены в жидком азоте и хранятся при -80 градусов по Цельсию в течение 2’u20124 недель. Для обеспечения высокой воспроизводимости и сопоставимости рекомендуется всегда замораживать образцы жидкого азота в течение 5 минут, даже если они будут непосредственно использоваться впоследствии. Долгосрочное хранение извлеченных образцов при -80 градусов по Цельсию возможно до тех пор, пока образцы разморожены только один раз. Если замороженные образцы используются для анализа, убедитесь, что частицы не видны после оттаивания. В противном случае, центрифуга снова в течение 10 минут при 4 градусов по Цельсию ≥ 18000 х г и передать супернатант в свежей трубке 1,5 мл. 5. Выполнение запуска HPLC Оборудовать коллектор фракции 96 небольшими сцинтилляционными флаконами (емкостью 6 мл) и заполнить каждый флакон 2 мл подходящего коктейля сцинтилляции (например, жидкий сцинтилляционный коктейль Ultima-Flo AP), совместимый с буферами с низким рН и высокой концентрацией фосфатов аммония (см. таблицу материалов).ПРИМЕЧАНИЕ: Количество флаконов и размер флаконов зависят от используемого счетчика фракций и счетчика сцинтилляции. Важно, по крайней мере, собрать первые 90 фракций, еслиградиент, описанный здесь используется, чтобы получить полный профиль инозитол полифосфата. Также убедитесь, что правильно маркировать каждый флакон и его соответствующей крышкой, чтобы предотвратить путаницу фракций или образцов. Запустите систему HPLC/насосы и подготовите ее к работе. Активируйте промывку поршневого уплотнения и держите его активированным в течение всего пробега. Загрузите образец вручную, впрысая полный супернатант из шага 4.5 (приблизительно 750 йл) с помощью подходящего шприца (см. таблицу материалов). Если возможна автоматическая инъекция, перенесите образец на соответствующий пробной флакон. Поверните клапан из “нагрузки” в “инъекционное” положение и запустите градиент и коллектор фракций.ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от используемой системы HPLC, стартовая процедура может отличаться, особенно при сравнении старых систем (как описано здесь) с полностью управляемой программным обеспечением новой моделью. Очень важно обеспечить, чтобы градиент, инъекция образца и сбор фракций начались одновременно. В то время как запуск HPLC продолжается, регулярно проверяйте давление. Стартовое давление должно быть около 18-24 бар (1,8-2,4 МП) и должны медленно расти до 50-60 бар (5-6 MPa) как только 100% буфер B достигнут.ВНИМАНИЕ: Снижение давления может указывать на утечку в системе, в то время как повышенное давление указывает на блокировку. Колебания давления (≥ 3 бар в течение нескольких секунд) может указывать на наличие воздуха в системе. Имейте в виду, что все, что покидает колонку, а также каждая утечка, которая происходит на инжекторе или после этого является радиоактивным.ПРИМЕЧАНИЕ: Давление также зависит от системы HPLC и может быть ниже или выше, чем указано здесь. Он будет медленно увеличиваться примерно после 15-20 работает. Однако это не обязательно влияет на качество полученных пробежек. После запуска, закрыть флаконы плотно и смешать фракции с сцинтилляции коктейль энергичной тряски. Продолжить непосредственно с измерением или держать флаконы в вертикальном положении, в идеале в темноте.ПРИМЕЧАНИЕ: Фракции, смешанные с коктейлем сцинтилляции, стабильны в течение нескольких недель и могут быть измерены позже. Поскольку срок полусыдием трития составляет 12,32 года, потеря сигнала незначительна. После того, как запуск последнего образца дня закончен, остановить оба насоса HPLC. (По желанию) Чтобы увеличить долговечность системы, особенно когда она не используется регулярно, мыть насос B и капилляры, поместив капилляр из буфера B в бутылку с буфером А и пусть насос работать в течение 10-15 мин. Перед следующим использованием, не забудьте заменить капилляр в буфер B и развязать насос B из смесителя, чтобы промыть его буфером B. После того, как насос и капилляры снова заполнены буфером B, подключим его к смеситель и система готова к использованию. 6. Измерение фракций Вставьте флаконы в стойки счетчика сцинтилляции и измерьте каждый флакон в течение 5 минут в жидком счетчике сцинтилляции. В идеале используйте стеллажи, которые непосредственно подходят небольшие флаконы и избежать висит во флаконах в больших (например, 20 мл) флаконы, чтобы уменьшить количество ошибок. Настройки программного обеспечения, используемые в этом протоколе, отображаются на дополнительном рисунке 1.ПРИМЕЧАНИЕ: Регулярно выполняйте протокол SNC (самореализация и калибровка) с использованием неутолимыхстандартов 3H. Более короткое время подсчета (1-5 мин) позволяет сократить время ожидания. Однако для обеспечения высокой воспроизводимости и точности рекомендуется 5 минут. 7. Анализ данных Экспорт измерений с счетчика сцинтилляции в качестве файла электронной таблицы или совместимого/конвертируемого формата файла. Оцените данные с помощью компьютера, оснащенного Excel или аналогичного программного обеспечения, и подходящего программного обеспечения для анализа, как Origin. Подготовье диаграммы 2-D линии, где измеренные отсчеты за минуту (cpm) построены против времени удержания (см. Рисунок 1, Рисунок 2). Чтобы сравнить образцы друг с другом, нормализуйте данные, подводя итоги cpm от каждой элализованной фракции от минуты 25 до 96 для каждого отдельного образца.ПРИМЕЧАНИЕ: Минута 25 используется в качестве отсеи, чтобы исключить неинкорпорированных3H – мио-инозитол, InsP1 и InsPmyo2 из анализа, так как те, как правило, сильно колеблются и не могут быть хорошо разделены (по крайней мере, с градиентом, предлагаемым в этом протоколе) и, таким образом, сильно изменить фактор нормализации из-за их высокой активности. Нормализуют все данные к выборке с наименьшим общим cpm (в фракциях 25’u201296) путем делить полный cpm от образца с самым низким cpm (в фракциях 25-96) общим cpm (в фракциях 25-96) других образцов. Полученный фактор может быть использован для нормализации cpm от каждой фракции путем умножения cpm каждой фракции с фактором.ПРИМЕЧАНИЕ: В конце концов, сумма значений cpm от минуты 25 до конца должна быть равной для всех образцов по сравнению друг с другом. Только нормализованные трассы должны быть представлены в том же графике/рисунке (при представлении в качестве фактических профилей). Дополнительный рисунок 2 показывает пример того, как эти шаги расчета сделаны (используя только фракции 25-35 из двух образцов для упрощения). Однако в некоторых случаях нормализовать данные не стоит. Например, когда пики количественно в соответствии с шагом 7.4 и представлены в процентах от общего числа InsPs (как показано на рисунке 3D). Как указывалось ранее, при представление нескольких анализов бок о бок в качестве профилей, или когда фактическая измеренная активность используется для выводов (например, лечение а) увеличивает InsP7 на x% по сравнению с контролем, ссылаясь на значения cpm InsP7 обоих образцов, а не их процент от общего числа InsPs) нормализация необходима. Для анализа влияния генотипа или различий в лечении на эффективность маркировки важно не нормализовать, так как это сделало бы эти различия недействительными. normalize Тем не менее, абсолютная количественная оценка с помощью этого метода является сложной задачей, поскольку эффективность извлечения с помощью этого протокола может быть переменной по разным причинам и иногда даже наблюдается при анализе реплики одного и того же генотипа и лечения. Имейте в виду, что в зависимости от системы HPLC, столбца и градиента, используемого для анализа, возможно, потребуется изменить сокращение. Для выполнения относительных количественных показателей некоторых пиков полифофата и последующего создания барных графиков, содержащих данные репликаций для статистического анализа, продолжайте анализ с помощью специализированного программного обеспечения, которое может вычислить пиковые области хроматограмм (например, Origin). Смотрите дополнительную цифру 3.ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство систем HPLC, управляемых программным обеспечением, поставляются с соответствующим программным обеспечением, способным к этой задаче. Пики определяются как фракции с значениями cpm выше фона (что варьируется в определенной степени между пробегами) и время хранения, аналогичное ранее опубликованным данным. Время удержания определенного пика определяется в программном обеспечении электронной таблицы (например, Excel) и используется для назначения пиков для расчета определенных интегралов (например, в Origin). Дополнительный рисунок 3 иллюстрирует этот процесс пикового определения, фонового вычитания и интеграции пиков.

Representative Results

Результаты, показанные здесь, направлены на иллюстрацию возможных результатов, полученных в соответствии с вариациями на техническом и биологическом уровнях. Первый примером является анализы с использованием новых по сравнению свозрастом столбцов (рисунок 1) и свежие по сравнениюс сохраненных образцов (рисунок 3), а второй путем оценки экстрактов из двух различных систем растений, A. thaliana (Рисунок 1, Рисунок 3) и L. japonicus (Рисунок 2). Оптимальный пробег SAX-HPLC изображен на рисунке 1A’u2012C, который показывает полный спектр инозитол полифосфата, полученный из экстрактов A. thaliana после подсчета сцинтилляции. Обратите внимание, что пики хорошо разделены и могут быть назначены различным изомерахмам (или энантиомер-парам) на основе хроматографическихмобилей,описанных ранее 5,,7. На рисунке 2 показан репрезентативный результат анализа SAX-HPLC саженцев L. japonicus, которые были выращены и помечены на тех же условиях, что и саженцы арабидопсиса. Хотя предположительно все виды InsP и пики, которые известны из Arabidopsis можно увидеть, Есть существенные различия в отношении относительного (например, соотношения между изомерами) количество конкретных изомеров InsP, при сравнении профилей обоих видов. Например, экстракты Lotus показали увеличение InsP3c, InsP4b, InsP5b и уменьшенный InsP3a, InsP4a, InsP5a и InsP5c по сравнению с Arabidopsis, который оставляет место для дальнейших исследований. Рисунок 2D иллюстрирует различные соотношения между изомерами InsP между Arabidopsis и Lotus. На рисунке 3 показаны два профиля InsP образца, который был разделен после извлечения. Первая половина была немедленно проанализирована, а вторая половина через день, после хранения при -80 градусов по Цельсию. Обратите внимание, что между различными образцами (т.е. черными и красными линиями на рисунке 3Au2012Cи рисунок 3D) наблюдаются лишь незначительные различия. Это свидетельствует о том, что один цикл замораживания-оттепели не вредит образцу и что сам метод генерирует воспроизводимые результаты. Рисунок 1: Типичный профиль InsP успешного и неудачного анализа SAX-HPLC, выполненного с помощью этого протокола. (Au2012C) SAX-HPLC профиль 17-дневного дикого типа (Col-0) Arabidopsis саженцы радиозапись,помеченные с 3H – мио-инозитол.myo В тот же день были выполнены global InsP extraction и SAX-HPLC. (A)Полный спектр; (B, C) Увеличить ва-ряды профиля, показанного в А. Все видимые пики выделены и присвоены соответствующим видам InsP. На основе опубликованных хроматографическихдвижеств5,7, InsP4a, вероятно, представляет Ins (1,4,5,6)P4 или Ins (3,4,5,6)P4, InsP5a представляет InsP5 (2-OH), InsP5b представляет InsP5 (4-OH) или его энантиометрической формой InsP5 (6-OH), а InsP5c представляет InsP5 (1-OH) или его энантиометрической формой InsP5 (3-OH). Изомерика природы InsP3a-c, InsP4b, InsP7, и InsP8 до сих пор неизвестны. Панель(D) показывает профиль SAX-HPLC из одинаково выращенных растений, но с использованием выдержаной колонки (Nogt;40 работает). Очевидное сокращение InsP6 по сравнению с другими видами InsP и отсутствие PP-InsPs видно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 2: Представитель InsP профиль L. japonicus растений. Профиль SAX-HPLC ( A u2012C) 17-дневного дикого типа (Gifu)A L. japonicus саженцы радиосламелись с 3 H ‘ -мио-инозитол.3 (A)Полный спектр; (B, C) Увеличить ва-ряды профиля, показанного в А. Все видимые пики выделены и присвоены соответствующим видам InsP. На основе опубликованных хроматографическихмобилей5,7, InsP4a, вероятно, представляет Ins (1,4,5,6)P4 или Ins (3,4,5,6)P4, InsP5b, вероятно, представляет InsP5 (4-OH) или его энантиометрической форме InsP5 (6-OH), и InsP5c, вероятно, представляет InsP5 (1-OH) или его энантиометрической формы InsP5 (3-OH). Изомерик природа InsP3a-c, InsP4b, InsP7, и InsP8 неизвестны. (D)Сравнение между отдельными видами InsP (в % от общей активности от elution 25’u201296) A. thaliana (данные с рисунка 1 A’u2012C)A‒C и L. japonicus (данные с рисунка 2A-C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 3: Профили InsP разделенного образца, иллюстрирующие воспроизводимость анализов SAX-HPLC. (Au2012C) SAX-HPLC профили 17-дневного дикого типа (Col-0) Arabidopsis саженцы радиозапись,помеченные с 3H – мио-инозитол.myo До запуска образец был разделен, и одна половина была немедленно запущена, а другая половина через день после хранения при -80 градусов по Цельсию(A) Полный спектр; (B, C) Увеличить ва-ряды профиля, показанного в А. Все видимые пики выделены и присвоены соответствующим видам InsP. На основе опубликованных хроматографическихдвижеств5,7, InsP4a, вероятно, представляет Ins (1,4,5,6)P4 или Ins (3,4,5,6)P4, InsP5a представляет InsP5 (2-OH), InsP5a представляет InsP5 (2-OH), InsP5b представляет InsP5 (4-OH) или его энантиометрической формой InsP5 (6-OH), а InsP5c представляет InsP5 (1-OH) или его энантиометрической формы InsP5 (3-OH). Изомерика природы InsP3a-c, InsP4b, InsP7, и InsP8 до сих пор неизвестны. Группа D показывает количественную оценку InsP6 и PP-InsPs InsP7 и InsP8 обоих трасс. Значения представляют сумму (в %) соответствующих видов InsP по отношению ко всем InsP (общая активность от elution 25-96). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Дополнительная цифра 1: Настройки программного обеспечения для подсчета жидких сцинтилляций с помощью счетчика легкого сцинтилляции. Изображены скриншоты, показывающие версию программного обеспечения, а также настройки,используемые дляподсчета сцинтилляции образцов, выполненных с помощью этого протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру. Дополнительная цифра 2: Репрезентативный пример нормализации данных. На скриншоте листа показаны все шаги и формулы, используемые для нормализации SAX-HPLC работает друг с другом. Для упрощения показаны лишь фракции 25-35 образцов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру. Дополнительный рисунок 3: Определение пика, фоновое вычитание и интеграция с использованием программного обеспечения для анализа. (A)Данные анализа SAX-HPLC загружаются в программное обеспечение (минуты 28-96) и выбирается инструмент пикового анализатора. (Bю2012E) Базовый уровень определяется вручную путем установления точек между отдельными пиками и вычитается фон. (F)Пики определяются вручную на основе внешнего вида и опубликованных хроматографическихдвижеств5,7. (G)Пиковые диапазоны определяются вручную значениями cpm. (H)Пики интегрированы и рассчитаны как % от всех пиков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.

Discussion

Здесь мы представляем универсальный и чувствительный метод количественно InsPs в том числе PP-InsPs в растительных экстрактов и предоставить практические советы о том, как получить этот метод создан. Несмотря на то, что протокол, как правило, является надежным, могут происходить неоптимальные запуски и анализы. В большинстве случаев эти пробеги могут быть определены путем сильного сокращения или даже полной потери высоко фосфорилированных insPs, особенно PP-InsP видов InsP7 и InsP8. Возможными причинами могут быть микробное загрязнение растительного материала и недостаточная деактивация эндогенных гидролаз PP-InsP во время добычи из-за недостаточной шлифовки и оттаивания растительного материала, который не будет в непосредственном контакте с буфером добычи. Другие причины включают неточную корректировку рН из-за недостаточного или избыточного добавления буфера нейтрализации или просто недостаточного материала выборки. Последнее может сделать его трудным для обнаружения PP-InsPs, так как они часто присутствуют в очень низких количествах в клетках. Избыток пробного материала или неэффективная сушка во время шага 3.5 может привести к разбавлению перхлорной кислоты, что также приводит к недостаточной деактивации ферментов иконкретной потере InsP 6 и PP-InsPs. Количество растительного материала, а также радиолабеля, используемого в этом протоколе, были оптимизированы на основе затрат и производительности, и поэтому близки к наименьшему объему, которого все еще достаточно для обеспечения оптимальных результатов. Кроме того, смола столбца постепенно теряет свою емкость разрешения. Первым признаком этого процесса является (по причинам, не совсем понятным авторам) специфическая потеря более высоких фосфорилированных видов InsP, таких как PP-InsPs в спектре HPLC. При дальнейшем старении даже InsP6 не будет решен должным образом столбец(рисунок 1D). Поэтому использование адекватной колонки, а также тщательная обработка образца и надлежащее техническое обслуживание компонентов HPLC имеет решающее значение для обеспечения точных результатов.

При сравнении образцов и запусков, особенно при сгенерировании с различным оборудованием (например, системы и столбцы HPLC) или в разные дни, крайне важно нормализовать образцы друг с другом (как описано в шаге 7.3) и проанализировать их таким же образом. Только путем нормализации можно и точно показать несколько образцов на одном графике(рисунок 3). Для количественной оценки отдельных insPs относительно общего insPs, или к другому конкретному виду InsP, нет необходимости нормализовать, до тех пор, пока показаны только относительные значения, а не абсолютные значения. В идеале отображаются как профили InsP, так и количественные оценки. Однако в некоторых случаях невозможно адекватно показать два или более прогов на одном графике. Разное время удержания или различные уровни фоновой активности могут сделать его трудным для сравнения неколичественных профилей SAX-HPLC в одиночку. То же самое верно, когда многие образцы должны быть сопоставлены. В таких случаях необходима дальнейшая оценка с использованием дополнительного программного обеспечения (например, Origin) для индивидуальной пиковой количественной оценки.

Авторы знают, что описанный здесь протокол может быть оптимизирован и нуждается в адаптации к каждому отдельному исследовательскому вопросу. Хотя оптимизация для экстрактов Arabidopsis 7,17 в этом протоколе, этот метод является универсальным и может помочь определить InsP профилей других видов растений, а также. Здесь мы асмифицировать эту возможность, представляя в первый раз InsP профиль для L. japonicus, который не требует никаких изменений условий маркировки, InsP извлечения или SAX-HPLC перспективе (Рисунок 2). Примечательно, что в то время как в целом аналогичные, различия наблюдаются между L. japonicus и Arabidopsis InsP профилей. Например, в Л. japonicus InsP5 (4-OH) или его энантиометрическая форма InsP5 (6-OH) более обильны, чем InsP5 (1-OH) или его энантиомическая форма InsP5 «3-OH» по сравнению с Arabidopsis, где InsP5 (1-OH) или его энантиомеричная форма InsP5 (3-OH) являются доминирующими видами InsP5. Аналогичным образом, мы ожидаем, что изменения в составе средств массовой информации,3H – концентрация мио-инозитол, возраст растений, условия окружающей среды (например, свет и температура), добавление химических соединений или анализ растительно-микробных взаимодействий между другими факторами, возможно, должны быть проверены и адаптированы.myo

Одним из важных недостатков этого метода, который необходимо учитывать, является то, что маркировка делается в (стерильной) жидкой культуре, которая не представляет физиологическую среду для большинства наземных растений. Кроме того,из-завысокой стоимости мио-инозитол, объем маркировки раствора и размер культурного сосуда, как правило, ограничены, что также ограничивает размер растений, которые могут быть использованы. Культивирования в жидкой культуре можно избежать, непосредственно проникая, например,myoлистья почвенных растений с «3H» – мио-инозитол, а затем после протокола, описанного здесь, каксообщалось ранее 10.

Есть несколько недостатков этого протокола по сравнению с альтернативными методами, такими как TiO 2 выдвижнойследуют PAGE или масс-спектрометрии на основе методов. Из-замаркировки мио-инозитолов,только виды InsP, которые непосредственно происходят от радиозаклеевания мио-инозитол,будут обнаружены в конце концов. Метод, описанный здесь, слеп к другим изометерам Ins, таким как сцилло-инозитол и другие изомеры, некоторые из которых были выявлены в некоторыхрастениях 44. scyllo Кроме того, myoмио-InsPs, полученных из других путей будут исключены, в том числе синтеза де Ново мио-инозитол и мио-инозитол-3-фосфат через изомеризации глюкозы-6-фосфат, катализа мио-инозитол-3-фосфатный myoсинтез(MIPS) белки 45. myo myo Несмотря на то, что в качестве альтернативных меток можно использовать орто-фосфат32ПЗ илиortho33ПЗ, их использование представляет собой серьезный недостаток, поскольку каждая фосфатосодержащие молекулы, включая обильные нуклеотиды и их производные, будут маркироваться. Эти молекулы также могут быть извлечены с помощью этого протокола и связываться с колонкой SAX, что приведет к высокому уровню фоновой активности, которая будет мешать идентификации отдельных пиков InsP5. Кроме того, количественная оценка32 ПЗ-или 33ПЗ- помечены InsPs и PP-InsPs может быть сильно зависит от фосфатов и пирофосфата moiety оборота и не может сообщить о массовом считывании для инозитол видов.

С другой стороны,3H –мио-инозитолспециально этикеткимио-инозитол-содержащих молекул. InsPs, инозитол-содержащие липиды, такие как фосфоинозитиды, и галактинол в этом случае помечены. Тем не менее, только InsPs будут проанализированы с этим протоколом, так как липиды нерастворимы в буфере извлечения и галактинол не связывается с колонкой SAX.

До сих пор, различия от завода InsP профиль порожденных 3 H – мио-инозитол маркировки по сравнению с одним определяется TiO2 выдвижной / PAGE остается неизвестным, так кактакиесравнения не были выполнены в растениях.myo Недавнее исследование в клетках животных рассмотрел этот вопрос46. В этой работе, пул InsP6, который невидимна 3H – мио-инозитол маркировки, которые, таким образом, должны быть непосредственно получены из глюкозы-6-фосфат, был определен путем сравнения SAX-HPLC профилей с PAGE гели млекопитающих клеточных линий.myo 24 ч фосфатного голодания привело к 150% увеличение InsP6 при количественной оценке PAGE гели InsPs очищены с помощью TiO2 выдвижной. Анализ SAX-HPLCклеток,помеченныхmyoмио-инозитолом, которые рассматривались одинаково, показал только увеличение на 15%от 3H-InsP6. Как упоминалось ранее, InsPs ниже, чем InsP5 не обнаруживаются с анализом PAGE в большинстве случаев. Радиолабелирование с последующим SAX-HPLC, как представляется, метод выбора, до тех пор, как масс-спектрометрические протоколы не оптимизированы для обнаружения этой группы сильно отрицательно заряженных молекул.

Еще одна по-прежнему проблема заключается в том, чтобы различать энантиомеры в анализах SAX-HPLC (или в любом другом методе для анализа InsP)10,,17. Эта проблема может быть решена путем добавления хиральных селекторов, т.е. enantiopure соединений, таких как L-аргинин амида, которые взаимодействуют с соответствующими энантиометрических молекул для формирования диастереометрических комплексов, которые могут бытьразделены 10. К нашим знаниям, этот подход был реализован только для того, чтобы дискриминировать энантиометрическиеизомеры InsP5 (1-OH) и InsP5 (3-OH) по анализу NMR10. Дискриминация других энантиомических пар или успешная дискриминация энантиомеров с помощью хирального анализа SAX-HPLC или хиральных методов, основанных на PAGE, еще не зарегистрированы и должны быть дополнительно разработаны. Учитывая сохраненный синтез и сохраненное регулирование PP-InsPs по наличию фосфора, мы предполагаем, что особенно нерадиоактивные методы, такие как PAGE или MS-методы, вместе с анализом питательных веществ, помогут заземления правды усилия по калибровке данных дистанционного зондирования, предназначенных для диагностики дефицита питательных веществв сельскохозяйственных культурах 17,18,24,25. Тем не менее, метод, представленный здесь, в настоящее время все еще можно считать золотым стандартом для анализа InsP и будет способствовать открытию новых функций этих интригующих посланников в растениях.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа финансировалась Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Немецкий исследовательский фонд) в рамках Стратегии передового опыта Германии – EXC-2070 – 390732324 (PhenoRob), Исследовательская учебная группа GRK2064 и индивидуальные исследовательские гранты SCHA1274/4-1 и SCHA1274/5-1 Г.С. Мы также благодарим Ли Шлятера и Брижит Убербах за техническую помощь.

Materials

Centrifuge Eppendorf AG model: 5430 R
Diammonium hydrogen phosphate, ≥97 % Carl Roth GmbH + Co. KG 0268.1
Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate, ≥99 %, p.a., ACS Carl Roth GmbH + Co. KG 8043.2
Falcon 12-well clear flat bottom TC-treated multiwell cell culture plate, with lid, individually wrapped, sterile Corning Inc. 353043
Fraction collector LAMBDA Instruments GmbH model: OMNICOLL single channel collector
Growth incubator poly klima GmbH model: PK 520-LED
HPLC pumps Kontron Instruments model: 420
HPLC syringe for Rheodyne valves, 1 mL Hamilton Company 81365
Injector for HPLC Supelco model: Rheodyne 9725
Inositol, myo-[1,2-3H(N)] American Radiolabeled Chemicals Inc. ART 0261
Liquid nitrogen University, Chemistry Department
Liquid scintillation counter PerkinElmer Inc model: TRI-CARB 2900TR
Micro pestle Carl Roth GmbH + Co. KG CXH7.1
Mixed cellulose Eester filter, ME range (ME 24), plain, 0.2 µm pore size, 47 mm circle GE Healthcare Life Sciences 10401770
Mixer for HPLC Kontron Instruments model: M 800
Murashige & Skoog medium, salt mixture Duchefa Biochemie M0221
OriginPro software OriginLab Corp.
Orthophosphoric acid, ≥85 %, p.a., ISO Carl Roth GmbH + Co. KG 6366.1
Partisphere 5 µm SAX cartridge column, 125 x 4.6 mm Hichrom Limited 4621-0505
Perchloric acid, 70 %, 99.999 % trace metals basis Sigma-Aldrich 311421
Petri dish, square, PS, clear, 120/120/17 mm, sterile Greiner Bio One International GmbH 688161
pH-indicator paper pH 5.5 – 9.0, Neutralit Merck KGaA 109564
Phytagel Sigma-Aldrich P8169
Potassium carbonate Carl Roth GmbH + Co. KG P743.2
Safe-Lock tubes, 1.5 mL Eppendorf AG 30120086
Sample loop for 9725 injectors, volume 2 mL, PEEK Supelco 57648
SNAPTWIST scintillation vial, 6.5 mL Simport Scientific Inc. S207-5
Sterile bench LaboGene model: ScanLaf MARS 900
Sucrose, ≥99,5 %, p.a. Carl Roth GmbH + Co. KG 4621.1
Ultima-Flo AP liquid scintillation cocktail PerkinElmer Inc 6013599
Ultra-pure deionized water Milli-Q
Wrenchless WVS End Fitting Kit Hichrom Limited 4631-1001
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berridge, M. J., Irvine, R. F. Inositol Phosphates and Cell Signaling. Nature. 341 (6239), 197-205 (1989).
  2. Streb, H., Irvine, R. F., Berridge, M. J., Schulz, I. Release of Ca-2+ from a Nonmitochondrial Intracellular Store in Pancreatic Acinar-Cells by Inositol-1,4,5-Trisphosphate. Nature. 306 (5938), 67-69 (1983).
  3. Krinke, O., Novotna, Z., Valentova, O., Martinec, J. Inositol trisphosphate receptor in higher plants: is it real. Journal of Experimental Botany. 58 (3), 361-376 (2007).
  4. Kuo, H. F., et al. Arabidopsis inositol pentakisphosphate 2-kinase, AtIPK1, is required for growth and modulates phosphate homeostasis at the transcriptional level. Plant Journal. 80 (3), 503-515 (2014).
  5. Kuo, H. F., et al. Arabidopsis inositol phosphate kinases IPK1 and ITPK1 constitute a metabolic pathway in maintaining phosphate homeostasis. Plant Journal. 95 (4), 613-630 (2018).
  6. Gillaspy, G. E., Capelluto, D. G. S. . Lipid-mediated Protein Signaling. , 141-157 (2013).
  7. Stevenson-Paulik, J., Bastidas, R. J., Chiou, S. T., Frye, R. A., York, J. D. Generation of phytate-free seeds in Arabidopsis through disruption of inositol polyphosphate kinases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (35), 12612-12617 (2005).
  8. Lemtiri-Chlieh, F., MacRobbie, E. A. C., Brearley, C. A. Inositol hexakisphosphate is a physiological signal regulating the K+-inward rectifying conductance in guard cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (15), 8687-8692 (2000).
  9. Lee, H. S., et al. InsP6-sensitive variants of the Gle1 mRNA export factor rescue growth and fertility defects of the ipk1 low-phytic-acid mutation in Arabidopsis. Plant Cell. 27 (2), 417-431 (2015).
  10. Blüher, D., et al. A 1-phytase type III effector interferes with plant hormone signaling. Nature Communications. 8, (2017).
  11. Murphy, A. M., Otto, B., Brearley, C. A., Carr, J. P., Hanke, D. E. A role for inositol hexakisphosphate in the maintenance of basal resistance to plant pathogens. Plant Journal. 56 (4), 638-652 (2008).
  12. Poon, J. S. Y., Le Fevre, R. E., Carr, J. P., Hanke, D. E., Murphy, A. M. Inositol hexakisphosphate biosynthesis underpins PAMP-triggered immunity to Pseudomonas syringae pv. tomato in Arabidopsis thaliana but is dispensable for establishment of systemic acquired resistance. Molecular Plant Pathology. 21 (3), 376-387 (2020).
  13. Wild, R., et al. Control of eukaryotic phosphate homeostasis by inositol polyphosphate sensor domains. Science. 352 (6288), 986-990 (2016).
  14. Shears, S. B. Inositol pyrophosphates: Why so many phosphates. Advances in Biological Regulation. 57, 203-216 (2015).
  15. Shears, S. B. Intimate connections: Inositol pyrophosphates at the interface of metabolic regulation and cell signaling. Journal of Cellular Physiology. 233 (3), 1897-1912 (2018).
  16. Desai, M., et al. Two inositol hexakisphosphate kinases drive inositol pyrophosphate synthesis in plants. Plant Journal. 80 (4), 642-653 (2014).
  17. Laha, D., et al. VIH2 Regulates the Synthesis of Inositol Pyrophosphate InsP8 and Jasmonate-Dependent Defenses in Arabidopsis. Plant Cell. 27 (4), 1082-1097 (2015).
  18. Laha, D., et al. Arabidopsis ITPK1 and ITPK2 Have an Evolutionarily Conserved Phytic Acid Kinase Activity. Acs Chemical Biology. 14 (10), 2127-2133 (2019).
  19. Dorsch, J. A., et al. Seed phosphorus and inositol phosphate phenotype of barley low phytic acid genotypes. Phytochemistry. 62 (5), 691-706 (2003).
  20. Flores, S., Smart, C. C. Abscisic acid-induced changes in inositol metabolism in Spirodela polyrrhiza. Planta. 211 (6), 823-832 (2000).
  21. Brearley, C. A., Hanke, D. E. Inositol phosphates in barley (Hordeum vulgare L) aleurone tissue are stereochemically similar to the products of breakdown of InsP(6) in vitro by wheat-bran phytase. Biochemical Journal. 318, 279-286 (1996).
  22. Laha, N. P., et al. ITPK1-Dependent Inositol Polyphosphates Regulate Auxin Responses in Arabidopsis thaliana. bioRxiv. , (2020).
  23. Laha, D., et al. Inositol Polyphosphate Binding Specificity of the Jasmonate Receptor Complex. Plant Physiology. 171 (4), 2364-2370 (2016).
  24. Dong, J. S., et al. Inositol Pyrophosphate InsP(8) Acts as an Intracellular Phosphate Signal in Arabidopsis. Molecular Plant. 12 (11), 1463-1473 (2019).
  25. Zhu, J., et al. Two bifunctional inositol pyrophosphate kinases/phosphatases control plant phosphate homeostasis. Elife. 8, (2019).
  26. Couso, I., et al. Synergism between Inositol Polyphosphates and TOR Kinase Signaling in Nutrient Sensing, Growth Control, and Lipid Metabolism in Chlamydomonas. Plant Cell. 28 (9), 2026-2042 (2016).
  27. Ito, M., et al. Hydrophilic interaction liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the quantitative analysis of mammalian-derived inositol poly/pyrophosphates. Journal of Chromatography A. 1573, 87-97 (2018).
  28. Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Inositol Phosphates Purification Using Titanium Dioxide Beads. Bio-Protocol. 8 (15), (2018).
  29. Loss, O., Azevedo, C., Szijgyarto, Z., Bosch, D., Saiardi, A. Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates. Jove-Journal of Visualized Experiments. (55), e3027 (2011).
  30. Harmel, R. K., et al. Harnessing C-13-labeled myo-inositol to interrogate inositol phosphate messengers by NMR Electronic supplementary information (ESI) available. Chemical Science. 10 (20), 5267-5274 (2019).
  31. Azevedo, C., Saiardi, A. Extraction and analysis of soluble inositol polyphosphates from yeast. Nature Protocols. 1 (5), 2416-2422 (2006).
  32. Shears, S. B., Miller, G. J. . Inositol Phosphates: Methods and Protocols. , 1-28 (2020).
  33. Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Importance of Radioactive Labelling to Elucidate Inositol Polyphosphate Signalling. Topics in Current Chemistry. 375 (1), (2017).
  34. Stevenson-Paulik, J., et al. Inositol phosphate metabolomics: Merging genetic perturbation with modernized radiolabeling methods. Methods. 39 (2), 112-121 (2006).
  35. Liu, C., Riley, A. M., Yang, X., Shears, S. B., Potter, B. V. L. Synthesis and Biological Activity of d- and l-chiro-Inositol 2,3,4,5-Tetrakisphosphate: Design of a Novel and Potent Inhibitor of Ins(3,4,5,6)P4 1-Kinase/Ins(1,3,4)P3 5/6-Kinase. Journal of Medicinal Chemistry. 44 (18), 2984-2989 (2001).
  36. Hughes, P. J., Hughes, A. R., Putney, J. W., Shears, S. B. The regulation of the phosphorylation of inositol 1,3,4-trisphosphate in cell-free preparations and its relevance to the formation of inositol 1,3,4,6-tetrakisphosphate in agonist-stimulated rat parotid acinar cells. Journal of Biological Chemistry. 264 (33), 19871-19878 (1989).
  37. Shears, S. B., Kirk, C. J., Michell, R. H. The pathway of myo-inositol 1,3,4-trisphosphate dephosphorylation in liver. The Biochemical journal. 248 (3), 977-980 (1987).
  38. Stevenson-Paulik, J., Odom, A. R., York, J. D. Molecular and Biochemical Characterization of Two Plant Inositol Polyphosphate 6-/3-/5-Kinases. Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42711-42718 (2002).
  39. Stephens, L. R., Hawkins, P. T., Downes, C. P. An analysis of myo-[3H]inositol trisphosphates found in myo-[3H]inositol prelabelled avian erythrocytes. The Biochemical journal. 262 (3), 727-737 (1989).
  40. Saiardi, A., et al. Mammalian inositol polyphosphate multikinase synthesizes inositol 1,4,5-trisphosphate and an inositol pyrophosphate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (5), 2306 (2001).
  41. Azevedo, C., Burton, A., Bennett, M., Onnebo, S. M. N., Saiardi, A., Barker, C. J. . Inositol Phosphates and Lipids: Methods and Protocols. , 73-85 (2010).
  42. Saiardi, A., Caffrey, J. J., Snyder, S. H., Shears, S. B. The Inositol Hexakisphosphate Kinase Family: CATALYTIC FLEXIBILITY AND FUNCTION IN YEAST VACUOLE BIOGENESIS. Journal of Biological Chemistry. 275 (32), 24686-24692 (2000).
  43. Brearley, C. A., Hanke, D. E. Inositol phosphates in the duckweed Spirodela polyrhiza L. Biochemical Journal. 314, 215-225 (1996).
  44. Pollard, J. K., Steward, F. C., Shantz, E. M. Hexitols in Coconut Milk – Their Role in Nurture of Dividing Cells. Plant Physiology. 36 (4), 492 (1961).
  45. Donahue, J. L., et al. The Arabidopsis thaliana Myo-inositol 1-phosphate synthase1 gene is required for Myo-inositol synthesis and suppression of cell death. Plant Cell. 22 (3), 888-903 (2010).
  46. Desfougeres, Y., Wilson, M. S. C., Laha, D., Miller, G. J., Saiardi, A. ITPK1 mediates the lipid-independent synthesis of inositol phosphates controlled by metabolism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (49), 24551-24561 (2019).

Tags

Inositol PolyphosphatesRadiolabelingSAX-HPLCPlant MetabolismPlant DevelopmentExtractionQuantificationLotus SeedsMyo-inositolSample PreparationHPLC Setup

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Gaugler, P., Gaugler, V., Kamleitner, M., Schaaf, G. Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC. J. Vis. Exp. (160), e61495, doi:10.3791/61495 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image