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생화학

Extraktion und Quantifizierung von löslichen, radioaktiv markierten Inositolpolyphosphaten aus verschiedenen Pflanzenarten mit SAX-HPLC

Published: June 26, 2020
doi:
10.3791/61495
, , ,
1Department of Plant Nutrition, Institute of Crop Science and Resource Conservation,University of Bonn

Summary

Hier beschreiben wir starke Anionenaustausch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie von [3H]- Myo-Inositol-markierten Sämlingen, die eine hochempfindliche Methode zum Nachweis und quantifizieren von Inositolpolyphosphaten in Pflanzen ist.myo

Abstract

Die Phosphatester von myoMyo-Inositol, auch inositolphosphate (InsPs) bezeichnet, sind eine Klasse von zellulären Regulatoren, die eine wichtige Rolle in der Pflanzenphysiologie spielen. Aufgrund ihrer negativen Ladung, geringen Häufigkeit und Anfälligkeit für hydrolytische Aktivitäten ist der Nachweis und die Quantifizierung dieser Moleküle eine Herausforderung. Dies gilt insbesondere für hochphosphorylierte Formen, die “hochenergetische” Diphosphobindungen enthalten, auch inositolpyrophosphate (PP-InsPs) bezeichnet. Aufgrund seiner hohen Empfindlichkeit, starke Anionenaustausch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (SAX-HPLC) von Pflanzen mit[3H]-Myo-Inositolgekennzeichnet ist derzeit die Methode der Wahl, um diese Moleküle zu analysieren. Durch die Verwendung von [3H]- Myo-Inositol zum Radiolabel Pflanzensämlinge können verschiedene InsP-Arten, darunter mehrere nicht-enantimere Isomere, nachgewiesen und mit hoher Empfindlichkeit diskriminiert werden.myo Hier wird der Aufbau eines geeigneten SAX-HPLC-Systems beschrieben, ebenso wie der komplette Workflow von Pflanzenanbau, Radiolabeling und InsP-Extraktion bis hin zum SAX-HPLC-Lauf und anschließender Datenanalyse. Das hier vorgestellte Protokoll ermöglicht die Diskriminierung und Quantifizierung verschiedener InsP-Arten, einschließlich mehrerer nicht-enantimerer Isomere und der PP-InsPs, InsP7 und InsP8, und kann leicht an andere Pflanzenarten angepasst werden. Als Beispiele werden SAX-HPLC-Analysen von Arabidopsis thaliana und Lotus Japonicus Sämlingen durchgeführt und komplette InsP-Profile vorgestellt und diskutiert. Die hier beschriebene Methode stellt ein vielversprechendes Werkzeug dar, um die biologische Rolle von InsPs in Pflanzen besser zu verstehen.

Introduction

Vor fast vier Jahrzehnten tauchten Inositolphosphate (InsPs) als Signalmoleküle auf, nachdem Ins(1,4,5)P3 (InsP3) als zweiter Botenstoff identifiziert wurde, der die rezeptorvermittelte Freisetzung von Ca2+ in tierseuchen Zellen1,2aktiviert. Bis heute wurde kein InsP3-Rezeptor (IP3-R) in Pflanzen identifiziert, was eine direkte Signalfunktion für InsP3 in Pflanzenzellen3in Frage stellt.3 Unabhängig davon dient InsP3 als Vorläufer für andere InsPs, die an mehreren Pflanzenentwicklungsprozessen beteiligt sind, einschließlich der Regulierung spezifischer Signalwege3,4,5,6,7,8. Zum Beispiel kann InsP3 weiter phosphoryliert werden in InsP6, auch bekannt als “Phytinsäure”, die eine Hauptquelle von Phosphat, Myo-Inositol und Kationen darstellt, und wurde gezeigt, dass eine Schlüsselrolle in der Pflanzenabwehr gegen Krankheitserreger, mRNA-Export und Phosphat-Homöostase5,9,10,11,12. myo

Inositol-Pyrophosphate (PP-InsPs) sind eine Klasse von InsPs, die mindestens eine hochenergetische Di-Phospho-Bindung enthalten, die ursprünglich in tierischen Zellen, Amöben und Hefe identifiziert wurde, wo sie in verschiedenen zellulären Prozessen eine entscheidende Rolle spielen13,14,15. Trotz wegweisender Arbeiten an PP-InsPs in Pflanzen16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, bleiben die biologischen Funktionen und die Isomeridentität dieser Moleküle noch weitgehend rätselhaft. In der Modellpflanze Arabidopsis thalianawurde vorgeschlagen, die Abwehr gegen Insektenpflanzenfresser und nekrotrophe Pilze durch Zufall-Nachweis von InsP8 und aktiven Jasmonaten durch den ASK1-COI1-JAZ-Rezeptorkomplex17zu regulieren. Darüber hinaus wurden Rollen von InsP8 und anderen PP-InsPs in der Energiehomöostase und Nährstoffsensorik sowie der Phosphathomöostasevorgeschlagen 17,23,24,25,26.

Unabhängig vom eingesetzten biologischen System war eine der wichtigsten methodischen Herausforderungen bei der Untersuchung von InsPs der zuverlässige Nachweis und die präzise Quantifizierung dieser Moleküle. Massenspektrometrie-basierte Methoden wurden verwendet, um InsPs, einschließlich PP-InsPs, aus Zellextrakten zu erkennen. Diese Studien konnten jedoch keine unterschiedlichen Isomere unterscheiden26,27. Ein anderer Ansatz zur Analyse von InsPs nutzt den Pull-down2 von InsPs aus Zelllysaten mit TiO 2-Perlen, gefolgt von Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) der eluierten InsPs. Die InsPs können dann entweder mit Toluidinblau oder DAPI24,28,29gebeizt werden. Bisher ist es jedoch nicht möglich, InsPs, die niedriger als InsP5 sind, mit dieser Methode zuverlässig zu erkennen. Kürzlich wurde eine Methode mit [13C]- Myo-Inositol zur Kernspinresonanzanalyse (NMR) von InsPs als Alternative zur starken Anionenaustausch Hochleistungschromatographie (SAX-HPLC)30veröffentlicht.myo Diese Technik wurde berichtet, um eine ähnliche Empfindlichkeit im Vergleich zu SAX-HPLC zu erreichen und den Nachweis von 5-InsP7zu ermöglichen, sowie die Diskriminierung von verschiedenen nicht-enantiomerinin insetomerischen InsP 5-Isomeren aus Zellextrakten.5 Die Implementierung der NMR-basierten Methode erfordert jedoch chemisch synthetisierte und kommerziell nicht verfügbare [13C]- Myo-Inositol.myo Daher ist die in den meisten Fällen angewandte Methode das Radiolabeling von Proben mit [3H]- Myo-Inositol, gefolgt von SAX-HPLC31,32,myo33. Diese Technik basiert auf der myoAufnahme von radioaktivem Myo-Inositol in die Pflanze und ihrer Umwandlung in verschiedene InsPs durch die kombinierte Aktivität von dedizierten zellulären Kiinasen und Phosphatasen.

Die [3H]-markierten InsPs werden dann mit SAX-HPLC säureextrahiert und fraktioniert. Aufgrund ihrer negativen Ladung interagieren die InsPs stark mit der positiv geladenen stationären Phase der SAX-HPLC-Säule und können mit einem Puffergradienten eluiert werden, der steigende Phosphatkonzentrationen enthält, um InsPs aus der Kolonne zu übertreffen. Die Elutionszeiten hängen daher von der Ladung und Geometrie der zu trennenden InsP-Art ab. In Ermangelung von chiralen Säulen können nur nicht-enantiomere Isomer durch dieses Protokoll getrennt werden. Radiolabeled Standards können jedoch verwendet werden, um die isomerische Natur eines bestimmten InsP-Peaks zuzuweisen. Mehrere Bemühungen verschiedener Laboratorien in der Vergangenheit, markierte und nicht gekennzeichnete Standards mit (bio)chemischen Methoden zu erzeugen oder sie aus verschiedenen Zellen und Organismen zu reinigen, haben dazu beigetragen, bestimmten InsP-Arten Spitzen zuzuweisen und auch die isomerische Identität einzelner InsP-Arten5,7,21,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43zu verengen. Auch die jüngste Aufklärung von enzymatischen Wegen, die zur Bildung von PP-InsPs in Pflanzen führen, sowie die Entdeckung eines bakteriellen Typ-III-Effektors mit einer spezifischen 1-Phytase-Aktivität, liefern Informationen darüber, wie nützliche Standards für diese Analysen generiert werden können10,17,18,22,23.

Die resultierenden Fraktionen können in einem flüssigen Szintillationszähler aufgrund des β-Zerfalls von Tritium (3H) gemessen werden. Mit zunehmender Etikettierungszeit wird ein stationäres Isotopengleichgewicht erreicht, nach dem die erhaltenen InsP-Profile den InsP-Status der Pflanze31darstellen sollten. Der große Vorteil dieses Protokolls im Vergleich zu anderen verfügbaren Techniken ist die hohe Empfindlichkeit, die durch den Einsatz des direkten Vorläufers für InsPs und die Messung eines radioaktiven Signals erreicht wird.

SAX-HPLC von Proben, die aus [3H]- myo-inositol-markierten Pflanzen oder anderen Organismen extrahiert wurden, wird häufig für den Nachweis und die Quantifizierung von InsPs verwendet, die von niedrigeren InsP-Arten bis hin zu PP-InsPs reichen, was ein wertvolles Werkzeug darstellt, um den Stoffwechsel, die Funktion und die Wirkweisen von InsPs besser zu verstehen.myo Bisher ist diese Methode auch die am besten geeignete Wahl für Forscher mit besonderem Interesse an niedrigeren InsP-Arten. Während die Grundlagen dieses Verfahrens, auf dem das hier beschriebene Protokoll aufbaut, zuvor beschrieben wurden7,21,31,34, fehlt noch ein detailliertes Protokoll, das auf die Analyse von pflanzlichen InsPs und insbesondere von PP-InsPs zugeschnitten ist. Frühere Veröffentlichungen berichteten von Schwierigkeiten, die geringen insbesondere InsP8, aufgrund eines oder mehrerer der folgenden Faktoren: relativ geringe Mengen an Pflanzenmaterial, [3H]- Myo-Inositol mit geringer spezifischer Aktivität (> 20 Ci/mmol), Verwendung von Extraktionspuffern, die entweder nicht auf Perchlorsäure basieren oder weniger konzentriert als 1 M sind, unterschiedliche Neutralisationspuffer sowie suboptimale Gradienten oder Nachweis von [3H] mit einem Online-Detektor.myo Im Vergleich zu diesen Studien ist das hier vorgestellte Protokoll für den zuverlässigen Nachweis von PP-InsPs7,21,34ausgelegt.

Hier stellen wir Ihnen einen detaillierten Workflow vor, angefangen beim Aufbau der Anlagen bis hin zum Pflanzenanbau und der Etikettierung, der InsP-Extraktion und dem SAX-HPLC-Lauf selbst. Obwohl die Methode für die Modellpflanze A. thalianaoptimiert wurde, kann sie leicht modifiziert werden, um andere Pflanzenarten zu untersuchen, wie hier mit dem ersten gemeldeten InsP-Profil des Modells Legume Lotus japonicusgezeigt. Obwohl die Verwendung einer anderen Pflanzenart eine gewisse Optimierung erfordern könnte, gehen wir davon aus, dass diese geringfügig sein werden, was dieses Protokoll zu einem guten Ausgangspunkt für weitere Forschungen in PflanzeninsPs macht. Um mögliche Optimierungen zu ermöglichen, geben wir jeden Schritt innerhalb des Protokolls an, in dem Änderungen möglich sind, sowie alle kritischen Schritte, die bei der erstmaligen Etablierung der Methode eine Herausforderung darstellen können. Darüber hinaus berichten wir, wie die mit dieser Methode gewonnenen Daten für die Quantifizierung bestimmter InsPs verwendet werden können und wie verschiedene Proben analysiert und verglichen werden können.

Protocol

1. Einrichten des HPLC-Systems Richten Sie ein System ein, das aus zwei unabhängigen HPLC-Pumpen (binäre Pumpe) besteht, eine für jeden Puffer. Beide Pumpen müssen gemeinsam über einen Computer mit entsprechender Software oder über eine Masterpumpe gesteuert werden. Implementieren Sie eine Kolbendichtungswäsche für beide Pumpen, entweder über Gravitationskraft oder über eine dritte Niederdruckpumpe. Legen Sie eine Pumpe für Puffer A (sog. Pumpe A) und eine für Puffer B (sog. Pumpe B) fest.HINWEIS: Beide müssen in der Lage sein, Drücke bis zu 60 bar (6 MPa) und Durchflussraten von mindestens 0,5 ml/min zu erzeugen. Verbinden Sie beide Pumpen mit einem dynamischen Mischer. Schließen Sie den Mischer an ein Einspritzventil mit einer Probenschleife von mindestens 1 ml Kapazität an. Schließen Sie das Einspritzventil über die entsprechenden Endarmaturen mit einer Kapillare an die Säule an. Verbinden Sie die Säule mit dem Fraktionskollektor, indem Sie eine Kapillare mit einer entsprechenden Länge verwenden.HINWEIS: Diese Beschreibung basiert auf unserem HPLC-System (siehe Materialtabelle), das mehr manuelle Schritte erfordert als neuere und anspruchsvollere Systeme. Unser System ermöglicht den einfachen Zugriff und die Modifikation aller Komponenten. Quaternäre Pumpen (mit dem hier beschriebenen binären Gradienten) können ebenfalls verwendet werden und führen zu Elutionsprofilen und der Gesamtqualität der Analysen, ähnlich denen, die mit binären Pumpen erreicht werden. 2. Vorbereitung von Puffern, Säulen- und HPLC-System Bereiten Sie die Puffer für die Extraktion von löslichen InsPs vor: Extraktionspuffer (1 M HClO4) und Neutralisationspuffer (1 M K2CO3). Bereiten Sie beide Puffer mit ultrareinem entionisiertem Wasser vor. Sie sind bei Raumtemperatur für mehrere Monate stabil. Unmittelbar vor der Extraktion EDTA zu beiden Lösungen zu einer Endkonzentration von 3 mM hinzufügen (z. B. aus einer gefilterten 250 mM EDTA-Lagerlösung).VORSICHT: HClO4 (Perchlorsäure) ist stark korrosiv. Bereiten Sie die Puffer für den SAX-HPLC-Lauf vor: Puffer A (1 mM EDTA) und Puffer B (1 mM EDTA, 1,3 M (NH4)2HPO4; pH 3.8 mit H3PO4). Bereiten Sie beides mit ultrareinem entionisiertem Wasser vor, gefolgt von Vakuumfiltration mit 0,2 m porengroßen Membranfiltern. Diese sind bei Raumtemperatur für mehrere Monate stabil.HINWEIS: EDTA sollte in alle Puffer einbezogen werden, um Wechselwirkungen von Kationen mit InsPs zu verhindern, was zu veränderten InsP-Ladungen oder sogar unlöslichen InsP-Salzkomplexen führen könnte. Programmieren Sie den Farbverlauf wie folgt: 0’u20122 min, 0% Puffer B; 2-u20127 min, bis zu 10% Puffer B; 7-u201268 min, bis zu 84% Puffer B; 68-u201282 min, bis zu 100% Puffer B; 82-u2012100 min, 100% Puffer B, 100-u2012101 min, bis zu 0% Puffer B; 101-u2012125 min, 0% Puffer B. Die optimale Durchflussrate für diesen Gradienten beträgt 0,5 ml/min. Sammeln Sie während des Laufs jede Minute Brüche, beginnend von Minute 1 bis Minute 96. Die restlichen 30 min des Farbverlaufs dienen dem Waschen der Säule und des Systems und müssen nicht für die Szintillationszählung gesammelt werden. Stellen Sie nach Möglichkeit den maximalen erreichbaren Druck vor der Notabschaltung der HPLC-Pumpen auf 80 bar (8 MPa) ein. Dadurch wird eine kritische Beschädigung des Harzes der Säule verhindert. Wenn Sie eine neue SAX HPLC-Säule verwenden, waschen Sie sie vor dem ersten Gebrauch gründlich (>50 ml) mit gefiltertem ultrareinem entionisiertem Wasser.HINWEIS: Dadurch wird die Entfernung des enthaltenen Methanols sichergestellt, wodurch Salzfällungen in späteren Schritten verhindert werden. Verwenden Sie nach Möglichkeit eine separate HPLC-Pumpe. Wenn dies nicht verfügbar ist, stellen Sie sicher, dass der HPLC vor dem Waschen der Säule mit Wasser gespült wurde. Die Durchflussrate sollte 2 ml/min nicht überschreiten. Nach dem Waschen ist die Säule für die Analyse bereit und kann bei ordnungsgemäßer Handhabung für 20-u201240-Durchläufe verwendetwerden. Danach wird die Entschließung sukzessive abnehmen. Längeres Waschen mit Puffer A (>1 h) und Ausführen von Schritt 2.6 kann dazu beitragen, die Lebensdauer der Säule zu erhöhen. Wenn die Abnahme der Auflösung anhält, muss die Spalte ausgetauscht werden. Der Gradient kann angepasst werden, um die Trennung zwischen bestimmten Inositol-Polyphosphat-Arten zu erhöhen oder die Gesamtlaufzeit zu verringern. Die Verwendung verschiedener HPLC-Systeme (mit unterschiedlichem Hohlraumvolumen oder unterschiedlichem Volumen der Kapillaren) wirkt sich stark auf die Retentionszeiten aus. Außerdem haben Spaltenänderungen geringfügige Auswirkungen auf die Aufbewahrungszeiten. Führen Sie einen “Mock Run” durch. Anstelle einer extrahierten Probe eingefiltertes ultrareines entionisiertes Wasser in das HPLC-System einspritzen und den Standardgradienten ausführen. Die Fraktionen müssen nicht gesammelt werden.HINWEIS: Schritt 2.6 ist optional. Sie sollte jedoch ausgeführt werden, wenn eine der folgenden Situationen zutrifft: Eine neue Spalte wird installiert. Das HPLC-System wurde bereits für eine andere Methode verwendet; Das HPLC-System wird seit mehr als 3 Tagen nicht mehr verwendet; Beim vorherigen Durchlauf ist ein Problem vorliegt. 3. Pflanzenanbau und Etikettierung mit [3H]- Myo-Inositolmyo HINWEIS: Die folgenden Schritte sollten mit sterilen Komponenten und unter sterilen Bedingungendurchgeführt werden, während Handschuhe getragen werden, um die Hände vor einer Kontamination mit dem Radiolabel zu schützen. Pflanzenmedien, insbesondere bei Saccharose, sind anfällig für mikrobielle Kontamination. Sterilisieren Sie A. Thaliana-Samen mit 1 ml 1,2% Natriumhypochlorit für 3 min, gefolgt von 1 ml 70% Ethanol für 3 min. Dann 1 ml 100% Ethanol hinzufügen, die Samen mit dem Ethanol auf ein kreisförmiges Filterpapier pfeifen und unter einem Laminarstrom auf einer sauberen Bank lufttrocknen lassen. Bei Verwendung von L. japonicus Samen, legen Sie sie in einen Mörtel und schrubben Samen mit Schleifpapier vor der Sterilisation, um eine ausreichende Keimrate zu gewährleisten. Aussäen Sie Arabidopsis Samen in 1–2 Reihen auf quadratischen Petrischalen, gefüllt mit soliden Wachstumsmedien, bestehend aus halbfester Murashige- und Skoog (MS) Salzlösung, 1% Saccharose, 0,7% Gellankaugummi in deionisiertem Wasser, das auf pH 5,7 mit KOH eingestellt ist, und lassen Sie sie mindestens 1 Tag bei 4 °C im Dunkeln erstarren. Für Lotussamen säen Sie sie in einer Reihe auf quadratischen Petrischalen, gefüllt mit soliden Wachstumsmedien, die aus 0,8% bakteriologischem Agar in entionisiertem Wasser bestehen, und lassen Sie sie mindestens 3 Tage bei 4 °C im Dunkeln erstarren. Die Platten vertikal in einen Wachstumsbrutkasten oder eine Klimakammer stellen und 10–12 Tage lang unter Kurztagen wachsen lassen (8 h Licht bei 22 °C, 16 h dunkel bei 20 °C). 10–20 Sämlinge in einen Brunnen einer 12-gut klaren flachbodenigen Zellkulturplatte mit 2 ml halbfester MS-Salzlösung, ergänzt mit 1% Saccharose, und auf pH 5,7 eingestellt. 45 Ci von[3H]- Myo-Inositol (30–80 Ci/mmol, gelöst in 90% Ethanol) hinzufügen und durch sanftes Wirbeln mischen.myo Bedecken Sie die Platte mit dem entsprechenden Deckel und versiegeln Sie sie mit mikroporösem Operationsband (z. B. Mikroporen- oder Leucoporband), und legen Sie sie wieder in den Wachstumsinkubator.VORSICHT: [3H] ist ein energiearmer Beta-Emitter, der eine schädliche Strahlengefahr darstellen kann, wenn er durch nackte Haut eingeatmet, aufgenommen oder absorbiert wird. Tragen Sie beim Umgang mit radioaktivem Material oder Geräten, die direkten oder indirekten Kontakt zu radioaktivem Material haben, immer Handschuhe. Beachten Sie auch die lokalen Vorschriften für den sicheren Umgang mit Radiochemikalien (z. B. das Tragen zusätzlicher Schutzkleidung, die Benutzung eines Dosimeters und regelmäßige Oberflächenuntersuchungen auf Verunreinigungen). Nach 5 Tagen Etikettierung Sämlinge aus den Medien nehmen und kurz mit entionisiertem Wasser waschen. Trocknen Sie sie mit Papiertüchern und geben Sie sie in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr. Überfüllen Sie das Rohr nicht und legen Sie nicht mehr als 100 mg FW/Rohr, was etwa 10-u201220 17 Tage alten Sämlingen entspricht.HINWEIS: Ein Überschuss an Pflanzenmaterial wird die Säure während des Extraktionsprozesses verdünnen und die Extraktionseffizienz stark verringern. Fangen Sie das Rohr in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie es bei -80 °C bis zur Extraktion.HINWEIS: Proben können mehrere Wochen bei -80 °C aufbewahrt werden, ohne die Probenqualität zu beeinträchtigen. Die Wachstumsbedingungen (Medien, Licht, Temperatur, Zeit) können entsprechend den Bedürfnissen eines bestimmten Experiments oder einer bestimmten Pflanzenart verändert werden. Bei der Verdünnung des [3H]- Myo-Inositols sollte jedoch darauf geachtet werden, quantifizierbare SAX-HPLC-Läufe von guter Qualität zu gewährleisten.myo Daher wird empfohlen, mit den hier angegebenen [3H]- Myo-Inositol-Konzentrationen zu beginnen und sie bei Bedarf schrittweise zu reduzieren.myo Während der Etikettierungszeit können Pflanzen verschiedenen Behandlungen (z. B. Umweltbelastungen oder chemische Arbeitsstoffe) unterzogen werden, um die Auswirkungen dieser Bedingungen auf globale InsPs zu bewerten. Um eine stationäre Kennzeichnung zu erreichen, empfehlen wir, Pflanzen für mindestens 5 Tage zu kennzeichnen. 4. Extraktion von löslichen InsPs HINWEIS: Halten Sie Proben und Reagenzien während des gesamten Extraktionsprozesses auf Eis. Tragen Sie vor allem beim Schleifen immer Handschuhe und Schutzbrillen, da das Risiko des Kontakts mit radioaktivem Material hoch ist. Alles, was mit Proben in Berührung kommt, gilt als radioaktiver Abfall und sollte gemäß den örtlichen Vorschriften für die sichere Entsorgung radioaktiven Materials entsorgt werden. Bereiten Sie die Arbeitslösungen für den Extraktions- und Neutralisationspuffer wie in Schritt 2.1 vor. Für jede Probe werden 600 L Extraktionspuffer und 400 L Neutralisationspuffer benötigt. Bewahren Sie die Puffer auf Eis auf. Nehmen Sie die Proben aus -80 °C Gefrierschrank und bewahren Sie sie bis zur WeiterenVerarbeitung in flüssigem Stickstoff auf. Schleifen Sie die Proben mit einem Mikrozentrifugenrohr-Pestle, bis sie auftauen und fügen Sie 500 l eiskalten Extraktionspuffer hinzu. Weiter schleifen, bis die Probe vollständig homogenisiert ist und die Lösung eine tiefgrüne Farbe hat (wenn Blätter in der Probe vorhanden sind). Zentrifugieren Sie die Proben für 10 min bei 4 °C bei ≥ 18000 x g. Übertragen Sie den Überstand in ein frisches 1,5 ml Rohr. Beachten Sie, dass die zur Gewinnung verwendeten Rohre als feste radioaktive Abfälle gelten und entsprechend entsorgt werden müssen. Fügen Sie dem Extrakt vorsichtig 300 L Neutralisationspuffer hinzu. Die Fällung von Proteinen und das Blasen beginnen sofort. Mischen Sie durch Wirbeln mit einer Pipettenspitze nach einer Minute und warten Sie einige Sekunden, bevor Sie eine kleine Menge (5 l) auf pH-Papier (idealerweise Bereich von pH 6-9) pipetieren. Der pH-Wert sollte am Ende zwischen pH 7 und 8 liegen. Fügen Sie bei Bedarf kleine Mengen (in der Regel 10–20 l) entweder neutralisierenden Puffer oder Extraktionspuffer hinzu, bis der gewünschte pH-Wert erreicht ist. Lassen Sie die Proben mindestens 1 h mit offenem Deckel auf Eis ruhen. Zentrifugieren Sie die Proben für 10 min bei 4 °C bei ≥ 18.000 x g. Übertragen Sie den Überstand in ein frisches 1,5 ml Rohr.HINWEIS: Die Proben können entweder direkt in einem SAX-HPLC-Lauf verwendet oder auf Eis gehalten werden (wenn sie später am selben Tag verwendet werden) oder in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 °C für 2-u20124 Wochen gelagert werden. Um eine hohe Reproduzierbarkeit und Vergleichbarkeit zu gewährleisten, wird empfohlen, die Proben immer 5 min in flüssigem Stickstoff einzufrieren, auch wenn sie danach direkt verwendet werden. Eine längerfristige Lagerung der extrahierten Proben bei -80 °C ist möglich, solange probennur einmal aufgetaut werden. Wenn für die Analyse gefrorene Proben verwendet werden, stellen Sie sicher, dass nach dem Auftauen keine Partikel sichtbar sind. Ansonsten wieder zentrifugieren Sie 10 min bei 4 °C bei ≥ 18.000 x g und übertragen Sie den Überstand in ein frisches 1,5 ml Rohr. 5. Durchführen des HPLC-Laufs Den Bruchkollektor mit 96 kleinen Szintillationsfläschchen (Kapazität von 6 ml) ausstatten und jede Durchstechflasche mit 2 ml eines geeigneten Szintillationscocktails (z.B. Ultima-Flo AP Flüssigkeitsszintillationscocktail) füllen, die mit Puffern mit niedrigem pH-Wert und hoher Ammoniumphosphatkonzentration kompatibel ist (siehe Materialtabelle).HINWEIS: Die Anzahl der Durchstechflaschen und die Größe der Durchstechflaschen hängen vom verwendeten Bruchkollektor und Szintillationszähler ab. Es ist wichtig, zumindest die ersten 90 Fraktionenzu sammeln, wenn der hier beschriebene Gradient verwendet wird, um ein vollständiges Inositol-Polyphosphatprofil zu erhalten. Achten Sie auch darauf, jede Durchstechflasche und ihren jeweiligen Deckel richtig zu beschriften, um eine Verwechslung von Fraktionen oder Proben zu verhindern. Starten Sie das HPLC-System/die HPS-Pumpen und lassen Sie es betriebsbereit sein. Aktivieren Sie die Kolbendichtungswäsche und halten Sie sie während des gesamten Laufs aktiviert. Laden Sie die Probe manuell mit einer geeigneten Spritze (siehe Materialtabelle)aus Schritt 4,5 (ca. 750 l). Wenn eine automatische Injektion möglich ist, übertragen Sie die Probe in die entsprechende Probendurchstechs. Drehen Sie das Ventil von “Load” in die Position “injizieren” und starten Sie den Gradienten und den Bruchkollektor.HINWEIS: Je nach verwendetem HPLC-System kann sich das Startverfahren unterscheiden, insbesondere beim Vergleich älterer Systeme (wie hier beschrieben) mit einem vollständig softwaregesteuerten neueren Modell. Es ist sehr wichtig, sicherzustellen, dass der Gradient, die Probeninjektion und die Bruchsammlung gleichzeitig beginnen. Während der HPLC-Lauf läuft, überprüfen Sie den Druck regelmäßig. Der Startdruck sollte um 18–24 bar (1,8–2,4 MPa) betragen und langsam auf 50–60 bar (5–6 MPa) ansteigen, sobald 100% Puffer B erreicht ist.VORSICHT: Verringerter Druck kann auf ein Leck im System hinweisen, während erhöhter Druck auf eine Verstopfung hindeutet. Druckschwankungen (≥ 3 bar in wenigen Sekunden) können das Vorhandensein von Luft im System anzeigen. Denken Sie daran, dass alles, was die Säule verlässt, sowie jede Leckage, die am Injektor oder danach auftritt, radioaktivist.HINWEIS: Der Druck hängt auch vom HPLC-System ab und kann niedriger oder höher sein als hier angegeben. Sie wird nach etwa 15-20 Läufen langsam zunehmen. Dies hat jedoch keinen notwendigerweise Enzauseneinfluss auf die Qualität der erhaltenen Läufe. Nach dem Lauf die Fläschchen fest schließen und die Fraktionen mit dem Szintillationscocktail durch kräftiges Schütteln vermischen. Fahren Sie direkt mit der Messung fort oder halten Sie die Fläschchen in aufrechter Position, idealerweise im Dunkeln.HINWEIS: Brüche, die mit Szintillationscocktail gemischt werden, sind wochenlang stabil und können später gemessen werden. Da die Halbwertszeit von Tritium 12,32 Jahre beträgt, ist der Signalverlust vernachlässigbar. Sobald der Lauf der letzten Probe des Tages abgeschlossen ist, stoppen Sie beide HPLC-Pumpen. (Optional) Um die Lebensdauer des Systems zu erhöhen, vor allem, wenn es nicht regelmäßig verwendet wird, waschen Sie Pumpe B und Kapillaren, indem Sie die Kapillare aus Puffer B in eine Flasche mit Puffer A legen und die Pumpe 10–15 min laufen lassen. Denken Sie vor der nächsten Verwendung daran, die Kapillare in Puffer B zu ersetzen und Pumpe B vom Mischer zu entkoppeln, um sie mit Puffer B zu spülen. Sobald die Pumpe und die Kapillaren wieder mit Puffer B gefüllt sind, schließen Sie es wieder mit dem Mischer an und das System ist einsatzbereit. 6. Messung der Fraktionen Legen Sie die Fläschchen in Szintillationszählerracks ein und messen Sie jede Durchstechflasche 5 min in einem flüssigen Szintillationszähler. Verwenden Sie idealerweise Racks, die direkt auf kleine Fläschchen passen und vermeiden, dass sie in größeren (z. B. 20 ml) Durchstechflaschen in den Durchstechflaschen hängen, um Zählfehler zu reduzieren. Die in diesem Protokoll verwendeten Softwareeinstellungen sind in der ergänzenden Abbildung 1dargestellt.HINWEIS: Führen Sie regelmäßig ein SNC-Protokoll (Selbstnormalisierung und Kalibrierung) mit unausgequetschten [3H]-Standards durch. Kürzere Zählzeiten (1–5 min) sind möglich, um die Wartezeit zu verkürzen. Um jedoch eine hohe Reproduzierbarkeit und Genauigkeit der Zählbarkeit zu gewährleisten, werden 5 min empfohlen. 7. Datenanalyse Exportieren Sie die Messungen aus dem Szintillationszähler als Tabellenkalkulationsdatei oder als kompatibles/konvertierbares Dateiformat. Bewerten Sie die Daten mit einem Computer, der mit Excel oder ähnlicher Software ausgestattet ist, und einer geeigneten Analysesoftware wie Origin. Bereiten Sie ein 2D-Liniendiagramm vor, in dem die gemessenen Zahlen pro Minute (cpm) anhand der Aufbewahrungszeit dargestellt werden (siehe Abbildung 1, Abbildung 2). Um Stichproben miteinander zu vergleichen, normalisieren Sie die Daten, indem Sie die cpm aus jedem eluierten Bruch von Minute 25 bis 96 für jede einzelne Probe summieren.ANMERKUNG: Minute 25 wird als Cut-off verwendet, um die nicht inkorporierte [3H]- Myo-Inositol, InsP1 und InsP2 von der Analyse auszuschließen, da diese tendenziell stark schwanken und nicht gut getrennt werden können (zumindest mit dem in diesem Protokoll vorgeschlagenen Gradienten) und damit den Normalisierungsfaktor aufgrund ihrer hohen Aktivität stark verändern.myo Normalisieren Sie alle Daten für die Stichprobe mit der niedrigsten Gesamtsumme von cpm (in den Fraktionen 25-u201296), indem Sie die Gesamt-cpm von der Stichprobe mit der niedrigsten cpm (in den Brüchen 25-96) durch die Gesamt-cpm (in den Bruchteilen 25-96) der anderen Stichproben dividieren. Der resultierende Faktor kann dann verwendet werden, um die cpm aus jedem Bruch zu normalisieren, indem der cpm jedes Bruchs mit dem Faktor multipliziert wird.HINWEIS: Am Ende sollte die Summe der cpm-Werte von Minute 25 bis zum Ende für alle Stichproben im Vergleich zueinander gleich sein. Nur normalisierte Durchläufe sollten im selben Diagramm/derselben Abbildung dargestellt werden (wenn sie als tatsächliche Profile dargestellt werden). Ergänzende Abbildung 2 zeigt ein Beispiel dafür, wie diese Berechnungsschritte durchgeführt werden (zur Vereinfachung nur die Brüche 25 bis 35 von zwei Stichproben). In einigen Fällen ist es jedoch nicht notwendig, Daten zu normalisieren. Wenn z. B. Spitzen gemäß Schritt 7.4 quantifiziert und als Prozentsätze der gesamten InsPs dargestellt werden (siehe Abbildung 3D). Wie bereits erwähnt, ist bei der Darstellung mehrerer Analysen nebeneinander als Profile oder bei der Verwendung der tatsächlich gemessenen Aktivität für Schlussfolgerungen (z. B. Behandlung a) eine InsP-Erhöhung um7 % im Vergleich zur Kontrolle erforderlich, wobei die cpm-Werte von InsP7 beider Proben und nicht auf ihren Prozentsatz der GesamtinsP- Um die Auswirkungen des Genotyps oder der Behandlungsunterschiede auf die Etikettiereffizienz zu analysieren, ist es wichtig, sich nicht zu normalisieren,da dies diese Unterschiede entkräften würde. Die absolute Quantifizierung mit dieser Methode ist jedoch eine Herausforderung, da die Extraktionseffizienz mit diesem Protokoll aus verschiedenen Gründen variabel sein kann und manchmal sogar beobachtet wird, wenn Repliken desselben Genotyps und derselben Behandlung analysiert werden. Beachten Sie, dass je nach HPLC-System, Spalte und Gradient, der für die Analysen verwendet wird, der Cut-off möglicherweise geändert werden muss. Um relative Quantifizierungen bestimmter Inositol-Polyphosphatspitzen durchzuführen und anschließend Balkendiagramme zu erstellen, die Replikationsdaten für statistische Analysen enthalten, setzen Sie die Analyse mit einer speziellen Software fort, die Spitzenbereiche von Chromatogrammen (z. B. Origin) berechnen kann. Siehe Ergänzende Abbildung 3.HINWEIS: Die meisten Software-gesteuerten HPLC-Systeme werden mit einer entsprechenden Software geliefert, die diese Aufgabe erfüllen kann. Peaks werden als Die Brüche mit cpm-Werten über dem Hintergrund (der bis zu einem gewissen Grad zwischen durch Läufe variiert) und Aufbewahrungszeiten bestimmt, die den zuvor veröffentlichten Daten ähneln. Die Aufbewahrungszeit eines bestimmten Peaks wird in Tabellenkalkulationssoftware (z. B. Excel) bestimmt und verwendet, um Spitzen für die Berechnung bestimmter Integrale (z. B. in Origin) zuzuweisen. Ergänzende Abbildung 3 veranschaulicht diesen Prozess der Spitzenbestimmung, der Hintergrundsubtraktion und der Integration von Spitzen.

Representative Results

Die hier gezeigten Ergebnisse sollen mögliche Ergebnisse veranschaulichen, die nach Schwankungen auf technischer und biologischer Ebene erzielt werden. Die erste wird durch Analysen anhand von neuen versus gealterten Spalten (Abbildung 1) und frischen im Vergleich zu gespeicherten Proben (Abbildung 3) veranschaulicht, und die zweite durch Auswertung von Extrakten aus zwei verschiedenen Pflanzensystemen, A. thaliana (Abbildung 1, Abbildung 3) und L. japonicus (Abbildung 2). Ein optimaler SAX-HPLC-Lauf ist auf Abbildung 1A’u2012Cdargestellt, die ein vollständiges Inositol-Polyphosphat-Spektrum zeigt, das nach der Szintillationszählung aus A. thaliana-Extrakten gewonnen wird. Beachten Sie, dass Spitzen schön getrennt sind und verschiedenen Isomern (oder Enantiomer-Paaren) basierend auf chromatographischen Mobilitäten zugeordnet werden können, die oben beschrieben wurden5,7. Abbildung 2 zeigt das repräsentative Ergebnis einer SAX-HPLC-Analyse von L. japonicus Sämlingen, die unter den gleichen Bedingungen wie die Arabidopsis Sämlinge angebaut und gekennzeichnet wurden. Während vermutlich alle InsP-Arten und Spitzen, die von Arabidopsis bekannt sind, zu sehen sind, gibt es erhebliche Unterschiede in Bezug auf die relative (z.B. Verhältnisse zwischen Isomere) Menge spezifischer InsP-Isomere, wenn man die Profile beider Arten vergleicht. Zum Beispiel zeigten die Lotus-Extrakte erhöhte InsP3c, InsP4b, InsP 5b und reduzierte InsP3a, InsP4a, InsP5a und InsP5c im Vergleich zu Arabidopsis, die Raum für weitere Untersuchungen lässt.5b Abbildung 2D zeigt die unterschiedlichen Verhältnisse zwischen InsP-Isomern zwischen Arabidopsis und Lotus. Abbildung 3 zeigt zwei InsP-Profile einer Probe, die nach der Extraktion geteilt wurde. Die erste Hälfte wurde sofort analysiert und die zweite Hälfte einen Tag später, nach Lagerung bei -80 °C. Beachten Sie, dass zwischen den verschiedenen Stichproben nur geringfügige Unterschiede beobachtet werden (d. h. schwarze und rote Linien in Abbildung 3A- u2012Cund Abbildung 3D). Dies zeigt, dass ein Frost-Tau-Zyklus der Probe nicht schadet und dass die Methode selbst reproduzierbare Ergebnisse erzeugt. Abbildung 1: Typisches InsP-Profil einer erfolgreichen und einer erfolglosen SAX-HPLC-Analyse, die mit diesem Protokoll durchgeführt wurde. (A2012C) SAX-HPLC Profil von 17 Tage alten Wildtyp (Col-0) Arabidopsis Sämlinge radioaktiv mit [3H]- Myo-Inositol.myo Die globale InsP-Extraktion und der SAX-HPLC-Lauf wurden am selben Tag durchgeführt. (A) Volle Spektren; (B, C) Zoom-Ins des Profils in A. Alle sichtbaren Peaks werden hervorgehoben und den entsprechenden InsP-Arten zugeordnet. Basierend auf veröffentlichten chromatographischen Mobilitäten5,7, insP4a wahrscheinlich repräsentiert Ins(1,4,5,6)P4 oder Ins(3,4,5,6)P4, InsP5a steht für InsP5 [2-OH], InsP5b steht für InsP5 [4-OH] oder seine enantiomere Form InsP5 [6-OH], und InsP5c steht für InsP5 [1-OH] oder seine enantiomere Form InsP5 [3-OH]. Die isomerischen Naturen von InsP3a-c, InsP4b, InsP7und InsP8 sind noch unbekannt. Panel (D) zeigt ein SAX-HPLC-Profil von gleich gewachsenen Pflanzen, jedoch mit einer gealterten Spalte (>40 Durchläufe). Eine deutliche Verringerung von InsP6 im Vergleich zu anderen InsP-Arten und das Fehlen von PP-InsPs ist sichtbar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: Repräsentatives InsP-Profil von L. japonicus-Pflanzen. SAX-HPLC-Profil (A- 2012C) von 17 Tage alten Wildtyp (Gifu) L. japonicus Sämlinge radioaktiv mit [3H]- Myo-Inositol.myo (A) Volle Spektren; (B, C) Zoom-Ins des Profils in A. Alle sichtbaren Peaks werden hervorgehoben und den entsprechenden InsP-Arten zugeordnet. Basierend auf den veröffentlichten chromatographischen Mobilitäten5,7stellt InsP4a wahrscheinlich Ins(1,4,5,6)P4 oder Ins(3,4,5,6)P4, InsP5b wahrscheinlich in InsP5 [4-OH] oder seine enantiomere Form InsP5 [6-OH] dar, und InsP5c stellt wahrscheinlich InsP5 [1-OH] oder seine enantiomere Form InsP5 [3-OH] dar. Die isomerischen Naturen von InsP3a-c, InsP4b, InsP7und InsP8 sind unbekannt. (D) Vergleich zwischen den einzelnen InsP-Arten (in % der Gesamtaktivität aus der Elution 25-u201296) von A. thaliana (Daten aus Abbildung 1A’u2012C) und L. japonicus (Daten aus Abbildung 2A–C). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3: InsP-Profile einer geteilten Probe, die die Reproduzierbarkeit von SAX-HPLC-Analysen veranschaulichen. (A2012C) SAX-HPLC Profile von 17 Tage alten Wildtyp (Col-0) Arabidopsis Sämlinge radioaktiv mit [3H]- Myo-Inositol.myo Vor dem Lauf wurde die Probe geteilt und die eine Hälfte lief sofort und die andere Hälfte einen Tag später nach Lagerung bei -80 °C. (A) Volle Spektren; (B, C) Zoom-Ins des Profils in A. Alle sichtbaren Peaks werden hervorgehoben und den entsprechenden InsP-Arten zugeordnet. Basierend auf veröffentlichten chromatographischen Mobilitäten5,7, insP4a wahrscheinlich repräsentiert Ins(1,4,5,6)P4 oder Ins(3,4,5,6)P4, InsP5a steht für InsP5 [2-OH], InsP5a steht für InsP5 [2-OH], InsP5b für InsP5 [4-OH] oder seine enantiomere Form InsP5 [6-OH], und InsP5c repräsentiert InsP5 [1-OH] oder seine enantiomere Form InsP5 [3-OH]. Die isomerischen Naturen von InsP3a-c, InsP4b, InsP7und InsP8 sind noch unbekannt. Panel D zeigt die Quantifizierung von InsP6 und der PP-InsPs InsP7 und InsP8 beider Durchläufe. Die Werte stellen den Betrag (in %) dar. der jeweiligen InsP-Arten relativ zu allen InsP (Gesamtaktivität aus Elution 25–96). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Ergänzende Abbildung 1: Softwareeinstellungen für die Flüssigkeitsszintillationszählung mit einem Lichtszintillationszähler. Screenshots, die die Softwareversion zeigen, sowie Einstellungen, die für die Szintillationszählung von [3H] mit diesem Protokoll durchgeführten Samples verwendet werden, werden dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen. Ergänzende Abbildung 2: Repräsentatives Beispiel für die Datennormalisierung. Ein Screenshot eines Arbeitsblatts zeigt alle Schritte und Formeln, die zum Normalisieren von SAX-HPLC-Läufen miteinander verwendet werden. Zur Vereinfachung werden nur Bruchteile von 25 bis 35 Proben angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen. Ergänzende Abbildung 3: Spitzenbestimmung, Hintergrundsubtraktion und Integration mit Analysesoftware. (A) Daten aus der SAX-HPLC-Analyse werden in die Software geladen (Minuten 28-96) und das Peak Analyzer Tool ausgewählt. (B-2012E) Die Basislinie wird manuell definiert, indem Punkte zwischen einzelnen Peaks festgelegt werden, und der Hintergrund wird subtrahiert. (F) Peaks werden manuell anhand des Aussehens bestimmt und veröffentlichte chromatographische Mobilitäten5,7. (G) Spitzenbereiche werden manuell durch cpm-Werte definiert. (H) Peaks sind integriert und werden als % aller Peaks berechnet. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Discussion

Hier präsentieren wir eine vielseitige und sensible Methode zur Quantifizierung von InsPs einschließlich PP-InsPs in Pflanzenextrakten und geben praktische Tipps, wie man diese Methode etablieren kann. Obwohl das Protokoll im Allgemeinen robust ist, können suboptimale Ausführungen und Analysen auftreten. In den meisten Fällen können diese Läufe durch eine starke Reduktion oder sogar einen vollständigen Verlust von hochphosphorylierten InsPs, insbesondere der PP-InsP-Arten InsP7 und InsP8,identifiziert werden. Mögliche Ursachen können mikrobielle Verunreinigungen des Pflanzenmaterials und eine unzureichende Deaktivierung der endogenen Pflanzen-PP-InsP-Hydrolasen während der Extraktion aufgrund unzureichender Schleifen und Auftauen von Pflanzenmaterial sein, das nicht in unmittelbarem Kontakt mit dem Extraktionspuffer steht. Weitere Gründe sind eine ungenaue pH-Anpassung durch unzureichende oder übermäßige Zugabe des Neutralisationspuffers oder einfach unzureichendes Probenmaterial. Letzteres kann es schwierig machen, PP-InsPs zu erkennen, da diese oft in sehr geringen Mengen in den Zellen vorhanden sind. Ein Überschuss an Probenmaterial oder ineffiziente Trocknung während Schritt 3.5 kann zu einer Verdünnung der Perchlorsäure führen, was auch zu einer unzureichenden Enzymdeaktivierung und einem spezifischen Verlust von InsP6 und PP-InsPs führen kann. Die Menge an Pflanzenmaterial sowie das in diesem Protokoll verwendete Radiolabel wurden auf DerGrundlage von Kosten und Leistung optimiert und liegen damit nahe an der niedrigsten Menge, die noch für optimale Ergebnisse ausreicht. Darüber hinaus wird das Säulenharz allmählich seine Auflösungskapazität verlieren. Das erste Anzeichen dieses Prozesses ist (aus Gründen, die den Autoren nicht ganz klar sind) ein spezifischer Verlust höherer phosphorylierter InsP-Arten wie der PP-InsPs im HPLC-Spektrum. Bei weiterer Alterung wird selbst InsP6 von der Spalte nicht richtig aufgelöst (Abbildung 1D). Daher ist der Einsatz einer geeigneten Säule sowie die sorgfältige Handhabung der Probe und die ordnungsgemäße Wartung der HPLC-Komponenten entscheidend, um genaue Ergebnisse zu gewährleisten.

Beim Vergleich von Proben und Läufen, insbesondere bei der Erstellung mit unterschiedlichen Geräten (z. B. HPLC-Systeme und -Säulen) oder an verschiedenen Tagen, ist es entscheidend, die Proben untereinander zu normalisieren (wie in Schritt 7.3 beschrieben) und sie auf die gleiche Weise zu analysieren. Nur durch Normalisierung ist es möglich und genau, mehrere Stichproben im selben Graphen zu zeigen (Abbildung 3). Für die Quantifizierung einzelner InsPs im Verhältnis zu den GesamtinsPs oder zu einer anderen spezifischen InsP-Art ist es nicht notwendig, sich zu normalisieren, solange nur relative Werte und nicht absolute Werte angezeigt werden. Idealerweise werden sowohl die InsP-Profile als auch die Quantifizierungen angezeigt. In einigen Fällen ist es jedoch nicht möglich, zwei oder mehr Durchläufe in demselben Diagramm angemessen anzuzeigen. Unterschiedliche Retentionszeiten oder unterschiedliche Hintergrundaktivitätsstufen können den Vergleich nicht quantifizierter SAX-HPLC-Profile allein erschweren. Dasselbe gilt, wenn viele Proben verglichen werden müssen. In solchen Fällen ist eine weitere Auswertung mit einer zusätzlichen Software (z.B. Origin) zur individuellen Spitzenquantifizierung erforderlich.

Die Autoren sind sich bewusst, dass das hier beschriebene Protokoll optimiert werden kann und an jede einzelne Forschungsfrage angepasst werden muss. Obwohl für Arabidopsis Extrakte7,17 in diesem Protokoll optimiert, ist diese Methode vielseitig und kann helfen, InsP-Profile von anderen Pflanzenarten sowie zu bestimmen. Hier zeigen wir diese Möglichkeit, indem wir erstmals ein InsP-Profil für L. japonicuspräsentieren, das keine Änderungen der Etikettierungsbedingungen, insP-Extraktion oder SAX-HPLC-Lauf erforderte (Abbildung 2). Bemerkenswert ist, dass die Unterschiede zwischen L. japonicus und Arabidopsis InsP-Profilen insgesamt ähnlich sind. Zum Beispiel sind in L. japonicus InsP5 [4-OH] oder seiner enantiomeren Form InsP5 [6-OH] reichlicher als InsP5 [1-OH] oder seine enantiomere Form InsP5 [3-OH] im Vergleich zu Arabidopsis,wo InsP5 [1-OH] oder seine enantiomere Form InsP5 [3-OH] die dominierende InsP5 Sind. Ebenso gehen wir davon aus, dass Veränderungen in der Medienzusammensetzung,[3H]- Myo-Inositol-Konzentration, Pflanzenalter, Umgebungsbedingungen (z. B. Licht und Temperatur), Zugabe chemischer Verbindungen oder Analysen pflanzenmikrobieller Wechselwirkungen unter anderem getestet und angepasst werden müssen.myo

Ein wichtiger Nachteil dieser Methode, die berücksichtigt werden muss, ist, dass die Kennzeichnung in einer (sterilen) flüssigen Kultur erfolgt, die für die meisten Landpflanzen keine physiologische Umgebung darstellt. Darüber hinaus ist aufgrund der hohen Kostenmyovon [3H]- Myo-Inositol das Volumen der Etikettierlösung und die Größe des Kulturgefäßes im Allgemeinen begrenzt, was auch die Größe der pflanzen begrenzt, die verwendet werden können. Der Anbau in flüssiger Kultur kann vermieden werden, indem z.B. Blätter von bodenbewachsenen Pflanzen mit [3H]- Myo-Inositol direkt infiltriert und anschließend dem hier beschriebenen Protokoll folgen, wie zuvor berichtet10.myo

Es gibt mehrere Nachteile dieses Protokolls im Vergleich zu alternativen Methoden, wie TiO2 Pull-down gefolgt von PAGE oder Massenspektrometrie-basierten Techniken. Aufgrund der [3H]- Myo-Inositol-Kennzeichnung werden am Ende nur InsP-Arten nachgewiesen, die direkt von radioaktiv markiertem Myo-Inositolstammen.myo Die hier beschriebene Methode ist blind gegenüber anderen Ins-Isomen wie Scyllo-Inositolund anderen Isomern, von denen einige in bestimmten Pflanzen identifiziert wurden44. Darüber hinaus werden Myo-InsPs, die von anderen Wegen abgeleitet werden, ausgeschlossen, einschließlich der durch de novo-Synthese von myo Myo-Inositolund Myo-Inositol-3-Phosphatüber Isomerisierung von Glucose-6-Phosphat, katalysiert durch Myo-Inositol-3-Phosphat-Synthase(MIPS)-Proteine45. de novo Obwohl [32P] oder [33P]-Orthophosphatals alternative Etiketten verwendet werden können, stellt ihre Verwendung einen großen Nachteil dar, da jedes phosphathaltige Molekül, einschließlich der reichlich vorhandenen Nukleotide und seiner Derivate, gekennzeichnet wird. Diese Moleküle können auch mit diesem Protokoll extrahiert werden und an die SAX-Säule binden, was zu einem hohen Niveau an Hintergrundaktivität führt, die die Identifizierung einzelner InsP-Peaks5stören wird. Darüber hinaus kann die Quantifizierung von [32P]- oder [33P] -markierten InsPs und PP-InsPs stark durch Phosphat- und Pyrophosphat-Moiety-Umsätze beeinflusst werden und möglicherweise keine Massenauslesung für Inositolarten melden.

Auf der anderen Seite, [3H]- Myo-Inositol etiketten speziell Myo-Inositol-haltigeMoleküle.myo InsPs, Inositol-haltige Lipide, wie Phosphoinositide, und Galactinol sind in diesem Fall gekennzeichnet. Allerdings werden nur InsPs mit diesem Protokoll analysiert, da Lipide im Extraktionspuffer unlöslich sind und Galactinol nicht an die SAX-Säule bindet.

Bisher sind die Unterschiede zu einem InsP-Profil der Pflanze, das durch [3H]-2 Myo-Inositol-Etikettierung erzeugt wird, im Vergleich zu einer durch TiO 2 Pulldown/PAGE ermittelten, unbekannt, da solche Vergleiche in Pflanzen nicht durchgeführt wurden.myo Eine aktuelle Studie an Tierzellen befasste sich mit dieser Frage46. In dieser Arbeit wurde ein Pool von InsP6 identifiziert, der durch [3H]- Myo-Inositol-Etikettierung unsichtbar ist, der dabei direkt aus Glucose-6-Phosphat abgeleitet werden sollte, indem SAX-HPLC-Profile mit PAGE-Gelen von Säugetierzelllinien verglichen wurden.myo 24 h Phosphathunger führten bei der Quantifizierung von PAGE-Gelen von InsPs, die mit TiO2 2-Pulldown gereinigt wurden, zu einem 150%igen Anstieg von InsP6. SAX-HPLC-Analysen von [3H]- myo-inositol-markierten Zellen, die identisch behandelt wurden, zeigten nur einen Anstieg um 15% von [3H]-InsP6.myo Wie bereits erwähnt, sind InsPs, die unter InsP5 liegen, mit der PAGE-Analyse in den meisten Fällen nicht nachweisbar. Radiolabeling gefolgt von SAX-HPLC scheint die Methode der Wahl zu sein, solange massenspektrometrische Protokolle nicht optimiert sind, um diese Gruppe von stark negativ geladenen Molekülen zu erkennen.

Eine weitere verbleibende Herausforderung besteht darin, Enantiomere in SAX-HPLC-Analysen (oder in jeder anderen Methode für InsP-Analysen)10,17zu unterscheiden. Diese Herausforderung kann durch die Zugabe von chiralen Selektoren, d.h. enantiopure Verbindungen wie L-Arginin-Amid, die mit den jeweiligen enantiomeren Molekülen interagieren, um diastereomere Komplexe zu bilden, die10getrennt werden können, angegangen werden. Unserer Kenntnis nach wurde dieser Ansatz nur umgesetzt, um die enantiomischen InsP 5-Isomer InsP5 [1-OH] und InsP5 [3-OH] durch NMR-Analysen10zu diskriminieren.5 Diskriminierung anderer enantiomere Paare oder erfolgreiche Diskriminierung von Enantiomern durch chirale SAX-HPLC-Analyse oder chirale PAGE-basierte Methoden wurden noch nicht gemeldet und sollten weiterentwickelt werden. Unter Berücksichtigung der konservierten Synthese und der konservierten Regulierung von PP-InsPs durch Phosphorverfügbarkeit stellen wir uns vor, dass insbesondere nicht-radioaktive Methoden wie PAGE- oder MS-basierte Methoden zusammen mit Nährstoffanalysen dazu beitragen werden, die Bemühungen zur Messung von Fernerkundungsdaten zur Diagnose von Nährstoffmangel in Kulturen17,18,24,25zu kalibrieren. Die hier vorgestellte Methode kann jedoch derzeit noch als Goldstandard für InsP-Analysen betrachtet werden und wird entscheidend dazu beitragen, neue Funktionen dieser faszinierenden Botenstoffe in Pflanzen zu entdecken.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gefördert wurde diese Arbeit von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der Exzellenzstrategie Deutschlands – EXC-2070 – 390732324 (PhenoRob), der Graduiertengruppe GRK2064 und den Individuellen Forschungsstipendien SCHA1274/4-1 und SCHA1274/5-1 an G.S. Wir danken auch Li Schlüter und Brigitte Ueberbach für die technische Unterstützung.

Materials

Centrifuge Eppendorf AG model: 5430 R
Diammonium hydrogen phosphate, ≥97 % Carl Roth GmbH + Co. KG 0268.1
Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate, ≥99 %, p.a., ACS Carl Roth GmbH + Co. KG 8043.2
Falcon 12-well clear flat bottom TC-treated multiwell cell culture plate, with lid, individually wrapped, sterile Corning Inc. 353043
Fraction collector LAMBDA Instruments GmbH model: OMNICOLL single channel collector
Growth incubator poly klima GmbH model: PK 520-LED
HPLC pumps Kontron Instruments model: 420
HPLC syringe for Rheodyne valves, 1 mL Hamilton Company 81365
Injector for HPLC Supelco model: Rheodyne 9725
Inositol, myo-[1,2-3H(N)] American Radiolabeled Chemicals Inc. ART 0261
Liquid nitrogen University, Chemistry Department
Liquid scintillation counter PerkinElmer Inc model: TRI-CARB 2900TR
Micro pestle Carl Roth GmbH + Co. KG CXH7.1
Mixed cellulose Eester filter, ME range (ME 24), plain, 0.2 µm pore size, 47 mm circle GE Healthcare Life Sciences 10401770
Mixer for HPLC Kontron Instruments model: M 800
Murashige & Skoog medium, salt mixture Duchefa Biochemie M0221
OriginPro software OriginLab Corp.
Orthophosphoric acid, ≥85 %, p.a., ISO Carl Roth GmbH + Co. KG 6366.1
Partisphere 5 µm SAX cartridge column, 125 x 4.6 mm Hichrom Limited 4621-0505
Perchloric acid, 70 %, 99.999 % trace metals basis Sigma-Aldrich 311421
Petri dish, square, PS, clear, 120/120/17 mm, sterile Greiner Bio One International GmbH 688161
pH-indicator paper pH 5.5 – 9.0, Neutralit Merck KGaA 109564
Phytagel Sigma-Aldrich P8169
Potassium carbonate Carl Roth GmbH + Co. KG P743.2
Safe-Lock tubes, 1.5 mL Eppendorf AG 30120086
Sample loop for 9725 injectors, volume 2 mL, PEEK Supelco 57648
SNAPTWIST scintillation vial, 6.5 mL Simport Scientific Inc. S207-5
Sterile bench LaboGene model: ScanLaf MARS 900
Sucrose, ≥99,5 %, p.a. Carl Roth GmbH + Co. KG 4621.1
Ultima-Flo AP liquid scintillation cocktail PerkinElmer Inc 6013599
Ultra-pure deionized water Milli-Q
Wrenchless WVS End Fitting Kit Hichrom Limited 4631-1001
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References

  1. Berridge, M. J., Irvine, R. F. Inositol Phosphates and Cell Signaling. Nature. 341 (6239), 197-205 (1989).
  2. Streb, H., Irvine, R. F., Berridge, M. J., Schulz, I. Release of Ca-2+ from a Nonmitochondrial Intracellular Store in Pancreatic Acinar-Cells by Inositol-1,4,5-Trisphosphate. Nature. 306 (5938), 67-69 (1983).
  3. Krinke, O., Novotna, Z., Valentova, O., Martinec, J. Inositol trisphosphate receptor in higher plants: is it real. Journal of Experimental Botany. 58 (3), 361-376 (2007).
  4. Kuo, H. F., et al. Arabidopsis inositol pentakisphosphate 2-kinase, AtIPK1, is required for growth and modulates phosphate homeostasis at the transcriptional level. Plant Journal. 80 (3), 503-515 (2014).
  5. Kuo, H. F., et al. Arabidopsis inositol phosphate kinases IPK1 and ITPK1 constitute a metabolic pathway in maintaining phosphate homeostasis. Plant Journal. 95 (4), 613-630 (2018).
  6. Gillaspy, G. E., Capelluto, D. G. S. . Lipid-mediated Protein Signaling. , 141-157 (2013).
  7. Stevenson-Paulik, J., Bastidas, R. J., Chiou, S. T., Frye, R. A., York, J. D. Generation of phytate-free seeds in Arabidopsis through disruption of inositol polyphosphate kinases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (35), 12612-12617 (2005).
  8. Lemtiri-Chlieh, F., MacRobbie, E. A. C., Brearley, C. A. Inositol hexakisphosphate is a physiological signal regulating the K+-inward rectifying conductance in guard cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (15), 8687-8692 (2000).
  9. Lee, H. S., et al. InsP6-sensitive variants of the Gle1 mRNA export factor rescue growth and fertility defects of the ipk1 low-phytic-acid mutation in Arabidopsis. Plant Cell. 27 (2), 417-431 (2015).
  10. Blüher, D., et al. A 1-phytase type III effector interferes with plant hormone signaling. Nature Communications. 8, (2017).
  11. Murphy, A. M., Otto, B., Brearley, C. A., Carr, J. P., Hanke, D. E. A role for inositol hexakisphosphate in the maintenance of basal resistance to plant pathogens. Plant Journal. 56 (4), 638-652 (2008).
  12. Poon, J. S. Y., Le Fevre, R. E., Carr, J. P., Hanke, D. E., Murphy, A. M. Inositol hexakisphosphate biosynthesis underpins PAMP-triggered immunity to Pseudomonas syringae pv. tomato in Arabidopsis thaliana but is dispensable for establishment of systemic acquired resistance. Molecular Plant Pathology. 21 (3), 376-387 (2020).
  13. Wild, R., et al. Control of eukaryotic phosphate homeostasis by inositol polyphosphate sensor domains. Science. 352 (6288), 986-990 (2016).
  14. Shears, S. B. Inositol pyrophosphates: Why so many phosphates. Advances in Biological Regulation. 57, 203-216 (2015).
  15. Shears, S. B. Intimate connections: Inositol pyrophosphates at the interface of metabolic regulation and cell signaling. Journal of Cellular Physiology. 233 (3), 1897-1912 (2018).
  16. Desai, M., et al. Two inositol hexakisphosphate kinases drive inositol pyrophosphate synthesis in plants. Plant Journal. 80 (4), 642-653 (2014).
  17. Laha, D., et al. VIH2 Regulates the Synthesis of Inositol Pyrophosphate InsP8 and Jasmonate-Dependent Defenses in Arabidopsis. Plant Cell. 27 (4), 1082-1097 (2015).
  18. Laha, D., et al. Arabidopsis ITPK1 and ITPK2 Have an Evolutionarily Conserved Phytic Acid Kinase Activity. Acs Chemical Biology. 14 (10), 2127-2133 (2019).
  19. Dorsch, J. A., et al. Seed phosphorus and inositol phosphate phenotype of barley low phytic acid genotypes. Phytochemistry. 62 (5), 691-706 (2003).
  20. Flores, S., Smart, C. C. Abscisic acid-induced changes in inositol metabolism in Spirodela polyrrhiza. Planta. 211 (6), 823-832 (2000).
  21. Brearley, C. A., Hanke, D. E. Inositol phosphates in barley (Hordeum vulgare L) aleurone tissue are stereochemically similar to the products of breakdown of InsP(6) in vitro by wheat-bran phytase. Biochemical Journal. 318, 279-286 (1996).
  22. Laha, N. P., et al. ITPK1-Dependent Inositol Polyphosphates Regulate Auxin Responses in Arabidopsis thaliana. bioRxiv. , (2020).
  23. Laha, D., et al. Inositol Polyphosphate Binding Specificity of the Jasmonate Receptor Complex. Plant Physiology. 171 (4), 2364-2370 (2016).
  24. Dong, J. S., et al. Inositol Pyrophosphate InsP(8) Acts as an Intracellular Phosphate Signal in Arabidopsis. Molecular Plant. 12 (11), 1463-1473 (2019).
  25. Zhu, J., et al. Two bifunctional inositol pyrophosphate kinases/phosphatases control plant phosphate homeostasis. Elife. 8, (2019).
  26. Couso, I., et al. Synergism between Inositol Polyphosphates and TOR Kinase Signaling in Nutrient Sensing, Growth Control, and Lipid Metabolism in Chlamydomonas. Plant Cell. 28 (9), 2026-2042 (2016).
  27. Ito, M., et al. Hydrophilic interaction liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the quantitative analysis of mammalian-derived inositol poly/pyrophosphates. Journal of Chromatography A. 1573, 87-97 (2018).
  28. Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Inositol Phosphates Purification Using Titanium Dioxide Beads. Bio-Protocol. 8 (15), (2018).
  29. Loss, O., Azevedo, C., Szijgyarto, Z., Bosch, D., Saiardi, A. Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates. Jove-Journal of Visualized Experiments. (55), e3027 (2011).
  30. Harmel, R. K., et al. Harnessing C-13-labeled myo-inositol to interrogate inositol phosphate messengers by NMR Electronic supplementary information (ESI) available. Chemical Science. 10 (20), 5267-5274 (2019).
  31. Azevedo, C., Saiardi, A. Extraction and analysis of soluble inositol polyphosphates from yeast. Nature Protocols. 1 (5), 2416-2422 (2006).
  32. Shears, S. B., Miller, G. J. . Inositol Phosphates: Methods and Protocols. , 1-28 (2020).
  33. Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Importance of Radioactive Labelling to Elucidate Inositol Polyphosphate Signalling. Topics in Current Chemistry. 375 (1), (2017).
  34. Stevenson-Paulik, J., et al. Inositol phosphate metabolomics: Merging genetic perturbation with modernized radiolabeling methods. Methods. 39 (2), 112-121 (2006).
  35. Liu, C., Riley, A. M., Yang, X., Shears, S. B., Potter, B. V. L. Synthesis and Biological Activity of d- and l-chiro-Inositol 2,3,4,5-Tetrakisphosphate: Design of a Novel and Potent Inhibitor of Ins(3,4,5,6)P4 1-Kinase/Ins(1,3,4)P3 5/6-Kinase. Journal of Medicinal Chemistry. 44 (18), 2984-2989 (2001).
  36. Hughes, P. J., Hughes, A. R., Putney, J. W., Shears, S. B. The regulation of the phosphorylation of inositol 1,3,4-trisphosphate in cell-free preparations and its relevance to the formation of inositol 1,3,4,6-tetrakisphosphate in agonist-stimulated rat parotid acinar cells. Journal of Biological Chemistry. 264 (33), 19871-19878 (1989).
  37. Shears, S. B., Kirk, C. J., Michell, R. H. The pathway of myo-inositol 1,3,4-trisphosphate dephosphorylation in liver. The Biochemical journal. 248 (3), 977-980 (1987).
  38. Stevenson-Paulik, J., Odom, A. R., York, J. D. Molecular and Biochemical Characterization of Two Plant Inositol Polyphosphate 6-/3-/5-Kinases. Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42711-42718 (2002).
  39. Stephens, L. R., Hawkins, P. T., Downes, C. P. An analysis of myo-[3H]inositol trisphosphates found in myo-[3H]inositol prelabelled avian erythrocytes. The Biochemical journal. 262 (3), 727-737 (1989).
  40. Saiardi, A., et al. Mammalian inositol polyphosphate multikinase synthesizes inositol 1,4,5-trisphosphate and an inositol pyrophosphate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (5), 2306 (2001).
  41. Azevedo, C., Burton, A., Bennett, M., Onnebo, S. M. N., Saiardi, A., Barker, C. J. . Inositol Phosphates and Lipids: Methods and Protocols. , 73-85 (2010).
  42. Saiardi, A., Caffrey, J. J., Snyder, S. H., Shears, S. B. The Inositol Hexakisphosphate Kinase Family: CATALYTIC FLEXIBILITY AND FUNCTION IN YEAST VACUOLE BIOGENESIS. Journal of Biological Chemistry. 275 (32), 24686-24692 (2000).
  43. Brearley, C. A., Hanke, D. E. Inositol phosphates in the duckweed Spirodela polyrhiza L. Biochemical Journal. 314, 215-225 (1996).
  44. Pollard, J. K., Steward, F. C., Shantz, E. M. Hexitols in Coconut Milk – Their Role in Nurture of Dividing Cells. Plant Physiology. 36 (4), 492 (1961).
  45. Donahue, J. L., et al. The Arabidopsis thaliana Myo-inositol 1-phosphate synthase1 gene is required for Myo-inositol synthesis and suppression of cell death. Plant Cell. 22 (3), 888-903 (2010).
  46. Desfougeres, Y., Wilson, M. S. C., Laha, D., Miller, G. J., Saiardi, A. ITPK1 mediates the lipid-independent synthesis of inositol phosphates controlled by metabolism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (49), 24551-24561 (2019).

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Inositol PolyphosphatesRadiolabelingSAX-HPLCPlant MetabolismPlant DevelopmentExtractionQuantificationLotus SeedsMyo-inositolSample PreparationHPLC Setup

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Gaugler, P., Gaugler, V., Kamleitner, M., Schaaf, G. Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC. J. Vis. Exp. (160), e61495, doi:10.3791/61495 (2020).
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