Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC

Philipp Gaugler; Verena Gaugler; Mar&#237;lia Kamleitner; Gabriel Schaaf

doi:10.3791/61495

JoVE Journal > Biochemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

생화학

SAX-HPLC를 사용하여 다른 식물 종에서 용해성, 방사성 라벨이 붙은 이노시톨 폴리인산염의 추출 및 정량화

Published: June 26, 2020

doi:

10.3791/61495

Philipp Gaugler¹, Verena Gaugler¹, Marília Kamleitner¹, Gabriel Schaaf¹

¹Department of Plant Nutrition, Institute of Crop Science and Resource Conservation,University of Bonn

Summary

여기서는^식물에서이노시톨 폴리인산염을 검출하고 정량화하는 매우 민감한 방법입니다.myo

Abstract

근로-이노시톨의 myo인산염 에스테르는 이노시톨 인산염(InsPs)이라고도 하며 식물 생리학에서 중요한 역할을 하는 세포 조절기관의 클래스입니다. 그들의 음전하, 낮은 풍부 및 가수 분해 활동에 감수성 때문에, 이 분자의 검출 그리고 정량화는 도전적입니다. 이것은 특히 ‘고에너지’ 디포스포 결합을 포함하는 고인형성의 경우, 또한 이노시톨 파이로포스페이트(PP-InsPs)라고 불립니다. 높은 감도로 인해 강력한 음이온 교환 고성능 액체 크로마토그래피 (SAX-HPLC)로 라벨식물^[3H]- myo-이노시톨은 현재 이러한 분자를 분석하는 선택의 방법입니다.myo [3H]-이노시톨을방사성라벨 식물 묘목으로 사용함으로써, 여러 비내포민성 이소종을 포함한 다양한 InsP 종은 고감도로 검출및 차별될 수 있다.³ 여기서, 적합한 SAX-HPLC 시스템의 설정뿐만 아니라 식물 재배, 방사성 라벨링 및 InsP 추출에서 SAX-HPLC 실행 및 후속 데이터 분석에 이르는 완전한 워크플로우가 설명된다. 여기에 제시된 프로토콜은 여러 비상화 성 isomers 및 PP-InsP, InsP₇ 및 InsP_8을포함하여 다양한 InsP 종의 차별 및 정량화를 허용하고 다른 식물 종에 쉽게 적응할 수 있습니다. 예로, SAX-HPLC 분석의 애비독시스 탈리아나 및 로터스 자포니쿠스 모종은 수행되고 완전한 InsP 프로파일이 제시되고 논의됩니다. 여기에 설명된 방법은 식물에서 InsPs의 생물학적 역할을 더 잘 이해하는 유망한 도구를 나타냅니다.

Introduction

거의 4년 전, 이노시톨 인산염(InsPs)은 Ins(1,4,5)P 3(InsP_3)가 동물세포^1,^,^2에서Ca^2+의 수용체 매개 방출을 활성화하는 두 번째 메신저로 확인된 후 신호 분자로 나타났다.₃ 현재까지, 식물 세포_3에서 InsP 3 수용체(IP3-R)가 확인되지 않았으며, 이는 식물 세포^3에서InsP_3에 대한 직접적인 신호 역할을 질문한다. 에 관계없이 InsP^,_3은 특정 신호 경로^,^,^,^3,^4,^5,^6,^7,^8의규제를 포함하여 여러 식물 개발 과정에 관여하는 다른 InsP의 선구자역할을 한다.⁷ 예를 들어, InsP_3는 인산염, 묘-이노시톨 및 양이온의주요 원천을 나타내는 “식물성 산”으로 도알려진 InsP_6에더 인포로울 수 있으며 병원균, mRNA 수출 및 인산성 본성^5,^,^9,^,^10,^,^{11, 112에}^,¹²대한 식물 방어에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다.

이노시톨 파이로포스페이트(PP-InsPs)는 동물세포, 아메바 및 효모에서 처음 확인된 적어도 하나의 고에너지 디-인산 결합을 포함하는 InsPs의 클래스로, 다양한 세포 공정에서 중요한 역할을 한다^13,^,^14,^,^15. ^,식물^16,^17,^,^,^,^,^19,^,^20,^21,¹⁹^22,^23,^,^24,^,^,^25,^,^26,이러한 분자의 생물학적 기능 및 isomer 정체성에서 PP-InsPs에 대한 정액 작용에도 불구하고 여전히 대부분 수수께끼로 남아 있습니다. 모델 식물에서 아기독시스 탈리아나,셀룰러 InsP_8은 ASK1-COI1-JAZ 수용체 복합체(17)에 의한 InsP₈ 및 활성 자스모네이트의 우연의¹⁷검출을 통해 곤충 초식동물 및 괴사성 균류에 대한 방어를 조절하도록 제안되었다. 또한, InsP₈ 및 기타 PP-InsP의 에너지 항상성 및 영양 감지뿐만 아니라 인산염 항상성^17,^23,^24,^,^25,^,^26이제안되었다.^,^,

InsPs를 연구할 때 고용된 생물학적 시스템에 관계없이, InsPs를 공부할 때 한 가지 주요 방법론적 과제는 이러한 분자의 신뢰할 수 있는 검출 및 정밀한 정량화였습니다. 질량 분광법 기반 방법은 세포 추출물에서 PP-InsP를 포함한 InsP를 검출하는 데 사용되었습니다. 그러나, 그 연구는 구별된 isomers 를 구별하는 데 실패^26,^,^27. InsPs를 분석하는 또 다른 접근 방식은 TiO₂ 구슬을 사용하여 세포 용해에서 InsPs의 풀다운을 사용하고, 그 다음으로 용출된 InsPs의 폴리아크라일아미드 젤 전기포아(PAGE)가 뒤따릅니다. 그런 다음 InsPs는 toluidine^,블루 또는 DAPI^24,^,^28,^29에의해 염색될 수 있습니다. 그러나, 지금까지 안정적으로이 방법을 사용하여 식물 추출물에서 InsP_5보다 낮은 InsPs를 검출 할 수 없습니다. 최근에는 InsPs의 핵자기 공명(NMR) 분석을 위한^[13C]-myo-이노시톨을 사용하는 방법이 강력한 음이온 교환 고성능 액체 크로마토그래피(SAX-HPLC)myo^30에대한 대안으로 공표되었다. 이 기술은 SAX-HPLC에 비해 유사한 감도를 달성하고 5-InsP_7의검출을 허용하고, 세포 추출물로부터 상이한 비상조인SP₅ isomers의 차별을 달성하는 것으로 보고되었다. 그러나, NMR-기반 방법의 구현은 화학적으로 합성되고 상업적으로 사용할 수 없는^[13C]-myo-이노시톨이 필요합니다.myo 따라서, 대부분의 경우에 사용되는 방법은 [3H]-myo-이노시톨을 이용한 방사성 라벨링 샘플이며, 그 다음으로 SAX-HPLC^31,³myo^,^32,^,^33이된다. 이 기술은 방사성 myo-이노시톨을식물로 섭취하고 전용 세포 키나아제와 인산염의 결합 된 활성에 의해 다른 InsPs로 변환을 기반으로합니다.

[3³H]-표지된 InsPs는 SAX-HPLC를 사용하여 산추출 및 분별됩니다. 이들의 음전하로 인해 InsP는 SAX-HPLC 컬럼의 양전하 고정 단계와 강하게 상호 작용하며, 증가하는 인산염 농도를 포함하는 완충그라데이션으로 동조하여 열에서 InsP를 능가할 수 있습니다. 따라서 용출 시간은 분리될 InsP 종의 전하 및 기하학에 의존한다. 키랄 컬럼이 없는 경우 비항성 이소성 이소성만 이 프로토콜에 의해 분리될 수 있습니다. 그러나, 방사성 표지 기준은 특정 InsP 피크의 이성질성 특성을 할당하는 데 사용될 수 있다. 과거에는 다양한 실험실에서 (바이오) 화학적 방법으로 표지및 라벨이 부착되지 않은 기준을 생성하거나 다양한 세포와 유기체로부터 정화하는 여러 노력이 특정 InsP 종에 피크를 할당하고 개별 InsP 종^,⁴³^,⁴¹^,⁴²^,⁴⁰^,^,^,^,^,^5,^,^7,^21,^,^34,^35,^36,^,^{37, 37, 37, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 38, 39,}^39.³⁹ 또한, 최근 식물에서 PP-InsPs의 형성으로 이어지는 효소 경로의 발각뿐만 아니라 특정 1-phytase 활성을 가진 세균형 III 이펙터의 발견은 이러한^,^{분석(10, 17,}^18,^,^,¹⁸^22,^,^23)에대한 유용한 표준을 생성하는 방법에 대한 정보를 제공한다.

결과 분획은 트리튬(3H)의 β 부패로 인해 액체 신경화³카운터에서 측정될 수 있다. 라벨링 시간이 증가함에 따라 꾸준한 상태 동위 원소 평형에 도달한 후 획득한 InsP 프로파일은^{식물(31)의}InsP 상태를 나타내야 한다. 이 프로토콜의 주요 장점은 InsPs에 대한 직접 전구체의 사용과 방사성 신호의 측정에 의해 달성된 고감도이다.

[3 H]-myo-이노시톨³라벨식물myo또는 기타 유기체로부터 추출된 샘플의 SAX-HPLC는 InsP 종에서 PP-InsP에 이르는 InsPs의 검출 및 정량화에 일반적으로 사용되며, InsPs의 대사, 기능 및 행동 모드를 더 잘 이해하는 귀중한 도구를 나타냅니다. 지금까지,이 방법은 또한 낮은 InsP 종에 특별한 관심을 가진 연구원을위한 가장 적합한 선택입니다. 여기에 설명된 프로토콜이 기반으로 하는 이 절차의 기본내용은 이전에^7,^,^21,^,^31,^,^34로설명되었지만 식물 유래 InsP 및 특히 PP-InsP의 분석에 맞는 상세한 프로토콜은 여전히 누락되어 있습니다. 이전 간행물은 낮은 풍부한 PP-InsP를 안정적으로 감지하는 데 어려움을 보고했습니다. 특히 InsP_8은,식물 재료의 상대적으로 낮은 양,^[3H]-myo-이노시톨 낮은 특정 활성 (> 20 Ci/mmol), 과염소산을 기반으로하지 않거나 1 M 미만의 추출 버퍼의 사용, 다른 중성 화 완충제뿐만 아니라 3 선에 있는 최적의 검출기 및 검출선에 대한 저조함[3] 및 검출에 따른 최적의 검출기 및 검출식[3]에 의한 검출기..myo³ 이러한 연구에 비해, 여기에 제시된 프로토콜은 PP-InsP^7,^,^21,^,34의 신뢰할 수 있는 검출을 위해^{고안되었습니다.}

여기에서는 장비 설정부터 재배 및 라벨링, InsP 추출 및 SAX-HPLC 실행 자체에 이르기까지 자세한 워크플로우를 제시합니다. 이 방법은 모델 식물 A. thaliana에최적화되었지만, 모델 르구스 자포니쿠스의첫 번째 보고된 InsP 프로파일과 함께 본편에 나타난 바와 같이 다른 식물 종을 연구하기 위해 쉽게 수정할 수 있다. 다른 식물 종의 사용은 약간의 최적화를 필요로 할 수 있지만, 우리는 그 사소한 것 상상, 이 프로토콜은 식물 InsP에 추가 연구를위한 좋은 출발점만들기. 가능한 최적화를 용이하게 하기 위해 수정이 가능한 프로토콜 내의 모든 단계와 메서드를 처음 수립할 때 어려울 수 있는 모든 중요한 단계를 나타냅니다. 또한 이 방법으로 얻은 데이터를 특정 InsP의 정량화에 어떻게 사용할 수 있는지, 그리고 다른 샘플을 분석하고 비교할 수 있는 방법을 보고합니다.

Protocol

1. HPLC 시스템 설정 두 개의 독립적인 HPLC 펌프(이진 펌프)로 구성된 시스템을 설정합니다. 두 펌프 모두 각각의 소프트웨어가 있는 컴퓨터를 통해 또는 마스터 펌프를 사용하여 함께 제어해야 합니다. 중력을 통해 또는 세 번째 저압 펌프를 통해 두 펌프모두에 피스톤 씰 워시를 구현합니다. 완충 A(펌프 A라고 불릴)에 대한 펌프 1개, 완충 B(펌프 B라고 불임)를 지정합니다.참고: 둘 다 최대 60bar(6MPa) 및 0.5mL/분의 유량의 압력을 생성할 수 있어야 합니다. 두 펌프를 다이나믹 믹서에 연결합니다. 믹서를 사출 밸브에 연결하여 최소 1mL 용량의 샘플 루프를 선택합니다. 해당 최종 피팅을 통해 모세관과 열에 사출 밸브를 연결합니다. 적절한 길이의 모세관을 사용하여 열을 분수 수집기에 연결합니다.참고: 이 설명은 HPLC 시스템(재료 표참조)을 기반으로 하며, 이 시스템은 새롭고 정교한 시스템보다 더 많은 수동 단계가 필요합니다. 우리의 시스템은 모든 구성 요소에 쉽게 액세스하고 수정 할 수 있습니다. 쿼터니 펌프(여기에 설명된 이진 그라데이션)도 사용할 수 있으며 이진 펌프로 달성된 것과 유사한 용출 프로파일 및 전반적인 분석 품질로 이어질 수 있습니다. 2. 버퍼, 열 및 HPLC 시스템 준비 수용성 InsPs의 추출을 위한 버퍼를 준비합니다: 추출 버퍼(1M HClO4)및 중화 버퍼(1MK2CO3). 초순수 분수로 버퍼를 모두 준비합니다. 그들은 몇 달 동안 실온에서 안정되어 있습니다. 추출 직전에 EDTA를 최종 농도 3m(예: 필터링된 250mM EDTA 스톡 솔루션)에 두 솔루션에 추가합니다.주의: HClO 4(과염소산)는 강하게 부식성입니다.4 SAX-HPLC 실행에 대한 버퍼를 준비: 버퍼 A (1 mM EDTA) 및 버퍼 B (1 mM EDTA, 1.3 M (NH4)2HPO4;pH3.8H 3 PO4). 0.2 μm 모공 크기의 멤브레인 필터를 사용하여 초순수 분수를 사용한 다음 진공 여과를 준비하십시오. 이들은 몇 달 동안 실온에서 안정적입니다.참고: EDTA는 InsP와의 양이온의 상호 작용을 방지하기 위해 모든 버퍼에 포함되어야 하며, 이로 인해 InsP 충전이 변경되거나 InsP 염복합체가 불용성일 수 있습니다. 그라데이션을 다음과 같이 프로그래밍합니다: 0\u20122 분, 0% 버퍼 B; 2\u20127 분, 최대 10% 버퍼 B; 7\u201268 분, 최대 84% 버퍼 B; 68\u201282 분, 최대 100% 버퍼 B; 82\u2012100 분, 100% 버퍼 B, 100\u2012101 분, 0% 버퍼 B까지; 101\u2012125 분, 0% 버퍼 B. 이 그라데이션의 최적 유량은 0.5mL/min입니다. 실행하는 동안 분당 분수를 수집하여 분 당 1분에서 96분까지 수집합니다. 그라데이션의 나머지 30분은 컬럼과 시스템을 세척하는 역할을 하며, 신경수 계수를 위해 수집할 필요가 없습니다. 가능하면 HPLC 펌프의 비상 정지 전에 최대 도달 가능한 압력을 80bar(8MPa)로 설정합니다. 이렇게 하면 컬럼수지가 심각한 손상을 입지 않습니다. 새로운 SAX HPLC 컬럼을 사용하는 경우, 첫 번째 사용 전에 여과된 초순수 탈이온수로 철저히 세척(>50 mL)을 세척합니다.참고: 이것은 포함 된 메탄올의 제거를 보장 하므로 나중에 단계에서 소금 강수량을 방지. 가능하면 별도의 HPLC 펌프를 사용합니다. 이 것을 사용할 수 없는 경우 열을 세척하기 전에 HPLC가 물로 플러시되었는지 확인합니다. 유량은 2mL/min을 초과해서는 안 됩니다. 세척 후 컬럼은 분석을 위해 준비되었으며 제대로 처리하면 20\u201240 실행에 사용할수 있습니다. 그 후, 해상도는 연속적으로 감소합니다. 버퍼 A(>1 h)로 장시간 세척하고 2.6단계를 수행하면 열의 수명을 늘릴 수 있습니다. 해상도감소가 지속되면 열을 교환해야 합니다. 그라데이션은 특정 이노시톨 폴리인산염 종 사이의 분리를 증가시키고 전체 런타임을 감소시키기 위해 조정될 수 있다. 다른 HPLC 시스템(다른 보이드 볼륨 또는 모세혈관의 다른 부피)을 사용하면 보존 시간에 큰 영향을 미칩니다. 또한 열 변경 내용은 보존 시간에 약간의 영향을 미칩니다. “모의 실행”을 수행합니다. 추출된 샘플 대신 HPLC 시스템에 여과된 초순수 탈이온수를 주입하고 표준 그라데이션을 실행합니다. 분수를 수집할 필요가 없습니다.참고: 2.6단계는 선택 사항입니다. 그러나 다음 상황 중 하나가 적용되는 경우 수행해야 합니다. HPLC 시스템은 사전에 다른 방법에 사용되었습니다. HPLC 시스템은 3일 이상 사용되지 않았습니다. 이전 실행에 문제가 있었습니다. 3. 식물 재배 및 라벨[3H]-묘-이노시톨 참고: 다음 단계는 멸균 성분과 멸균 조건하에서 수행되어야 하며, 장갑을 착용하여 방사능 라벨로 인한 오염으로부터 손을 보호해야 합니다. 식물 매체, 특히 자당을 포함 하는 경우, 미생물 오염에 경향이 있다. A. 탈리아나 씨앗을 1.2%의 1.2%의 하이포염 나트륨으로 3분 간 살균한 후 3분 동안 70% 에탄올1mL이 3분 동안 살균합니다. 그런 다음 100% 에탄올 1mL을 추가하고, 에탄올이 있는 씨앗을 원형 필터 용지에 파이펫을 넣고 깨끗한 벤치에서 라미나르 플로우 아래에서 공기 건조를 할 수 있도록 합니다. L. japonicus 씨앗을 사용하는 경우, 충분한 발아 속도를 보장하기 위해 살균하기 전에 사포와 박격포와 스크럽 씨앗에 배치합니다. 반강도 무라시게와 스쿠그(MS) 염액으로 구성된 고체 성장 매체로 채워진 광장 페트리 접시에 아라비도시스 씨앗을 1~2줄로 뿌리고, 1% 자당, 0.7%의 젤란 껌을 KOH로 pH 5.7로 조정하여 최소 1일 동안 1일 동안 수평을 조절할 수 있도록 하였다. 연꽃 씨앗의 경우, 1행으로 뿌리고, 1회 1회에 곱한 페트리 접시에 1줄로 뿌리고, 용액의 물속의 세균성 화루0.8%로 구성된 고체 성장 매체로 채워져 어둠 속에서 4°C에서 적어도 3일 동안 단층화할 수 있도록 한다. 성장 인큐베이터 또는 기후 챔버에 수직으로 플레이트를 배치하고 짧은 조건하에서 10-12 일 동안 성장할 수 있도록 (22 ° C에서 8 h 빛, 20 °C에서 16 h 어두운). 10-20묘를 12m의 투명 평평한 바닥 세포 배양판으로 옮기고 1% 자당으로 보충하고 pH 5.7로 조정하였다. [3H]-묘-이노시톨(30-80 Ci/mmol, 90% 에탄올로 용해)의 45μCi를 넣고 부드러운 소용돌이로 섞는다.3myo 해당 뚜껑으로 접시를 덮고 미세 다공성 수술 용 테이프 (예 : 마이크로 포어 또는 류코포레 테이프)로 밀봉하여 성장 인큐베이터에 다시 배치하십시오.주의:[3H]는맨피부를 통해 흡입, 섭취 또는 흡수될 때 유해한 방사선 위험이 될 수 있는 저에너지 베타 방출기입니다. 방사성 물질과 직간접적으로 접촉하는 방사성 물질이나 장비를 취급할 때 항상 장갑을 착용하십시오. 또한 방사성 화학 물질의 안전한 취급에 대한 지역 규칙을 따릅니다 (예 : 추가 보호 복을 입고, 도지계 사용 및 정기적으로 오염을위한 표면 조사). 라벨링 5일 후, 미디어에서 모종을 제거하고 탈이온된 물로 간략하게 씻으시다. 종이 타월로 건조하고 1.5 mL 마이크로 센심 분리튜브로 옮김하십시오. 튜브를 과도하게 채우지 말고 100 mg FW/tube를 더 이상 배치하지 마십시오.참고: 식물 재료의 과잉 추출 과정에서 산을 희석 하 고 추출 효율을 강하게 감소 시킬 것 이다. 액체 질소에 튜브를 스냅 동결하고 추출 될 때까지 -80 °C에 보관하십시오.참고: 샘플 품질 저하 없이 몇 주 동안 -80°C에서 보관할 수 있습니다. 성장 조건(매체, 빛, 온도, 시간)은 특정 실험 또는 식물 종의 필요에 따라 수정될 수 있다. 그러나 정량화 가능한 SAX-HPLC가 좋은 품질을 실행하도록 하기 위해[3H]-myo-이노시톨을 희석할 때주의를 기울여야 합니다.myo 따라서, 여기에 명시된 [3H]-이노시톨 농도로 시작하여 원하는 경우 단계적으로 감소시키는 것이 좋습니다.3myo 라벨링 시간 동안 식물은 이러한 조건이 글로벌 InsP에 미치는 영향을 평가하기 위해 다양한 치료법(예: 환경 스트레스 또는 화학 물질)에 제출할 수 있습니다. 꾸준한 상태 라벨링에 도달하려면 최소 5일 동안 식물에 라벨을 붙이는 것이 좋습니다. 4. 용해성 InsPs 추출 참고: 전체 추출 과정에서 샘플과 시약을 얼음 위에 보관하십시오. 특히 연삭 중에 방사성 물질과의 접촉 위험이 높기 때문에 항상 장갑과 보호 안경을 착용하십시오. 시료와 접촉하는 모든 것은 방사성 폐기물로 간주되며 방사성 물질의 안전한 처리를 위해 현지 규칙에 따라 폐기되어야합니다. 2.1 단계에서추출 및 중화 버퍼에 대한 작업 솔루션을 준비합니다. 각 샘플은 600μL의 추출 버퍼와 400 μL의 중화 버퍼가 필요합니다. 버퍼를 얼음 위에 저장합니다. -80°C 냉동고에서 샘플을 가져 와서 추가 처리될 때까지 액체 질소에 보관하십시오. 시료를 미세원심분리기 튜브 유봉으로 갈아서 해동을 시작하고 얼음 냉기 추출 버퍼 500 μL을 추가합니다. 샘플이 완전히 균질화되고 용액이 깊은 녹색 색 (잎이 샘플에 있는 경우)이 될 때까지 연마를 계속합니다. 원심 분리는 ≥ 18000 x g에서 4 °C에서 10 분 동안 샘플을 원심 분리합니다. 상체를 신선한 1.5 mL 튜브로 옮기십시오. 추출에 사용되는 튜브는 고체 방사성 폐기물로 간주되며 그에 따라 폐기해야합니다. 추출에 300 μL의 중화 버퍼를 조심스럽게 추가합니다. 단백질과 버블링의 강수량은 즉시 시작됩니다. 1분 후 파이펫 팁으로 소용돌이치며 pH 용지(pH 6-9범위)에 소량(5 μL)을 파이프팅하기 전에 몇 초 동안 기다립니다. pH는 결국 pH 7과 8 사이여야 합니다. 필요한 경우 원하는 pH에 도달할 때까지 중화 버퍼 또는 추출 버퍼의 소량(일반적으로 10-20 μL)을 추가합니다. 샘플을 열린 뚜껑으로 1시간 이상 얼음 위에 놓아 둡시 다. 원심 분리기 는 ≥ 18,000 x g에서 4 °C에서 10 분 동안 샘플을 원심 분리합니다. 상체를 신선한 1.5 mL 튜브로 옮기십시오.참고: 샘플은 SAX-HPLC 런에서 직접 사용하거나 얼음에 보관하거나(같은 날 나중에 사용되는 경우) 액체 질소로 냉동되어 2\u20124 주 동안 -80°C에 보관할 수 있습니다. 높은 재현성과 비교성을 보장하기 위해, 액체 질소에 샘플을 5 분 동안 동결하는 것이 좋습니다, 그들은 나중에 직접 사용 될 경우에도. -80°C에서 추출된 시료의 장기 저장은 시료가 한 번만 해동되는 한 가능합니다. 동결된 샘플을 분석에 사용하는 경우 해동 후 파티클이 표시되지 않도록 합니다. 그렇지 않으면, 원심분리기는 ≥ 18,000 x g에서 4°C에서 10분 동안 다시 10분 동안 다시 18,000xg의 새로운 1.5mL 튜브로 상류부를 옮긴다. 5. HPLC 실행 수행 분수 수집기에게 96개의 작은 신경병 바이알(~6mL 용량)을 장착하고 각 유리병을 적절한 신자극 칵테일(예: 울티마-플로 AP 액체 신자극 칵테일)으로 채우고 pH및 높은 암모늄 인산염 농도(재료 표참조)를 완충제와 호환한다.참고: 바이알 수와 바이알 크기는 사용되는 분수 수집기 및 신경화 카운터에 따라 달라집니다. 여기에 설명된 그라데이션이 사용되는 경우, 전체 이노시톨 폴리인산염 프로파일을 얻기 위해, 적어도 처음 90분획을수집하는 것이 중요하다. 또한 분수 또는 샘플의 혼합을 방지하기 위해 모든 유리병과 각 뚜껑에 적절하게 라벨을 부착하십시오. HPLC 시스템/펌프를 시작하고 실행할 준비를 하십시오. 피스톤 씰 워시를 활성화하고 전체 실행 중에 활성화하십시오. 적절한 주사기를 사용하여 4.5 단계 (약 750 μL)에서 전체 상체를 수동으로 주입하여 샘플을 로드합니다 (재료 표참조). 자동 주입이 가능한 경우 샘플을 해당 시료 바이알로 이송합니다. 밸브를 “로드”에서 “주입” 위치로 돌리고 그라데이션과 분획 수집기를 시작합니다.참고: 사용되는 HPLC 시스템에 따라 시작 프로시저가 다를 수 있으며, 특히 이전 시스템(여기에 설명된 대로)과 소프트웨어 제어가 가능한 최신 모델을 비교할 때 시작 절차가 다를 수 있습니다. 그라데이션, 샘플 주입 및 분획 수집이 동시에 시작되도록 하는 것이 매우 중요합니다. HPLC 실행이 진행되는 동안 정기적으로 압력을 확인하십시오. 시작 압력은 약 18-24 bar (1.8-2.4 MPa)여야하며 100 % 버퍼 B에 도달하면 50-60 bar (5-6 MPa)로 천천히 상승해야합니다.주의: 압력이 감소하면 시스템의 누출을 나타낼 수 있으며 압력증가는 막힘을 나타낼 수 있습니다. 압력 변동(몇 초 만에 3bar ≥)은 시스템에 공기가 있음을 나타낼 수 있습니다. 열을 떠나는 모든 것뿐만 아니라 인젝터또는 그 이후에 발생하는 모든 누출은 방사성이라는것을 명심하십시오.참고: 압력은 HPLC 시스템에 따라 달라지며 여기에 명시된 것보다 낮거나 높을 수 있습니다. 약 15-20런 이후에 서서히 증가할 것입니다. 그러나 이것이 반드시 획득된 실행의 품질에 영향을 미치지는 않습니다. 달리기 후 바이알을 단단히 닫고 분획을 반짝이는 칵테일과 혼합하여 격렬한 흔들림으로 섞습니다. 측정을 직접 진행하거나 유리병을 똑바로 똑바로 세워 두십시오.참고: 반짝이는 칵테일과 혼합된 분수는 몇 주 동안 안정적이며 나중에 측정할 수 있습니다. 삼중수소의 반감기는 12.32 년이기 때문에 신호 손실은 무시할 수 있습니다. 하루의 마지막 샘플의 실행이 완료되면, 두 HPLC 펌프를 중지합니다. (선택 사항) 시스템의 수명을 높이려면, 특히 정기적으로 사용되지 않을 때, 버퍼 B의 모세관을 완충 A병으로 배치하여 펌프 B와 모세혈관을 세척하고 펌프를 10-15분 동안 실행하도록 하십시오. 다음 사용 전에 모세관을 버퍼 B로 교체하고 믹서에서 펌프 B를 분리하여 버퍼 B로 플러시해야 합니다. 펌프와 모세혈관이 버퍼 B로 다시 채워지면 믹서와 다시 연결하면 시스템이 사용할 준비가 되었습니다. 6. 분수 측정 바이알을 신경화 카운터 랙에 삽입하고 액체 반짝이 카운터에서 각 유리병을 5분 동안 측정합니다. 이상적으로는 작은 바이알에 직접 맞고 바이알에 더 큰(예: 20mL)에 매달려 계산 오류를 줄이는 랙을 사용하는 것이 이상적입니다. 이 프로토콜에 사용되는 소프트웨어 설정은 보충 도 1에표시됩니다.참고:[3H]표준을 사용하여 SNC(자체 정규화 및 교정) 프로토콜을 정기적으로 수행합니다. 더 짧은 계산 시간(1-5분)은 대기 시간을 줄일 수 있습니다. 그러나 높은 카운트 재현성과 정확성을 보장하기 위해 5 분 권장합니다. 7. 데이터 분석 scintillation 카운터에서 측정값을 스프레드시트 파일 또는 호환/컨버터블 파일 형식으로 내보냅니다. Excel 또는 유사한 소프트웨어가 장착된 컴퓨터와 Origin과 같은 적합한 분석 소프트웨어로 데이터를 평가합니다. 분당 측정된 카운트(cpm)가 보존 시간에 대해 플롯되는 2D 선 차트를 준비합니다(그림 1, 그림 2참조). 샘플을 서로 비교하려면 각 개별 샘플에 대해 각각 의 약품 분수에서 25~96분의 cpm을 합산하여 데이터를 정규화합니다.참고: 분 25는 비법인[3H]-myo-이노시톨, InsP1 및 InsPmyo2를 분석에서 제외하기 위한 컷오프로 사용되며, 이는 강하게 변동하는 경향이 있으며 잘 분리될 수 없으므로(적어도 이 프로토콜에서 제안된 그라데이션으로) 높은 활동으로 인해 정규화 계수를 강력하게 변경할 수 있다. 샘플에서 가장 낮은 총 cpm(분수 25\u201296)으로 모든 데이터를 샘플의 총 cpm(분수 25-96)으로 나누어 샘플로 모든 데이터를 정규화합니다(분수 25-96). 그런 다음 결과 계수를 사용하여 각 분획의 cpm을 계수와 곱하여 각 분수에서 cpm을 정규화할 수 있습니다.참고: 결국, 분 25에서 끝까지 cpm 값의 합계는 서로 비교된 모든 샘플에 대해 같아야 합니다. 정규화된 실행만 동일한 그래프/그림(실제 프로파일로 표시될 때)으로 표시되어야 합니다. 보충 도 2는 이러한 계산 단계가 어떻게 이루어지는지의 예를 보여 주며(단순화를 위해 두 샘플 중 25~35개 만 사용). 그러나 경우에 따라 데이터를 정규화할 필요는 없습니다. 예를 들어 7.4 단계에 따라 피크를 정량화하고 총 InsP 백분율로 표시되는 경우(그림 3D에도시됨). 앞서 언급했듯이, 여러 분석을 프로파일로 나란히 제시하거나, 실제 측정된 활성이 결론에 사용될 때(예를 들어, 치료 a)는 대조군대비 InsP7 x% 증가하며, 두 샘플 중 InsP7의 cpm 값을 참조하고 총 InsPs의 백분율이 아닌 정규화가 필요합니다. 표지 효율에 대한 유전자형 또는 치료 차이의 효과를 분석하기 위해서는 이러한 차이를 무효화하기 때문에 정상화하지 않는 것이 중요합니다. 그러나, 이 프로토콜을 이용한 추출 효율은 여러 가지 이유로 가변적일 수 있고, 동일한 유전자형 및 치료의 복제본을 분석할 때도 관찰되기 때문에 이 방법을 이용한 절대정량화가 어렵다. 분석에 사용되는 HPLC 시스템, 열 및 그라데이션에 따라 컷오프를 변경해야 할 수 있습니다. 특정 이노시톨 폴리포산염 피크의 상대적 정량화를 수행하고 통계 분석을 위한 복제 데이터를 포함하는 막대 그래프를 생성하기 위해 크로마토그램의 피크 영역(예: Origin)을 계산할 수 있는 특수 소프트웨어를 사용하여 분석을 계속합니다. 보충 그림 3을참조하십시오.참고: 소프트웨어 제어되는 대부분의 HPLC 시스템은 이 작업을 수행할 수 있는 각 소프트웨어와 함께 제공됩니다. 피크는 배경 위의 cpm 값(실행 간에 일정 정도 달라짐)과 이전에 게시된 데이터와 유사한 보존 시간의 분수로 결정됩니다. 특정 피크의 보존 시간은 스프레드시트 소프트웨어(예: Excel)에서 결정되며 명확한 일체 계산(예: Origin)을 계산하기 위해 피크를 할당하는 데 사용됩니다. 보충 도 3은 피크 결정, 배경 뺄셈 및 피크의 통합이 과정을 보여줍니다.

Representative Results

여기에 표시된 결과는 기술적 및 생물학적 수준에서의 변이에 따라 얻은 가능한 결과를 설명하는 것을 목표로합니다. 첫 번째는 새로운 대 숙성 컬럼(도1)과저장된 샘플(도3)을이용한 분석에 의해 예시되며, 두 번째 식물 시스템인 A. 탈리아나(도 1,도 3)및 L. japonicus(그림 2)에서추출한 추출물을 평가하여 두 번째. 최적의 SAX-HPLC 실행은 도 1A\u2012C에묘사되며, 이는 신자극 계산 후 A. 탈리아나 추출물로부터 얻은 완전한 이노시톨 폴리인산염 스펙트럼을 보여줍니다. 피크는 잘 분리되어 있으며 이전5,,7에설명된 크로마토그래픽 동원을 기반으로 다른 이소머(또는 enantiomer-pairs)에 할당할 수 있습니다. 도 2는 아라비도시스 모종과 동일한 조건하에서 재배되고 표지된 L. japonicus 묘목의 SAX-HPLC 분석의 대표적인 결과를 나타낸다. 아마도 모든 InsP 종과 애기독증에서 알려진 피크를 볼 수 있지만, 두 종의 프로파일을 비교할 때 특정 InsP isomers의 상대적 (예 : isomers 사이의 비율) 양에 관한 상당한 차이가 있습니다. 예를 들어, 로터스 추출물은 추가 조사를 위한 여지를 남기는 애비독증에 비해 InsP3c,InsP4b,InsP5b 및 InsP3a,InsP4a,InsP5c 감소를 보였다.5c 도 2D는 애비도시스와 연꽃사이의 InsP 이소머스 사이의 서로 다른 비율을 보여줍니다. 도 3은 추출 후 분할된 샘플의 두 개의 InsP 프로파일을 나타낸다. 상반기는 -80°C에서 저장한 후 하루 뒤, 곧바로 분석되었다. 다른 샘플(예: 그림 3A\u2012C및 그림 3D의검은색 및 빨간색 선)사이에는 사소한 차이점만 관찰됩니다. 이는 하나의 동결 해동 주기가 샘플에 해를 끼치지 않으며 메서드 자체가 재현 가능한 결과를 생성한다는 것을 보여줍니다. 그림 1: 이 프로토콜을 통해 수행된 성공적인 SAX-HPLC 분석의 일반적인 InsP 프로파일입니다. (a\u2012C) SAX-HPLC 프로파일17일 야생형(Col-0)0 아라비도시스 모종은 [3H]-근시-이노시톨로 표지되었다.3myo 같은 날 글로벌 InsP 추출 및 SAX-HPLC 실행이 수행되었습니다. (A)전체 스펙트럼; (B, C) A에 표시된 프로파일의 확대/축소. 보이는 모든 피크가 강조 표시되고 해당 InsP 종에 할당됩니다. 공시된 크로마토그래피 동원5,7,7InsP4a 가능성이 Ins(1,4,5,6)P4 또는 Ins(3,4,5,6)P4,InsP5a는 InsP5 [2-OH]를 나타낸다. InsP5b는 InsP5 [4-OH] 또는 그 내항형 인SP5 [6-OH]를 나타내며, InsP5c는 InsP5 [1-OH] 또는 그 내황형태 InsP5 [3-OH]를 나타낸다. InsP3a-c,InsP4b,InsP7및 InsP8의 이성질은 아직 알려지지 않았습니다. 패널(D)은동일하게 재배 된 식물의 SAX-HPLC 프로파일을 보여 주지만 숙성 된 기둥 (>40 실행)을 사용합니다. 다른 InsP 종에 비해 InsP6의 명확한 감소및 PP-InsP의 부재가 눈에 띈다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 2: L. japonicus 식물의 대표 InsP 프로파일. SAX-HPLC 프로파일 (A\u2012C)17 일 된 야생 형 (Gifu)A L. japonicus 묘목[3H]-myo-이노시톨로 무선 라벨.myo (A)전체 스펙트럼; (B, C) A에 표시된 프로파일의 확대/축소. 보이는 모든 피크가 강조 표시되고 해당 InsP 종에 할당됩니다. 공시된 크로마토그래피 동원5,7,7InsP4a 가능성이 Ins(1,4,5,6)P4 또는 Ins(3,4,5,6)P4,InsP 5b를 나타내며, InsP5b는 InsP5 [4-OH] 또는 그 내포성 형태 InsP5 [6-OH]를 나타낸다. 및 InsP5c는 InsP5 [1-OH] 또는 그 내포성 형태 InsP5 [3-OH]를 나타냅니다. InsP3a-c,InsP4b,InsP7및 InsP8의 이성질은 알 수 없습니다. (D) A. 탈리아나의 개별 InsP 종(용출 25\u201296으로부터의 총 활동의 %)과 L. japonicus (그림 2A-C의데이터)를 비교합니다.A‒C 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 3: SAX-HPLC 분석의 재현성을 보여주는 분할 샘플의 InsP 프로파일. (a\u2012C) SAX-HPLC 프로파일17일 야생형(Col-0) 아라비도시스 모종은[3H]-근시-이노시톨로표지되었다.0myo 실행 전에, 샘플은 -80 °C에서 저장 후 즉시 반 실행 및 다른 반나절 을 분할했다(A)전체 스펙트럼; (B, C) A에 표시된 프로파일의 확대/축소. 보이는 모든 피크가 강조 표시되고 해당 InsP 종에 할당됩니다. 공시된 크로마토그래피 동원5,7,7InsP4a 가능성이 Ins(1,4,5,6)P4 또는 Ins(3,4,5,6)P4,InsP5a는 InsP5 [2-OH]를 나타낸다. InsP5a는 InsP5 [2-OH]를 나타내며, InsP5b는 InsP5 [4-OH] 또는 그 내포성 형태 InsP5 [6-OH]를 나타내며, InsP5c는 InsP5 [1-OH] 또는 그 내포성 형태 InsP5 [3-OH]를 나타낸다. InsP3a-c,InsP4b,InsP7및 InsP8의 이성질은 아직 알려지지 않았습니다. 패널 D는 InsP6 및 PP-InsP InsPInsP 7 및 InsP8의 정량화를 모두 실행합니다. 값은 양(에서%)을 나타냅니다. 모든 InsP에 비해 각각의 InsP 종 (용출 25-96에서의 총 활성). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 보충 도 1: 빛 반짝이 카운터를 사용하여 액체 신화 계수에 대한 소프트웨어 설정. 소프트웨어 버전을 보여주는 스크린샷과 이 프로토콜로 수행된[3H]샘플의 신경 계산에 사용되는 설정이 묘사됩니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 추가 그림 2: 데이터 정규화의 대표적인 예입니다. 워크시트의 스크린샷에는 SAX-HPLC를 정규화하는 데 사용되는 모든 단계와 수식이 서로 실행됩니다. 단순화를 위해 샘플의 분수 25-35만 표시됩니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 보충 도 3: 분석 소프트웨어를 사용하여 피크 결정, 배경 뺄셈 및 통합. (A)SAX-HPLC 분석의 데이터가 소프트웨어(분 28-96)에 로드되고 피크 분석기 도구가 선택된다. (B\u2012E) 기준선은 개별 피크와 배경 사이의 점을 설정하여 수동으로 정의됩니다. (F)봉우리모양에 따라 수동으로 결정되며, 공표된 크로마토그래피 동원5,,7. (G)피크 범위는 cpm 값에 의해 수동으로 정의됩니다. (H)피크는 통합되어 모든 피크의 %로 계산됩니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

여기서 는 식물 추출물에 PP-InsP를 포함한 InsP를 정량화하고이 방법을 확립하는 방법에 대한 실용적인 팁을 제공하는 다재다능하고 민감한 방법을 제시합니다. 프로토콜은 일반적으로 강력하더라도 최적이 아닌 실행 및 분석이 발생할 수 있습니다. 대부분의 경우, 이러한 실행은 높은 인광염, 특히 PP-InsP 종 InsP₇ 및 InsP_8의강력한 감소 또는 완전한 손실에 의해 식별될 수 있다. 가능한 이유는 식물 물질의 미생물 오염및 추출 버퍼와 즉시 접촉하지 않을 식물 재료의 부족한 분쇄 및 해동으로 인해 추출 하는 동안 내인성 식물 PP-InsP 하이드로라의 불충분 한 비활성화 될 수 있습니다. 또 다른 이유로는 중화 버퍼의 불충분하거나 과도한 첨가에 의한 부정확한 pH 조정, 또는 단순히 불충분한 샘플 재료가 포함됩니다. 후자는 PP-InsP를 검출하는 것을 어렵게 만들 수 있습니다, 그 세포에 있는 아주 낮은 양에 수시로 존재하기 때문에. 3.5단계에서 시료 재료의 과잉 또는 비효율적인 건조는 과염소산의 희석을 유발할 수 있으므로 효소 비활성화가 불충분하고 InsP₆ 및 PP-InsPs의 특정 손실을 초래할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 식물 재료의 양과 무선 라벨은 비용과 성능에 따라 최적화되었으며, 따라서 최적의 결과를 제공하기에 충분한 최저 양에 가깝습니다. 또한 컬럼 수지는 해상도 용량을 점차 느슨하게 합니다. 이 과정의 첫 징후는 (저자에게 완전히 명확하지 않은 이유로) HPLC 스펙트럼의 PP-InsPs와 같은 더 높은 인인SP 종의 특정 손실입니다. 추가 노화와 함께, 심지어 InsP_6은 열(그림 1D)에의해 제대로 해결되지 않습니다. 따라서 적절한 컬럼의 사용과 샘플링의 세심한 처리 및 HPLC 구성 요소의 적절한 유지 보수는 정확한 결과를 보장하는 데 매우 중요합니다.

특히 다른 장비(예: HPLC 시스템 및 열)로 생성되거나 다른 날에 시료를 서로 정규화하고(7.3단계에서 설명한 대로)로 생성되는 경우 샘플과 실행을 비교할 때 동일한 방식으로 샘플을 분석하는 것이 중요합니다. 정규화를 통해서만 동일한그래프(그림 3)에여러 샘플을 표시할 수 있고 정확합니다. 총 InsP 또는 다른 특정 InsP 종에 비해 개별 InsP의 정량화의 경우 상대값만 표시되고 절대 값이 표시되지 않는 한 정규화할 필요가 없습니다. 이상적으로는 InsP 프로파일과 정량화가 모두 표시됩니다. 그러나 경우에 따라 동일한 그래프에서 두 개 이상의 실행을 적절하게 표시할 수 없습니다. 서로 다른 보존 시간 또는 다양한 배경 활동 수준으로 인해 정량화되지 않은 SAX-HPLC 프로파일을 단독으로 비교하기가 어려울 수 있습니다. 많은 샘플을 비교해야 할 때도 마찬가지입니다. 이러한 경우 개별 피크 정량화에 대한 추가 소프트웨어(예: Origin)를 사용하여 추가 평가가 필요합니다.

저자는 여기에 설명된 프로토콜이 최적화될 수 있고 각 개별 연구 질문에 적응해야 한다는 것을 알고 있습니다. 이 프로토콜에서 애기장염 추출물^7,^,^17에 최적화되어 있지만, 이 방법은 다재다능하며 다른 식물 종의 InsP 프로파일을 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기서 우리는 라벨링 조건, InsP 추출 또는 SAX-HPLC 실행(그림 2)의수정이 필요하지 않은 L. japonicus에대한 InsP 프로파일을 처음으로 제시함으로써 이러한 가능성을 예시합니다. 특히, 전반적으로 유사하면서도 L. japonicus와 Arabidopsis InsP 프로필 사이에 차이가 관찰됩니다. 예를 들어, L. japonicus InsP₅ [4-OH] 또는 그 내포성 형태 InsP₅ [6-OH]는 InsP₅ [1-OH] 또는 그 내항형 인P5 [3-OH]보다 더 풍부하며, 여기서 InsP₅ [1-OH] 또는 그 내란성_형태인 5P-5P.에 있다.₅ Arabidopsis₅ 마찬가지로, 우리는 미디어 조성물의 변화,^[3H]-myo-이노시톨 농도, 식물 연령, 환경 조건(예를 들어, 빛 및 온도), 화학 화합물의 첨가 또는 다른 요인들 간의 식물-미생물 상호 작용의 분석, 테스트 및 적응이 필요할 수 있습니다.myo

고려해야 할 이 방법의 한 가지 중요한 단점은 라벨링이 대부분의 육상 식물에 대한 생리적 환경을 나타내지 않는 (멸균) 액체 배양에서 수행된다는 것입니다. 또한,[³H]-myo-이노시톨의높은 비용으로 인해 라벨링 용액의 부피와 배양 용기의 크기가 일반적으로 제한되어 있어 사용될 수 있는 식물의 크기도 제한한다. 액체 배양에서의 재배는 토양 재배 식물의 예를 들어 직접 침투하여 [³H]-myo-이노시톨과 그 이후에 여기에 설명된 프로토콜을 따르므로, 이전에 보고된^10과같이 피할 수 있다.myo

TiO₂ 풀다운과 같은 대체 방법에 비해 이 프로토콜의 몇 가지 단점이 있으며 PAGE 또는 질량 분석 기반 기술이 뒤따릅니다. [3H]-myo-이노시톨 라벨링으로 인해, 방사성표지근에서 직접 유래한 InsP 종만이 결국 검출될 것이다.³myo myo 여기에 설명된 방법은 특정^{식물(44)에서}확인된 실로-이노시톨 및 기타 이좀러와 같은 다른 Ins isomers에 눈이 멀다. scyllo 더욱이, 다른 경로로부터 유래된⁴⁵myo-InsPs는 myo포도당-6-인산염의 이소성화를 통해 미오-이노시톨-3-인산염의 드노보 합성에 의해 합성된 것을 포함하여 제외될 것이다, 묘 -이노시톨-3-포산염시네페이트 시파테에 의해 촉매화된다. myo myo [32 P] 또는^[33P]-오르토-인산염이 대체 라벨로 사용될 수 있지만, 풍부한 뉴클레오티드 및 그 유도체를 포함한 모든 인산염 함유 분자가 표지될 것이기 때문에 이들의 사용은 큰 단점을 야기한다.³³ortho 이러한 분자는 또한 이 프로토콜로 추출하고 SAX 컬럼에 결합하여 개별 InsP 피크^5의식별을 방해하는 높은 수준의 배경 활동을 초래할 수 있습니다. 또한,^[32P]-또는^[33P] -라벨Inps 및 PP-InsP의 정량화는 인산염 및 파이로포스페이트 잡화 회전율에 의해 강하게 영향을 받을 수 있으며 이노시톨 종에 대한 대량 판독을 보고하지 않을 수 있다.

한편,^【3H】-myo-이노시톨은 특별히 묘-이노시톨함유 분자를 라벨링한다.myo InsPs, 이노시톨 함유 지질, 인포이노시티드 및 갈락티놀은 이 경우 표지되어 있습니다. 그러나 지질이 추출 버퍼에서 불용성이고 갈락티놀이 SAX 열에 결합되지 않기 때문에 InsPs만 이 프로토콜로 분석됩니다.

지금까지,₂ [3H]-Myo-이노시톨³라벨링에myo의해 생성된 식물 InsP 프로파일의 차이는 TiO 2 풀다운/PAGE에 의해 결정된 것과 비교하여 식물에서 수행되지 않았기 때문에 알려지지 않은 채로 남아 있다. 동물 세포에 있는 최근 연구 결과는 이 질문^46를해결했습니다. 그 일에서,^[3H]-이노시톨라벨링에 의해 보이지 않는 InsP_6의 풀은, 따라서 포도당-6-인산염에서 직접 파생되어야 한다, 포유동물 세포주의 PAGE 젤과 SAX-HPLC 프로파일을 비교하여 확인되었다. 24h의 인산염 기아는 TiO₂ 풀다운을 사용하여 정제된 InsPs의 PAGE 젤을 정량화할 때 InsP_6의 150% 증가를 초래하였다. [3H]-이노시톨³표지 세포의myoSAX-HPLC 분석은 동일하게 처리된^[3H]-InsP_6의15% 증가를 보였다. 앞서 언급했듯이 InsP_5보다 낮은 InsP는 대부분의 경우 PAGE 분석을 통해 감지할 수 없습니다. SAX-HPLC 다음에 이어 방사성 라벨링은 질량 분광 프로토콜이 매우 음전하 분자의 이 그룹을 검출하도록 최적화되지 않는 한 선택되는 방법인 것으로 보입니다.

또 다른 과제는 SAX-HPLC 분석(또는 InsP 분석을 위한 다른 방법)에서 enantiomers를^{구별하는 것입니다(또는}InsP 분석을 위한 다른 방법)^10,¹⁷. 이러한 과제는 각각의 상란성 분자와 상호 작용하는 L-아르기닌 아마이드와 같은 키랄 셀렉터, 즉 엔안티오퓨어 화합물을 첨가하여^10을분리할 수 있는 다이아스테레오메릭 복합체를 형성함으로써 해결할 수 있다. 우리의 지식에, 이 방법은 NMR 분석^10에의해 enantiomeric InsP₅ isomers InsP₅[1-OH] 및 InsP₅ [3-OH]를 구별하기 위해 구현되었습니다. 다른 내포성 쌍의 차별 또는 chiral SAX-HPLC 분석 또는 키랄 페이지 기반 방법에 의한 enantiomers의 성공적인 차별은 아직 보고되지 않았으며 더 발전되어야합니다. 인 가용성에 의한 PP-InsPs의 보존된 합성 및 보존된 규제를 고려하여, 특히 페이지 나 MS 기반 방법과 같은 비방사성 방법, 영양 분석과 함께 작물^17,^,^18,^,^24,^25의영양 결핍을 진단하도록 설계된 원격 감지 데이터를 교정하기 위한 지상 진실 노력에 도움이 될 것으로^{구상됩니다.} 그러나, 여기에 제시 된 방법은 현재 여전히 InsP 분석을위한 금 본위제로 간주 될 수 있으며 식물에서 이러한 흥미로운 메신저의 새로운 기능을 발견하는 데 도움이 될 것입니다.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 독일의 우수 전략 – EXC-2070 – 390732324 (페노롭), 연구 교육 그룹 GRK2064 및 개별 연구 보조금 SCHA1274/4-1 및 SCHA1274/SCHA1274/SCHA1274/SCHA1274/SCHA1274/SCHA1274/SCHA1274/SCHA1274/SCHA1274/SCHA1274/5.1.에 의해 지원되었다. 우리는 또한 기술 지원을 리 슐뤼터와 브리기테 우에베르바흐에게 감사드립니다.

Materials

Centrifuge	Eppendorf AG	model: 5430 R
Diammonium hydrogen phosphate, ≥97 %	Carl Roth GmbH + Co. KG	0268.1
Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate, ≥99 %, p.a., ACS	Carl Roth GmbH + Co. KG	8043.2
Falcon 12-well clear flat bottom TC-treated multiwell cell culture plate, with lid, individually wrapped, sterile	Corning Inc.	353043
Fraction collector	LAMBDA Instruments GmbH	model: OMNICOLL single channel collector
Growth incubator	poly klima GmbH	model: PK 520-LED
HPLC pumps	Kontron Instruments	model: 420
HPLC syringe for Rheodyne valves, 1 mL	Hamilton Company	81365
Injector for HPLC	Supelco	model: Rheodyne 9725
Inositol, myo-[1,2-3H(N)]	American Radiolabeled Chemicals Inc.	ART 0261
Liquid nitrogen	University, Chemistry Department
Liquid scintillation counter	PerkinElmer Inc	model: TRI-CARB 2900TR
Micro pestle	Carl Roth GmbH + Co. KG	CXH7.1
Mixed cellulose Eester filter, ME range (ME 24), plain, 0.2 µm pore size, 47 mm circle	GE Healthcare Life Sciences	10401770
Mixer for HPLC	Kontron Instruments	model: M 800
Murashige & Skoog medium, salt mixture	Duchefa Biochemie	M0221
OriginPro software	OriginLab Corp.
Orthophosphoric acid, ≥85 %, p.a., ISO	Carl Roth GmbH + Co. KG	6366.1
Partisphere 5 µm SAX cartridge column, 125 x 4.6 mm	Hichrom Limited	4621-0505
Perchloric acid, 70 %, 99.999 % trace metals basis	Sigma-Aldrich	311421
Petri dish, square, PS, clear, 120/120/17 mm, sterile	Greiner Bio One International GmbH	688161
pH-indicator paper pH 5.5 – 9.0, Neutralit	Merck KGaA	109564
Phytagel	Sigma-Aldrich	P8169
Potassium carbonate	Carl Roth GmbH + Co. KG	P743.2
Safe-Lock tubes, 1.5 mL	Eppendorf AG	30120086
Sample loop for 9725 injectors, volume 2 mL, PEEK	Supelco	57648
SNAPTWIST scintillation vial, 6.5 mL	Simport Scientific Inc.	S207-5
Sterile bench	LaboGene	model: ScanLaf MARS 900
Sucrose, ≥99,5 %, p.a.	Carl Roth GmbH + Co. KG	4621.1
Ultima-Flo AP liquid scintillation cocktail	PerkinElmer Inc	6013599
Ultra-pure deionized water	Milli-Q
Wrenchless WVS End Fitting Kit	Hichrom Limited	4631-1001

References

Berridge, M. J., Irvine, R. F. Inositol Phosphates and Cell Signaling. Nature. 341 (6239), 197-205 (1989).
Streb, H., Irvine, R. F., Berridge, M. J., Schulz, I. Release of Ca-2+ from a Nonmitochondrial Intracellular Store in Pancreatic Acinar-Cells by Inositol-1,4,5-Trisphosphate. Nature. 306 (5938), 67-69 (1983).
Krinke, O., Novotna, Z., Valentova, O., Martinec, J. Inositol trisphosphate receptor in higher plants: is it real. Journal of Experimental Botany. 58 (3), 361-376 (2007).
Kuo, H. F., et al. Arabidopsis inositol pentakisphosphate 2-kinase, AtIPK1, is required for growth and modulates phosphate homeostasis at the transcriptional level. Plant Journal. 80 (3), 503-515 (2014).
Kuo, H. F., et al. Arabidopsis inositol phosphate kinases IPK1 and ITPK1 constitute a metabolic pathway in maintaining phosphate homeostasis. Plant Journal. 95 (4), 613-630 (2018).
Gillaspy, G. E., Capelluto, D. G. S. . Lipid-mediated Protein Signaling. , 141-157 (2013).
Stevenson-Paulik, J., Bastidas, R. J., Chiou, S. T., Frye, R. A., York, J. D. Generation of phytate-free seeds in Arabidopsis through disruption of inositol polyphosphate kinases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (35), 12612-12617 (2005).
Lemtiri-Chlieh, F., MacRobbie, E. A. C., Brearley, C. A. Inositol hexakisphosphate is a physiological signal regulating the K+-inward rectifying conductance in guard cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (15), 8687-8692 (2000).
Lee, H. S., et al. InsP6-sensitive variants of the Gle1 mRNA export factor rescue growth and fertility defects of the ipk1 low-phytic-acid mutation in Arabidopsis. Plant Cell. 27 (2), 417-431 (2015).
Blüher, D., et al. A 1-phytase type III effector interferes with plant hormone signaling. Nature Communications. 8, (2017).
Murphy, A. M., Otto, B., Brearley, C. A., Carr, J. P., Hanke, D. E. A role for inositol hexakisphosphate in the maintenance of basal resistance to plant pathogens. Plant Journal. 56 (4), 638-652 (2008).
Poon, J. S. Y., Le Fevre, R. E., Carr, J. P., Hanke, D. E., Murphy, A. M. Inositol hexakisphosphate biosynthesis underpins PAMP-triggered immunity to Pseudomonas syringae pv. tomato in Arabidopsis thaliana but is dispensable for establishment of systemic acquired resistance. Molecular Plant Pathology. 21 (3), 376-387 (2020).
Wild, R., et al. Control of eukaryotic phosphate homeostasis by inositol polyphosphate sensor domains. Science. 352 (6288), 986-990 (2016).
Shears, S. B. Inositol pyrophosphates: Why so many phosphates. Advances in Biological Regulation. 57, 203-216 (2015).
Shears, S. B. Intimate connections: Inositol pyrophosphates at the interface of metabolic regulation and cell signaling. Journal of Cellular Physiology. 233 (3), 1897-1912 (2018).
Desai, M., et al. Two inositol hexakisphosphate kinases drive inositol pyrophosphate synthesis in plants. Plant Journal. 80 (4), 642-653 (2014).
Laha, D., et al. VIH2 Regulates the Synthesis of Inositol Pyrophosphate InsP8 and Jasmonate-Dependent Defenses in Arabidopsis. Plant Cell. 27 (4), 1082-1097 (2015).
Laha, D., et al. Arabidopsis ITPK1 and ITPK2 Have an Evolutionarily Conserved Phytic Acid Kinase Activity. Acs Chemical Biology. 14 (10), 2127-2133 (2019).
Dorsch, J. A., et al. Seed phosphorus and inositol phosphate phenotype of barley low phytic acid genotypes. Phytochemistry. 62 (5), 691-706 (2003).
Flores, S., Smart, C. C. Abscisic acid-induced changes in inositol metabolism in Spirodela polyrrhiza. Planta. 211 (6), 823-832 (2000).
Brearley, C. A., Hanke, D. E. Inositol phosphates in barley (Hordeum vulgare L) aleurone tissue are stereochemically similar to the products of breakdown of InsP(6) in vitro by wheat-bran phytase. Biochemical Journal. 318, 279-286 (1996).
Laha, N. P., et al. ITPK1-Dependent Inositol Polyphosphates Regulate Auxin Responses in Arabidopsis thaliana. bioRxiv. , (2020).
Laha, D., et al. Inositol Polyphosphate Binding Specificity of the Jasmonate Receptor Complex. Plant Physiology. 171 (4), 2364-2370 (2016).
Dong, J. S., et al. Inositol Pyrophosphate InsP(8) Acts as an Intracellular Phosphate Signal in Arabidopsis. Molecular Plant. 12 (11), 1463-1473 (2019).
Zhu, J., et al. Two bifunctional inositol pyrophosphate kinases/phosphatases control plant phosphate homeostasis. Elife. 8, (2019).
Couso, I., et al. Synergism between Inositol Polyphosphates and TOR Kinase Signaling in Nutrient Sensing, Growth Control, and Lipid Metabolism in Chlamydomonas. Plant Cell. 28 (9), 2026-2042 (2016).
Ito, M., et al. Hydrophilic interaction liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the quantitative analysis of mammalian-derived inositol poly/pyrophosphates. Journal of Chromatography A. 1573, 87-97 (2018).
Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Inositol Phosphates Purification Using Titanium Dioxide Beads. Bio-Protocol. 8 (15), (2018).
Loss, O., Azevedo, C., Szijgyarto, Z., Bosch, D., Saiardi, A. Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates. Jove-Journal of Visualized Experiments. (55), e3027 (2011).
Harmel, R. K., et al. Harnessing C-13-labeled myo-inositol to interrogate inositol phosphate messengers by NMR Electronic supplementary information (ESI) available. Chemical Science. 10 (20), 5267-5274 (2019).
Azevedo, C., Saiardi, A. Extraction and analysis of soluble inositol polyphosphates from yeast. Nature Protocols. 1 (5), 2416-2422 (2006).
Shears, S. B., Miller, G. J. . Inositol Phosphates: Methods and Protocols. , 1-28 (2020).
Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Importance of Radioactive Labelling to Elucidate Inositol Polyphosphate Signalling. Topics in Current Chemistry. 375 (1), (2017).
Stevenson-Paulik, J., et al. Inositol phosphate metabolomics: Merging genetic perturbation with modernized radiolabeling methods. Methods. 39 (2), 112-121 (2006).
Liu, C., Riley, A. M., Yang, X., Shears, S. B., Potter, B. V. L. Synthesis and Biological Activity of d- and l-chiro-Inositol 2,3,4,5-Tetrakisphosphate: Design of a Novel and Potent Inhibitor of Ins(3,4,5,6)P4 1-Kinase/Ins(1,3,4)P3 5/6-Kinase. Journal of Medicinal Chemistry. 44 (18), 2984-2989 (2001).
Hughes, P. J., Hughes, A. R., Putney, J. W., Shears, S. B. The regulation of the phosphorylation of inositol 1,3,4-trisphosphate in cell-free preparations and its relevance to the formation of inositol 1,3,4,6-tetrakisphosphate in agonist-stimulated rat parotid acinar cells. Journal of Biological Chemistry. 264 (33), 19871-19878 (1989).
Shears, S. B., Kirk, C. J., Michell, R. H. The pathway of myo-inositol 1,3,4-trisphosphate dephosphorylation in liver. The Biochemical journal. 248 (3), 977-980 (1987).
Stevenson-Paulik, J., Odom, A. R., York, J. D. Molecular and Biochemical Characterization of Two Plant Inositol Polyphosphate 6-/3-/5-Kinases. Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42711-42718 (2002).
Stephens, L. R., Hawkins, P. T., Downes, C. P. An analysis of myo-[3H]inositol trisphosphates found in myo-[3H]inositol prelabelled avian erythrocytes. The Biochemical journal. 262 (3), 727-737 (1989).
Saiardi, A., et al. Mammalian inositol polyphosphate multikinase synthesizes inositol 1,4,5-trisphosphate and an inositol pyrophosphate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (5), 2306 (2001).
Azevedo, C., Burton, A., Bennett, M., Onnebo, S. M. N., Saiardi, A., Barker, C. J. . Inositol Phosphates and Lipids: Methods and Protocols. , 73-85 (2010).
Saiardi, A., Caffrey, J. J., Snyder, S. H., Shears, S. B. The Inositol Hexakisphosphate Kinase Family: CATALYTIC FLEXIBILITY AND FUNCTION IN YEAST VACUOLE BIOGENESIS. Journal of Biological Chemistry. 275 (32), 24686-24692 (2000).
Brearley, C. A., Hanke, D. E. Inositol phosphates in the duckweed Spirodela polyrhiza L. Biochemical Journal. 314, 215-225 (1996).
Pollard, J. K., Steward, F. C., Shantz, E. M. Hexitols in Coconut Milk – Their Role in Nurture of Dividing Cells. Plant Physiology. 36 (4), 492 (1961).
Donahue, J. L., et al. The Arabidopsis thaliana Myo-inositol 1-phosphate synthase1 gene is required for Myo-inositol synthesis and suppression of cell death. Plant Cell. 22 (3), 888-903 (2010).
Desfougeres, Y., Wilson, M. S. C., Laha, D., Miller, G. J., Saiardi, A. ITPK1 mediates the lipid-independent synthesis of inositol phosphates controlled by metabolism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (49), 24551-24561 (2019).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Gaugler, P., Gaugler, V., Kamleitner, M., Schaaf, G. Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC. J. Vis. Exp. (160), e61495, doi:10.3791/61495 (2020).

SAX-HPLC를 사용하여 다른 식물 종에서 용해성, 방사성 라벨이 붙은 이노시톨 폴리인산염의 추출 및 정량화

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Tags

Play Video

Cite This Article

View Video

SAX-HPLC를 사용하여 다른 식물 종에서 용해성, 방사성 라벨이 붙은 이노시톨 폴리인산염의 추출 및 정량화

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Tags

Play Video

Cite This Article

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below