JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생화학

Extractie en kwantificering van oplosbare, radiogelabelde Inositol Polyfosfaten van verschillende plantensoorten met SAX-HPLC

Published: June 26, 2020
doi:
10.3791/61495
, , ,
1Department of Plant Nutrition, Institute of Crop Science and Resource Conservation,University of Bonn

Summary

Hier beschrijven we sterke anion uitwisseling high-performance vloeibare chromatografie van [3H]-myo-inositol-gelabelde zaailingen die een zeer gevoelige methode is om inositol polyfosfaten in planten te detecteren en te kwantificeren.

Abstract

De fosfaatesters van myo-inositol, ook wel inositolfosfaten (InsP’s) genoemd, zijn een klasse van cellulaire regelgevers die een belangrijke rol spelen in de plantenfysiologie. myo Vanwege hun negatieve lading, lage overvloed en gevoeligheid voor hydrolytische activiteiten, is de detectie en kwantificering van deze moleculen een uitdaging. Dit is met name het geval voor sterk fosforyleerde vormen die diphospho-bindingen met “hoogenergetische” bevatten, ook wel inositol pyrofosfaten (PP-InsPs) genoemd. Vanwege de hoge gevoeligheid is sterke anionuitwisseling high-performance vloeibare chromatografie (SAX-HPLC) van planten gelabeld met [3H]-myo-inositol momenteel de methode bij uitstek om deze moleculen te analyseren. Door [3H]-myo-inositol te gebruiken voor radiolabel plantenzaailingen, kunnen verschillende InsP-soorten, waaronder verschillende niet-enantiomereïsche isomeren, met hoge gevoeligheid worden gedetecteerd en gediscrimineerd. Hier wordt de opzet van een geschikt SAX-HPLC-systeem beschreven, evenals de volledige workflow van plantenteelt, radiolabeling en InsP-extractie tot de SAX-HPLC-run en de daaropvolgende data-analyse. Het hier gepresenteerde protocol maakt de discriminatie en kwantificering van verschillende InsP-soorten mogelijk, waaronder verschillende niet-enantiomeree isomeren en van de PP-InsP’s, InsP7 en InsP8, en kan gemakkelijk worden aangepast aan andere plantensoorten. Als voorbeelden worden SAX-HPLC analyses van Arabidopsis thaliana en Lotus japonicus zaailingen uitgevoerd en worden complete InsP profielen gepresenteerd en besproken. De hier beschreven methode is een veelbelovend instrument om de biologische rol van InsP’s in planten beter te begrijpen.

Introduction

Bijna vier decennia geleden, inositol fosfaten (InsP’s) naar voren als signalering moleculen, na Ins(1,4,5)P3 (InsP3) werd geïdentificeerd als een tweede boodschapper die de receptor-gemedieerde release van Ca2 + in dierlijke cellen1,2activeert . Tot op heden is er geen InsP3-receptor (IP3-R) geïdentificeerd in planten, die een directe signaalrol voor InsP3 in plantencellen3in vraag stelt. Hoe dan ook, InsP3 dient als voorloper voor andere InsP’s die betrokken zijn bij verschillende ontwikkelingsprocessen van installaties , waaronder de regulering van specifieke signaleringstrajecten3,4,5,6,7,8. Zo kan InsP3 verder worden gefossyleerd tot InsP6, ook wel bekend als “fytisch zuur”, dat een belangrijke bron van fosfaat, myo-inositol en cations vertegenwoordigt, en bleek een belangrijke rol te spelen bij de afweerverdediging van de planten tegen ziekteverwekkers, mRNA-export en fosfaathomeostase5,9,10,11,12.

Inositol pyrofosfaten (PP-InsP’s) zijn een klasse van InsP’s die ten minste één hoogenergetische di-fosfo-binding bevatten, aanvankelijk geïdentificeerd in dierlijke cellen, amoebe en gist, waar ze een cruciale rol spelen in verschillende cellulaire processen13,14,15. Ondanks het baanbrekende werk aan PP-InsP’s in planten16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, blijven de biologische functies en de isomere identiteit van deze moleculen nog steeds grotendeels raadselachtig., In het model plant Arabidopsis thaliana, cellulaire InsP8 werd voorgesteld om afweer tegen insecten herbivoren en necrotrofische schimmels te reguleren via toeval-detectie van InsP8 en actieve jasmonate door de ASK1-COI1-JAZ receptor complex17. Voorts zijn rollen van InsP8 en andere PP-InsP’s in energiehomeostase en nutriëntenonderzoek, evenals fosfaathomeostase voorgesteld17,23,24,25,26.

Ongeacht het gebruikte biologische systeem, is één belangrijke methodologische uitdaging bij het bestuderen van InsP’s de betrouwbare opsporing en nauwkeurige kwantificering van deze moleculen geweest. Op massaspectrometrie gebaseerde methoden zijn gebruikt om InsP’s, waaronder PP-InsPs, uit celextracten te detecteren. Deze studies slaagden er echter niet in onderscheid te maken tussen verschillende isomers26,27. Een andere aanpak om InsP’s te analyseren maakt gebruik van pull-down van InsP’s van cellysates met Behulp van TiO2 kralen, gevolgd door polyacrylamide gel elektroforese (PAGE) van de eluted InsPs. De InsP’s kunnen dan worden gekleurd door toluidine blauw of DAPI24,28,29. Het is echter tot nu toe niet mogelijk om InsP’s die lager zijn dan InsP5, op betrouwbare wijze te detecteren uit plantenextracten met behulp van deze methode. Onlangs werd een methode met behulp van [13C]-myo-inositol voor nucleaire magnetische resonantie (NMR) analyse van InsP’s gepubliceerd als een alternatief voor sterke anion uitwisseling high-performance liquid chromatografie (SAX-HPLC)30. Deze techniek is gemeld om een vergelijkbare gevoeligheid te bereiken in vergelijking met SAX-HPLC en om de detectie van 5-InsP 7 mogelijk te maken,evenalsde discriminatie van verschillende niet-enantiomerische InsP5-isomeren uit celextracten. De implementatie van de op NMR gebaseerde methode vereist echter chemisch gesynthetiseerd en commercieel niet beschikbaar [13C]-myo-inositol. Daarom is de methode die in de meeste gevallen wordt gebruikt radiolabeling samples met [3H]-myo-inositol, gevolgd door SAX-HPLC31,32,33. Deze techniek is gebaseerd op myode opname van radioactieve myo-inositol in de plant en de omzetting ervan in verschillende InsP’s door de gecombineerde activiteit van toegewijde cellulaire kinasen en fosfata’s.

De[3H]-gelabelde InsP’s worden vervolgens zuur geëxtraheerd en gefractioneerd met SAX-HPLC. Vanwege hun negatieve lading werken de InsP’s sterk samen met de positief geladen stationaire fase van de SAX-HPLC-kolom en kunnen ze worden geëuterd met een buffergradiënt die toenemende fosfaatconcentraties bevat om InsP’s uit de kolom te ijveren. Elution tijden dus afhankelijk van lading en geometrie van de InsP soorten te scheiden. Bij afwezigheid van chirale kolommen kunnen alleen niet-enantiomeree isomeren door gescheiden door dit protocol. Radioactief gelabelde normen kunnen echter worden gebruikt om het isomerische karakter van een specifieke InsP-piek toe te wijzen. Meerdere pogingen in het verleden door verschillende laboratoria om gelabelde en niet-gelabelde normen te genereren met (bio)chemische methoden of om ze te zuiveren uit verschillende cellen en organismen hebben bijgedragen tot het toewijzen van pieken aan bepaalde InsP-soorten; en ook om de isomerische identiteit van individuele InsP-soorten5,7,21,34, 35,36,36,37,38,39,,40,41,42,43te beperken . Ook de recente opheldering van enzymatische trajecten die leiden tot de vorming van PP-InsP’s in planten, evenals de ontdekking van een bacteriële type III-effector met een specifieke 1-fytaseactiviteit , verschaffen informatie over het genereren van nuttige normen voor deze analyses10,17,18,22,23.

De resulterende breuken kunnen worden gemeten in een vloeibare scintillatieteller als gevolg van het β-verval van tritium (3H). Met de toenemende etiketteringstijd wordt een steady-state isotopisch evenwicht bereikt, waarna de verkregen InsP-profielen de InsP-status van de installatie31moeten vertegenwoordigen. Het grote voordeel van dit protocol in vergelijking met andere beschikbare technieken is de hoge gevoeligheid die wordt bereikt door het gebruik van de directe voorloper voor InsP’s en het meten van een radioactief signaal.

SAX-HPLC van monsters gewonnen uit [3H]-myo-inositol-gelabelde planten of andere organismen wordt vaak gebruikt voor de detectie en kwantificering van InsP’s, variërend van lagere InsP-soorten tot PP-InsPs, wat een waardevol instrument is om het metabolisme, de functie en de werkingswijzen van InsP’s beter te begrijpen. Tot nu toe is deze methode ook de meest geschikte keuze voor onderzoekers met speciale interesse in lagere InsP-soorten. Hoewel de basis van deze procedure, waarop het hier beschreven protocol voortbouwt, eerder zijn beschreven7,21,31,34, ontbreekt nog steeds een gedetailleerd protocol dat is afgestemd op de analyse van door planten afgeleide InsP’s en in het bijzonder van PP-InsP’s. Eerdere publicaties meldden moeilijkheden om de lage p-insp’s, met name InsP8, betrouwbaar op te sporen als gevolg van een of meer van de volgende factoren: relatief lage hoeveelheden plantaardig materiaal, [3H]-myo-inositol met een lage specifieke activiteit (> 20 Ci/mmol), gebruik van extractiebuffers die ofwel niet zijn gebaseerd op perchloorzuur of minder geconcentreerd zijn dan 1 M, verschillende neutraliserende buffers, evenals suboptimale hellingen of detectie van [3H] met een on-line detector. In vergelijking met deze studies is het hier gepresenteerde protocol ontworpen voor de betrouwbare detectie van PP-InsPs7,21,34.

Hier presenteren we een gedetailleerde workflow, vanaf de installatie van de apparatuur tot plantenteelt en etikettering, InsP extractie en de SAX-HPLC run zelf. Hoewel de methode werd geoptimaliseerd om het model plant A. thaliana, kan het gemakkelijk worden gewijzigd om andere plantensoorten te bestuderen, zoals hier getoond met de eerste gemelde InsP profiel van het model peulvruchten Lotus japonicus. Hoewel het gebruik van een andere plantensoort enige optimalisatie kan vereisen, zijn we van plan deze kleine te maken, waardoor dit protocol een goed uitgangspunt is voor verder onderzoek in plant InsP’s. Om mogelijke optimalisaties mogelijk te maken, geven we elke stap binnen het protocol aan waarin wijzigingen mogelijk zijn, evenals alle kritieke stappen die uitdagend kunnen zijn bij het voor het eerst vaststellen van de methode. Daarnaast rapporteren we hoe gegevens die met deze methode worden verkregen, kunnen worden gebruikt voor de kwantificering van specifieke InsP’s en hoe verschillende monsters kunnen worden geanalyseerd en vergeleken.

Protocol

1. Het HPLC-systeem instellen Stel een systeem op bestaande uit twee onafhankelijke HPLC pompen (binaire pomp), één voor elke buffer. Beide pompen moeten samen worden bediend via een computer met respectievelijke software of door het hebben van een hoofdpomp. Voer een zuigerafdichtingswas voor beide pompen, hetzij via gravitatiekracht of via een derde lagedrukpomp. Wijs één pomp aan voor buffer A (aangeduide pomp A) en één voor buffer B (aangeduide pomp B).LET OP: Beide moeten druk kunnen genereren tot 60 bar (6 MPa) en stroomsnelheden van ten minste 0,5 mL/min. Sluit beide pompen aan op een dynamische mixer. Sluit de mixer aan op een injectieklep met een monsterlus van ten minste 1 mL capaciteit. Sluit de injectieklep met een capillair aan via de bijbehorende eindfittingen. Sluit de kolom aan op de fractiecollector met behulp van een capillaire met de juiste lengte.OPMERKING: Deze beschrijving is gebaseerd op ons HPLC-systeem (zie de tabel van materialen),die meer handmatige stappen vereist dan nieuwere en meer geavanceerde systemen. Ons systeem maakt eenvoudige toegang en modificatie van alle componenten mogelijk. Quaternaire pompen (met de binaire gradiënt hier beschreven) kan ook worden gebruikt en zal leiden tot elutie profielen en de algehele kwaliteit van de analyses vergelijkbaar met die bereikt met binaire pompen. 2. Voorbereiding van buffers, kolom- en HPLC-systeem Bereid de buffers voor de winning van oplosbare InsP’s voor: extractiebuffer (1 M HClO4) en neutralisatiebuffer (1 M K2CO3). Bereid beide buffers met ultrazuiver gedeïsteerd water. Ze zijn stabiel bij kamertemperatuur voor enkele maanden. Voeg onmiddellijk vóór de extractie EDTA toe aan beide oplossingen voor een uiteindelijke concentratie van 3 mM (bijvoorbeeld van een gefilterde EDTA-voorraadoplossing van 250 mM).LET OP: HClO4 (perchloorzuur) is sterk corrosief. Bereid de buffers voor de SAX-HPLC run voor: buffer A (1 mM EDTA) en buffer B (1 mM EDTA, 1,3 M (NH4)2HPO4; pH 3.8 met H3PO4). Bereid beide voor met ultrazuiver gedeïmiseerd water, gevolgd door vacuümfiltratie met memfilters van 0,2 μm porieformaat. Deze zijn stabiel bij kamertemperatuur voor enkele maanden.OPMERKING: EDTA moet in alle buffers worden opgenomen om interacties van katie’s met InsP’s te voorkomen, wat kan leiden tot gewijzigde InsP-lading of zelfs onoplosbare InsP-zoutcomplexen. De verloop als volgt programmeren: 0\u20122 min, 0% buffer B; 2\u20127 min, tot 10% buffer B; 7\u201268 min, tot 84% buffer B; 68\u201282 min, tot 100% buffer B; 82\u2012100 min, 100% buffer B, 100\u2012101 min, tot 0% buffer B; 101\u2012125 min, 0% buffer B. De optimale debiet voor dit verloop is 0,5 mL/min. Verzamel tijdens de run elke minuut fracties, vanaf minuut 1 tot minuut 96. De resterende 30 minuten van het verloop dienen om de kolom en het systeem te wassen, en hoeven niet te worden verzameld voor scintillatie tellen. Stel indien mogelijk de maximale bereikbare druk in voor de noodsluiting van de HPLC-pompen op 80 bar (8 MPa). Dit voorkomt kritieke schade aan de hars van de kolom. Bij gebruik van een nieuwe SAX HPLC kolom, was het grondig (>50 mL) met gefilterd ultra-zuiver gedeïoniseerd water voor het eerste gebruik.OPMERKING: Dit zorgt voor verwijdering van de ingeperkte methanol, waardoor zoutneerslag in latere stappen wordt voorkomen. Gebruik indien mogelijk een aparte HPLC pomp. Als dit niet beschikbaar is, moet u ervoor zorgen dat de HPLC met water is gespoeld voordat u de kolom wast. De stroomsnelheid mag niet hoger zijn dan 2 mL/min. Na het wassen is de kolom klaar voor de analyse en kan, wanneer deze goed wordt behandeld, worden gebruikt voor 20\u201240-runs. Daarna zal de resolutie achtereenvolgens afnemen. Langdurig wassen met buffer A (>1 h) en het uitvoeren van stap 2.6 kan helpen de levensduur van de kolom te verlengen. Als de afname van de resolutie aanhoudt, moet de kolom worden uitgewisseld. De gradiënt kan worden aangepast om de scheiding tussen specifieke inositol polyfosfaatsoorten te vergroten of om de totale runtime te verminderen. Het gebruik van verschillende HPLC-systemen (met verschillende leegtevolume of verschillend volume van de haarvaten) zal de retentietijden sterk beïnvloeden. Ook kolomwijzigingen hebben kleine gevolgen voor de bewaartijden. Voer een “mock run” uit. In plaats van een geëxtraheerd monster, injecteer gefilterd ultra-zuiver gedeïniseerd water in het HPLC-systeem en voer de standaard gradiënt. De fracties hoeven niet te worden verzameld.LET OP: Stap 2.6 is optioneel. Het moet echter worden uitgevoerd als een van de volgende situaties van toepassing is: er is een nieuwe kolom geïnstalleerd; Het HPLC-systeem is vooraf voor een andere methode gebruikt; Het HPLC-systeem wordt niet langer dan 3 dagen gebruikt; Er was een probleem met de vorige run. 3. Plantenteelt en etikettering met [3H]-myo-inositol OPMERKING: De volgende stappen moeten worden uitgevoerd met steriele componenten en onder steriele omstandigheden,terwijl het dragen van handschoenen om handen te beschermen tegen besmetting met het radiolabel. Plantaardige media, vooral bij het bevatten van sacharose, zijn gevoelig voor microbiële besmetting. Steriliseer A. thaliana zaden met 1 mL van 1,2% natriumhypochloriet gedurende 3 minuten, gevolgd door 1 mL ethanol van 70% gedurende 3 minuten. Voeg vervolgens 1 mL 100% ethanol toe, pipet de zaden met de ethanol op een circulair filterpapier en laat ze luchtdrogen onder een laminaire stroming op een schone bank. Bij het gebruik van L. japonicus zaden, plaats ze in een mortel en scrub zaden met schuurpapier voor sterilisatie om een voldoende kiemkracht te garanderen. Zaai arabidopsis zaden in 1-2 rijen op vierkante petrischaaltjes gevuld met solide groeimedia bestaande uit half-sterkte Murashige en Skoog (MS) zoutoplossing, 1% sacharose, 0,7% gellangom in gedeïoniseerd water aangepast aan pH 5.7 met KOH en hen in staat stellen om te stratificeren voor ten minste 1 dag bij 4 °C in het donker. Voor Lotus zaden, zaaien ze uit in 1 rij op vierkante petrischaaltjes gevuld met solide groeimedia bestaande uit 0,8% bacteriologische agar in gedeïmiseerd water en laat ze stratificeren voor ten minste 3 dagen bij 4 °C in het donker. Plaats de platen verticaal in een groeibrocator of klimaatkamer en laat ze 10-12 dagen groeien onder korte dagen omstandigheden (8 uur licht bij 22 °C, 16 uur donker bij 20 °C). Breng 10-20 zaailingen over in een put van een 12-goed heldere platte celkweekplaat gevuld met 2 mL halfsterkte MS-zoutoplossing aangevuld met 1% sacharose en aangepast aan pH 5.7. Voeg 45 μCi van [3H]-myo-inositol (30-80 Ci/mmol, opgelost in 90% ethanol) toe en meng door zachte werveling. Bedek de plaat met het bijbehorende deksel en verzegel deze met microporeuze chirurgische tape (bijvoorbeeld micropore of leucopore tape), waardoor deze weer in de groeibrocator wordt gelegd.LET OP: [3H] is een low-energy beta emitter die een schadelijk stralingsgevaar kan zijn bij inademing, ingenomen of geabsorbeerd door de blote huid. Draag altijd handschoenen bij het hanteren van radioactief materiaal of apparatuur die direct of indirect contact heeft met radioactief materiaal. Volg ook de lokale regels voor een veilige omgang met radiochemicaliën (bijvoorbeeld het dragen van extra beschermende kleding, het gebruik van een dosimeter en het regelmatig onderzoeken van oppervlakken op verontreinigingen). Na 5 dagen labelen, verwijder zaailingen uit de media en was ze kort met gedeïioneerd water. Droog ze met papieren handdoeken en breng ze in een 1,5 mL microcentrifuge buis. Vul de buis niet te veel in en plaats niet meer dan 100 mg FW/tube, wat overeenkomt met ongeveer 10\u201220 17 dagen oude zaailingen.OPMERKING: Een teveel aan plantaardig materiaal zal het zuur verdunnen tijdens het extractieproces en zal de extractie-efficiëntie sterk verminderen. Vries de buis vast in vloeibare stikstof en bewaar deze op -80 °C tot de extractie.LET OP: Monsters kunnen gedurende enkele weken op -80 °C worden bewaard zonder dat dit ten koste gaat van de monsterkwaliteit. De groeiomstandigheden (media, licht, temperatuur, tijd) kunnen worden aangepast aan de behoeften van een specifiek experiment of plantensoorten. Er moet echter voor worden gezorgd bij het verdunnen van de [3H]-myo-inositol, om kwantificeerbare SAX-HPLC-runs van goede kwaliteit te garanderen. Daarom wordt aanbevolen om te beginnen met de [3H]-myo-inositol concentraties hier vermeld en het stapsgewijs te verminderen indien gewenst. Tijdens de etiketteringstijd kunnen planten aan verschillende behandelingen (bijvoorbeeld milieuspanningen of chemische agentia) worden onderworpen om de impact van die omstandigheden op de mondiale InsP’s te beoordelen. Om steady-state labeling te bereiken, raden we aan om planten minstens 5 dagen te labelen. 4. Extractie van oplosbare insp’s LET OP: Bewaar monsters en reagentia op ijs tijdens het hele extractieproces. Draag altijd handschoenen en een beschermende bril vanwege het hoge risico op contact met radioactief materiaal, vooral tijdens het slijpen. Alles wat in contact komt met monsters wordt beschouwd als radioactief afval en moet worden verwijderd volgens de lokale regels voor veilige verwijdering van radioactief materiaal. Bereid de werkoplossingen voor de extractie- en neutralisatiebuffer voor zoals in stap 2.1. Voor elk monster is 600 μL extractiebuffer en 400 μL neutralisatiebuffer nodig. Bewaar de buffers op ijs. Neem de monsters uit -80 °C vriezer en bewaar ze in vloeibare stikstof tot verdere verwerking. Maal de monsters met een microcentrifugebuis stamper totdat ze beginnen te ontdooien en voeg 500 μL ijskoude extractiebuffer toe. Blijf malen totdat het monster volledig gehomogeniseerd is en de oplossing een diepgroene kleur heeft (als er bladeren in het monster aanwezig zijn). De monsters 10 min bij 4 °C bij ≥ 18000 x gcentrifugeren . Breng de supernatant in een verse 1,5 mL buis. Houd er rekening mee dat de buizen die voor de extractie worden gebruikt, als vast radioactief afval worden beschouwd en dienovereenkomstig moeten worden verwijderd. Voeg voorzichtig 300 μL neutralisatiebuffer toe aan het extract. Neerslag van eiwitten en borrelen zal onmiddellijk beginnen. Meng door na een minuut met een pipettip te wervelen en wacht enkele seconden voordat u een kleine hoeveelheid (5 μL) op pH-papierpipet (idealiter bereik van pH 6–9). De pH moet uiteindelijk tussen pH 7 en 8 liggen. Voeg indien nodig kleine hoeveelheden (meestal 10-20 μL) van neutralisatiebuffer of extractiebuffer toe totdat de gewenste pH is bereikt. Laat de monsters minstens 1 uur rusten op ijs met een open deksel. Centrifugeren de monsters gedurende 10 minuten bij 4 °C bij ≥ 18.000 x g. Breng de supernatant in een verse 1,5 mL buis.OPMERKING: De monsters kunnen direct worden gebruikt in een SAX-HPLC-run of op ijs worden gehouden (indien later op dezelfde dag wordt gebruikt) of in vloeibare stikstof worden ingevroren en gedurende 2\u20124 weken bij -80 °C worden opgeslagen. Om een hoge reproduceerbaarheid en vergelijkbaarheid te garanderen, wordt aanbevolen om de monsters altijd 5 minuten in vloeibare stikstof te bevriezen, zelfs als ze daarna direct worden gebruikt. Opslag op langere termijn van geëxtraheerde monsters bij -80 °C is mogelijk zolang monsters slechts eenmaal ontdooid zijn. Als bevroren monsters worden gebruikt voor de analyse, zorg ervoor dat er geen deeltjes zichtbaar zijn na het ontdooien. Anders, centrifuge opnieuw voor 10 min bij 4 °C bij ≥ 18.000 x g en breng de supernatant in een verse 1,5 mL buis. 5. Het uitvoeren van de HPLC-run Rust de fractiecollector uit met 96 kleine scintillatiefloven (capaciteit van ~6 mL) en vul elke flacon met 2 mL van een geschikte scintillatiecocktail (bijvoorbeeld Ultima-Flo AP vloeibare scintillatiecocktail) compatibel met buffers met een lage pH en hoge ammoniumfosfaatconcentratie (zie Tabel van Materialen).LET OP: Het aantal flesjes en de grootte van de flesjes zijn afhankelijk van de gebruikte fractiecollector en scintillatieteller. Het is belangrijk om ten minste de eerste 90 fractieste verzamelen , als het hier beschreven verloop wordt gebruikt, om een volledig inositol polyfosfaatprofiel te verkrijgen. Zorg er ook voor dat u elke flacon en het bijbehorende deksel goed labelt, om verwisseling van breuken of monsters te voorkomen. Start het HPLC systeem/pompen en laat het draaien. Activeer de zuigerafdichting en laat deze gedurende de hele run geactiveerd. Laad het monster door het volledige supernatant handmatig te injecteren vanaf stap 4.5 (ongeveer 750 μL) met behulp van een geschikte spuit (zie Tabel met materialen). Als automatische injectie mogelijk is, breng het monster over naar de overeenkomstige monster flacon. Draai de klep van “load” naar “injectele” positie en start het verloop en de fractiecollector.OPMERKING: Afhankelijk van het gebruikte HPLC-systeem kan de startprocedure verschillen, vooral bij het vergelijken van oudere systemen (zoals hier beschreven) met een volledig softwaregestuurd nieuwer model. Het is erg belangrijk om ervoor te zorgen dat het verloop, de monsterinjectie en de fractieverzameling gelijktijdig beginnen. Terwijl de HPLC-run aan de gang is, controleer de druk regelmatig. De startdruk moet rond de 18-24 bar (1,8–2,4 MPa) liggen en moet langzaam stijgen tot 50-60 bar (5-6 MPa) zodra 100% buffer B is bereikt.LET OP: Verminderde druk kan duiden op een lek in het systeem, terwijl verhoogde druk wijst op een verstopping. Drukschommelingen (≥ 3 bar in een paar seconden) kunnen wijzen op de aanwezigheid van lucht in het systeem. Houd er rekening mee dat alles wat de kolom verlaat, evenals elke lekkage die optreedt bij de injector of daarna radioactiefis.LET OP: De druk is ook afhankelijk van het HPLC-systeem en kan lager of hoger zijn dan hier vermeld. Het zal langzaam toenemen na ongeveer 15-20 runs. Dit heeft echter niet noodzakelijkerwijs invloed op de kwaliteit van de verkregen runs. Na de run sluit u de flesjes goed en meng de fracties met de scintillatiecocktail door krachtig te schudden. Ga direct verder met de meting of houd de flesjes rechtop, idealiter in het donker.OPMERKING: Breuken gemengd met scintillatiecocktail zijn wekenlang stabiel en kunnen later worden gemeten. Aangezien de halflevenstijd van tritium 12,32 jaar is, is het signaalverlies verwaarloosbaar. Zodra de run van het laatste monster van de dag is voltooid, stop beide HPLC pompen. (Optioneel) Om de levensduur van het systeem te verhogen, vooral wanneer het niet regelmatig wordt gebruikt, was pomp B en haarvaten door het plaatsen van de haarvaten van buffer B in een fles met buffer A en laat de pomp lopen voor 10-15 min. Voor het volgende gebruik, vergeet niet om de capillaire te vervangen in buffer B en om pomp B los te koppelen van de mixer om het te spoelen met buffer B. Zodra de pomp en haarvaten weer zijn gevuld met buffer B, sluit deze opnieuw aan op de mixer en is het systeem klaar voor gebruik. 6. Het meten van de breuken Steek de flacons in scintillatie teller rekken en meet elke flacon gedurende 5 minuten in een vloeibare scintillatie teller. Gebruik in het ideale gebruik racks die direct op kleine flesjes passen en vermijd het in grotere (bijvoorbeeld 20 mL) flesjes hangen in de flesjes om telfouten te verminderen. De software-instellingen die in dit protocol worden gebruikt, worden weergegeven in supplementaire figuur 1.OPMERKING: Voer regelmatig een SNC-protocol (zelfnormalisatie en kalibratie) uit met onvervedste [3H]-normen. Kortere teltijden (1-5 min) zijn mogelijk om de wachttijd te verkorten. Om een hoge telreprominbaarheid en nauwkeurigheid te garanderen, wordt echter 5 min aanbevolen. 7. Gegevensanalyse Exporteer de metingen van de scintillatieteller als een spreadsheetbestand of een compatibele/converteerbare bestandsindeling. Evalueer de gegevens met een computer die is uitgerust met Excel of soortgelijke software, en een geschikte analysesoftware zoals Origin. Bereid een 2D-lijndiagram voor waarbij de gemeten tellingen per minuut (cpm) worden uitgezet tegen de bewaartijd (zie figuur 1, figuur 2). Om monsters met elkaar te vergelijken, normaliseert u de gegevens door de cpm van elke geëuterde fractie van minuut 25 tot 96 voor elk afzonderlijk monster samen te vatten.OPMERKING: Minuut 25 wordt gebruikt als cut-off om niet-opgenomen [3H]-myo-inositol, InsP1 en InsP2 uit de analyse uit te sluiten, omdat deze sterk fluctueren en niet goed kunnen worden gescheiden (althans met de gradiënt die in dit protocol wordt voorgesteld) en dus de normalisatiefactor sterk veranderen vanwege hun hoge activiteit. Normaliseer alle gegevens met het laagste totaal cpm (in fracties 25\u201296) door de totale cpm van het monster te delen met de laagste cpm (in fracties 25-96) door de totale cpm (in fracties 25-96) van de andere monsters. De resulterende factor kan vervolgens worden gebruikt om de cpm van elke fractie te normaliseren door de cpm van elke fractie te vermenigvuldigen met de factor.OPMERKING: Uiteindelijk moet de som van de cpm-waarden van minuut 25 tot het einde gelijk zijn voor alle monsters die met elkaar worden vergeleken. Alleen genormaliseerde runs moeten worden weergegeven in dezelfde grafiek / figuur (wanneer gepresenteerd als werkelijke profielen). Aanvullende figuur 2 geeft een voorbeeld van hoe deze berekeningsstappen worden gemaakt (met slechts fracties 25-35 van twee monsters voor vereenvoudiging). In sommige gevallen is het echter niet nodig om gegevens te normaliseren. Bijvoorbeeld wanneer pieken worden gekwantificeerd volgens stap 7.4 en gepresenteerd als percentages van de totale InsP’s (zoals weergegeven in figuur 3D). Zoals eerder vermeld, verhoogt bij het presenteren van meerdere analyses naast elkaar als profielen, of wanneer de werkelijke gemeten activiteit wordt gebruikt voor conclusies (bijvoorbeeld behandeling a) De insP7 met x% verhoogt in vergelijking met controle, verwijzend naar de cpm-waarden van InsP7 van beide monsters en niet naar hun percentage van de totale InsP’s) is normalisatie nodig. Om het effect van genotype of behandelingsverschillen op etiketteringsefficiëntie te analyseren, is het belangrijk om niet te normaliseren,omdat dit deze verschillen ongeldig zou maken. Absolute kwantificering met deze methode is echter een uitdaging omdat de extractie-efficiëntie met dit protocol om verschillende redenen variabel kan zijn en soms zelfs wordt waargenomen wanneer replica van hetzelfde genotype en de behandeling worden geanalyseerd. Houd er rekening mee dat, afhankelijk van het HPLC-systeem, de kolom en het verloop dat voor de analyses wordt gebruikt, de cut-off mogelijk moet worden gewijzigd. Als u relatieve kwantificeringen wilt uitvoeren van bepaalde inositolpofosfaatpieken en vervolgens staafgrafieken wilt maken die gegevens van replicaties voor statistische analyses bevatten, u de analyse voortzetten met een gespecialiseerde software die piekgebieden van chromatogrammen kan berekenen (bijvoorbeeld Origin). Zie supplementisch figuur 3.OPMERKING: De meeste HPLC-systemen die softwaregestuurd zijn, worden geleverd met een desbetreffende software die deze taak kan uitvoeren. Pieken worden bepaald als de breuken met cpm-waarden boven de achtergrond (die tot op zekere hoogte variëren tussen runs) en bewaartijden die vergelijkbaar zijn met eerder gepubliceerde gegevens. De retentietijd van een specifieke piek wordt bepaald in spreadsheetsoftware (bijvoorbeeld Excel) en wordt gebruikt om pieken toe te wijzen voor de berekening van bepaalde integralen (bijvoorbeeld in Origin). Aanvullende figuur 3 illustreert dit proces van piekbepaling, achtergrondaftrekken en integratie van pieken.

Representative Results

De hier getoonde resultaten zijn gericht op het illustreren van mogelijke resultaten verkregen op basis van variaties op technisch en biologisch niveau. De eerste wordt geïllustreerd door analyses met behulp van nieuwe versus verouderde kolommen (figuur 1) en verse versus opgeslagen monsters (figuur 3), en de tweede door het evalueren van extracten uit twee verschillende installatiesystemen, A. thaliana (figuur 1, figuur 3) en L. japonicus (figuur 2). Een optimale SAX-HPLC run is afgebeeld op figuur 1A\u2012C, die een compleet inositol polyfosfaatspectrum toont verkregen uit A. thaliana-extracten na scintillatietelling. Houd er rekening mee dat pieken mooi gescheiden zijn en kunnen worden toegewezen aan verschillende isomeren (of enantiomer-paren) op basis van chromatografische mobilities die eerder5,7 zijnbeschreven . Figuur 2 toont het representatieve resultaat van een SAX-HPLC-analyse van L. japonicuszaailingen die onder dezelfde voorwaarden als de Arabidopsis-zaailingen zijn geteeld en gelabeld. Hoewel vermoedelijk alle InsP-soorten en pieken die bekend zijn van Arabidopsis kunnen worden gezien, zijn er aanzienlijke verschillen met betrekking tot de relatieve (bijvoorbeeld, verhoudingen tussen isomers) hoeveelheid specifieke InsP-isomeren, bij het vergelijken van de profielen van beide soorten. Bijvoorbeeld, de Lotus extracten toonde verhoogde InsP3c, InsP4b, InsP5b en verminderde InsP3a, InsP4a, InsP5a en InsP5c in vergelijking met Arabidopsis die ruimte laat voor verdere onderzoeken. Figuur 2D illustreert de verschillende verhoudingen tussen InsP-isomeren tussen Arabidopsis en Lotus. Figuur 3 toont twee InsP-profielen van een monster dat na de extractie is gesplitst. De eerste helft werd onmiddellijk geanalyseerd en de tweede helft een dag later, na opslag bij -80 °C. Houd er rekening mee dat er slechts kleine verschillen worden waargenomen tussen de verschillende monsters (d.w.z. zwarte en rode lijnen op figuur 3A\u2012Cen figuur 3D). Dit illustreert dat één vriesdooicyclus het monster niet schaadt en dat de methode zelf reproduceerbare resultaten genereert. Figuur 1: Typisch InsP-profiel van een succesvol en van een mislukte SAX-HPLC-analyse uitgevoerd met dit protocol. (A\u2012C) SAX-HPLC profiel van 17-dagen-oude wild-type (Col-0) Arabidopsis zaailingen radioactief gelabeld met [3H]-myo-inositol. Global InsP extractie en SAX-HPLC run werden uitgevoerd op dezelfde dag. a) volledige spectra; (B, C) Zoomind van het profiel in A. Alle zichtbare pieken worden gemarkeerd en toegewezen aan de overeenkomstige InsP-soorten. Op basis van gepubliceerde chromatografische mobiliteiten5,7, vertegenwoordigt InsP4a waarschijnlijk Ins(1,4,5,6)P4 of Ins(3,4,5,6)P4, InsP5a vertegenwoordigt InsP5 [2-OH], InsP5b vertegenwoordigt InsP5 [4-OH] of zijn enantiomereic vorm InsP5 [6-OH], en InsP5c vertegenwoordigt InsP5 [1-OH] of zijn enantiomerische vorm InsP5 [3-OH]. De isomerische aard van InsP3a-c, InsP4b, InsP7, en InsP8 zijn nog onbekend. Panel (D) toont een SAX-HPLC profiel van identiek geteelde planten, maar met behulp van een verouderde kolom (>40 runs). Een duidelijke vermindering van InsP6 ten opzichte van andere InsP-soorten en de afwezigheid van PP-InsP’s is zichtbaar. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 2: Representatief InsP-profiel van L. japonicusplanten.  SAX-HPLC profiel (A\u2012C) van 17-dagen-oude wild-type (Gifu) L. japonicus zaailingen radioactief gelabeld met [3H]-myo-inositol. a) volledige spectra; (B, C) Zoomind van het profiel in A. Alle zichtbare pieken worden gemarkeerd en toegewezen aan de overeenkomstige InsP-soorten. Op basis van gepubliceerde chromatografische mobiliteiten5,7, vertegenwoordigt InsP4a waarschijnlijk Ins(1,4,5,6)P4 of Ins(3,4,5,6)P4, InsP5b vertegenwoordigt waarschijnlijk InsP5 [4-OH] of de enantiomeree vorm InsP5 [6-OH], en InsP5c vertegenwoordigt waarschijnlijk InsP5 [1-OH] of zijn enantiomereic vorm InsP5 [3-OH]. De isomerische aard van InsP3a-c, InsP4b, InsP7en InsP8 zijn onbekend. (D) Vergelijking tussen de afzonderlijke InsP-soorten (in % van de totale activiteit uit elutie 25\u201296) van A. thaliana (gegevens uit figuur 1A\u2012C) en L. japonicus (gegevens uit figuur 2A–C). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 3: InsP-profielen van een gesplitst monster ter illustratie van de reproduceerbaarheid van SAX-HPLC-analyses. (A\u2012C) SAX-HPLC profielen van 17 dagen oude wild-type (Col-0) Arabidopsis zaailingen radioactief gelabeld met [3H]-myo-inositol. Voorafgaand aan de run werd het monster gesplitst en de ene helft onmiddellijk uitgevoerd en de andere helft een dag later na opslag bij -80 °C. (A) Volledige spectra; (B, C) Zoomind van het profiel in A. Alle zichtbare pieken worden gemarkeerd en toegewezen aan de overeenkomstige InsP-soorten. Op basis van gepubliceerde chromatografische mobiliteiten5,7, vertegenwoordigt InsP4a waarschijnlijk Ins(1,4,5,6)P4 of Ins(3,4,5,6)P4, InsP5a vertegenwoordigt InsP5 [2-OH], InsP5a vertegenwoordigt InsP5 [2-OH], InsP5b vertegenwoordigt InsP5 [4-OH] of de enantiomereic vorm InsP5 [6-OH], en InsP5c vertegenwoordigt InsP5 [1-OH] of de enantiomeree vorm InsP5 [3-OH]. De isomerische aard van InsP3a-c, InsP4b, InsP7, en InsP8 zijn nog onbekend. Panel D toont de kwantificering van InsP6 en de PP-InsP7 en InsP8 van beide runs. De waarden vertegenwoordigen het bedrag (in %) van de respectieve InsP-soorten ten opzichte van alle InsP (totale activiteit van elutie 25–96). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Aanvullende figuur 1: Software-instellingen voor het tellen van vloeibare scintillatie met behulp van een licht scintillatieteller. Screenshots met de softwareversie, evenals instellingen die worden gebruikt voor scintillatie tellen van [3H] monsters uitgevoerd met dit protocol worden afgebeeld. Klik hier om dit cijfer te downloaden. Aanvullend figuur 2: Representatief voorbeeld van gegevensnormalisatie. Een schermafbeelding van een werkblad toont alle stappen en formules die worden gebruikt om SAX-HPLC-runs naar elkaar te normaliseren. Voor vereenvoudiging worden slechts fracties van 25–35 van de monsters weergegeven. Klik hier om dit cijfer te downloaden. Aanvullende figuur 3: Piekbepaling, achtergrondaftrekken en integratie met behulp van analysesoftware. (A) Gegevens uit SAX-HPLC-analyse worden in de software geladen (minuten 28–96) en de piekanalyzertool is geselecteerd. (B\u2012E) De basislijn wordt handmatig gedefinieerd door punten in te stellen tussen afzonderlijke pieken en de achtergrond wordt afgetrokken. (F) Pieken worden handmatig bepaald op basis van het uiterlijk en gepubliceerde chromatografische mobiliteiten5,7. (G) Piekbereiken worden handmatig gedefinieerd door cpm-waarden. (H)Pieken worden geïntegreerd en berekend als % van alle pieken. Klik hier om dit cijfer te downloaden.

Discussion

Hier presenteren we een veelzijdige en gevoelige methode om InsP’s te kwantificeren, waaronder PP-InsP’s in plantenextracten en praktische tips geven over hoe deze methode tot stand kan worden gebracht. Hoewel het protocol over het algemeen robuust is, kunnen suboptimale runs en analyses optreden. In de meeste gevallen kunnen deze runs worden geïdentificeerd door een sterke vermindering of zelfs volledig verlies van sterk fosforyleerde InsP’s, met name de PP-InsP-soort InsP7 en InsP8. Mogelijke redenen kunnen microbiële verontreinigingen van het plantaardige materiaal zijn en onvoldoende deactivering van endogene installatie PP-InsP hydrolasen tijdens de extractie als gevolg van onvoldoende slijpen en ontdooien van plantaardig materiaal dat niet onmiddellijk in contact zal komen met de extractiebuffer. Andere redenen zijn onjuiste pH-aanpassing door onvoldoende of overmatige toevoeging van neutralisatiebuffer, of gewoon onvoldoende monstermateriaal. Deze laatste kan het moeilijk maken om PP-InsP’s te detecteren, omdat deze vaak in zeer lage hoeveelheden in de cellen aanwezig zijn. Een teveel aan monstermateriaal of inefficiënt drogen tijdens stap 3.5 kan verdunning van het perchloorzuur veroorzaken, wat ook leidt tot onvoldoende enzymdeactivering en een specifiek verlies van InsP6 en PP-InsPs. De hoeveelheid plantaardig materiaal, evenals het radiolabel dat in dit protocol wordt gebruikt, werden geoptimaliseerd op basis van kosten en prestaties, en ligt daarom dicht bij de laagste hoeveelheid die nog steeds voldoende is voor het leveren van optimale resultaten. Bovendien zal de kolom hars geleidelijk aan verliest zijn resolutie capaciteit. Het eerste teken van dit proces is (om redenen die voor de auteurs niet helemaal duidelijk zijn) een specifiek verlies van hogere fosforyleerde InsP-soorten zoals de PP-InsPs in het HPLC-spectrum. Met verdere veroudering, zelfs InsP6 zal niet goed worden opgelost door de kolom (Figuur 1D). Daarom is het gebruik van een adequate kolom, evenals een zorgvuldige behandeling van het monster en een goed onderhoud van de HPLC-componenten van cruciaal belang voor het garanderen van nauwkeurige resultaten.

Bij het vergelijken van monsters en runs, vooral wanneer gegenereerd met verschillende apparatuur (bijvoorbeeld HPLC-systemen en kolommen) of op verschillende dagen, is het van cruciaal belang om de monsters aan elkaar te normaliseren (zoals beschreven in stap 7.3) en ze op dezelfde manier te analyseren. Alleen door normalisatie is het mogelijk en nauwkeurig om meerdere monsters in dezelfde grafiek weer te geven(figuur 3). Voor kwantificering van individuele InsP’s ten opzichte van de totale InsP’s, of een andere specifieke InsP-soort, is het niet nodig om te normaliseren, zolang alleen relatieve waarden en niet absolute waarden worden weergegeven. Idealiter worden zowel de InsP-profielen als de kwantificeringen getoond. In sommige gevallen is het echter niet mogelijk om twee of meer runs in dezelfde grafiek adequaat weer te geven. Verschillende bewaartijden of verschillende niveaus van achtergrondactiviteit kunnen het moeilijk maken om niet-gekwantificeerde SAX-HPLC-profielen alleen te vergelijken. Hetzelfde geldt wanneer veel monsters moeten worden vergeleken. In dergelijke gevallen is een verdere evaluatie met behulp van een aanvullende software (bijvoorbeeld Origin) voor individuele piekkwantificering noodzakelijk.

De auteurs zijn zich ervan bewust dat het hier beschreven protocol kan worden geoptimaliseerd en moet worden aangepast aan elke individuele onderzoeksvraag. Hoewel wordt geoptimaliseerd voor Arabidopsis extracten7,17 in dit protocol, deze methode is veelzijdig en kan helpen bij het bepalen van InsP profielen van andere plantensoorten ook. Hier illustreren we deze mogelijkheid door voor het eerst een InsP-profiel voor L. japonicuste presenteren, waarvoor geen wijzigingen van de etiketteringsvoorwaarden, InsP-extractie of SAX-HPLC-run nodig waren (figuur 2). Met name, hoewel over het algemeen vergelijkbaar, verschillen worden waargenomen tussen L. japonicus en Arabidopsis InsP profielen. Bijvoorbeeld in L. japonicus InsP5 [4-OH] of zijn enantiomerische vorm InsP5 [6-OH] zijn overvloediger dan InsP5 [1-OH] of zijn enantiomerische vorm InsP5 [3-OH] in vergelijking met Arabidopsis, waar InsP5 [1-OH] of zijn enantiomerische vorm InsP5 [3-OH] de dominante InsP5 soorten zijn. Evenzo verwachten we dat veranderingen in de samenstelling van de media, [3H]- myo-inositolconcentratie, plantleeftijd, omgevingsomstandigheden (bijvoorbeeld licht en temperatuur), toevoeging van chemische verbindingen of analyses van plantaardige microbiële interacties tussen andere factoren, mogelijk moeten worden getest en aangepast.myo

Een belangrijk nadeel van deze methode die in aanmerking moet worden genomen, is dat de etikettering wordt gedaan in een (steriele) vloeibare cultuur, die voor de meeste landplanten geen fysiologische omgeving vertegenwoordigt. Bovendien is het volume van de etiketteringsoplossing en de grootte van het kweekvat vanwege de hoge kosten van [³H]-myo-inositol over het algemeen beperkt, wat ook de grootte van de installaties die kunnen worden gebruikt, beperkt. Teelt in vloeibare cultuur kan worden vermeden door bijvoorbeeld direct te infiltreren in bladeren van grondgegroeide planten met [³H]-myo-inositol en vervolgens het hier beschreven protocol volgen, zoals eerder gemeld10.

Er zijn verschillende nadelen van dit protocol in vergelijking met alternatieve methoden, zoals TiO2 pull-down gevolgd door PAGINA of massa spectrometrie gebaseerde technieken. Als gevolg van de [3H]-myo-inositol etikettering, alleen InsP soorten die rechtstreeks afkomstig zijn van radioactief gelabelde myo-inositol zal worden gedetecteerd op het einde. De hier beschreven methode is blind voor andere Ins isomers zoals scyllo-inositolen andere isomeren waarvan sommige zijn geïdentificeerd in bepaalde planten44. Bovendien zullen myo-InsPsafgeleid van andere trajecten worden uitgesloten, waaronder die gesynthetiseerd door de novo synthese van myo-inositol en myo-inositol-3-fosfaat via isomerisatie van glucose-6-fosfaat, gekatalyseerd door myo-inositol-3-fosfaat synthase (MIPS) eiwitten45. Hoewel [32P] of [33P]-ortho-fosfaatkan worden gebruikt als alternatieve labels, vormt het gebruik ervan een groot nadeel, omdat elk fosfaathoudend molecuul, inclusief de overvloedige nucleotiden en de derivaten ervan, zal worden gelabeld. Deze moleculen kunnen ook worden geëxtraheerd met dit protocol en binden aan de SAX-kolom, wat zal resulteren in een hoog niveau van achtergrondactiviteit die zal interfereren met de identificatie van individuele InsP pieken5. Bovendien kan de kwantificering van [32P]- of [33P] -gelabelde InsP’s en PP-InsPs sterk worden beïnvloed door fosfaat- en pyrofosfaatmoiety-omzet en kan het niet worden gemeld dat er een massale uitlezing voor inositolsoorten wordt gemeld.

Aan de andere kant, [3H]-myo-inositol labelt specifiek myo-inositol-bevattende moleculen. InsPs, inositol-bevattende lipiden, zoals fosfoinositides, en galactinol zijn in dit geval gelabeld. Echter, alleen InsPs zal worden geanalyseerd met dit protocol, omdat lipiden zijn onoplosbaar in de extractie buffer en galactinol niet binden aan de SAX kolom.

Tot nu toe zijn de verschillen met een plant InsP-profiel gegenereerd door [3H]-myo-inositol-etikettering in vergelijking met een bepaald door TiO2 pulldown / PAGE blijft onbekend, omdat dergelijke vergelijkingen niet zijn uitgevoerd in planten. Een recente studie in dierlijke cellen ging in op deze vraag46. In dat werk werd een pool van InsP6 die onzichtbaar is door [3H]-myo-inositol etikettering, die daardoor rechtstreeks moet worden afgeleid van glucose-6-fosfaat, geïdentificeerd door SAX-HPLC profielen te vergelijken met PAGE gels van zoogdiercellijnen. 24 uur fosfaathonger resulteerde in een toename van 150% van InsP6 bij het kwantificeren van PAGE gels van InsPs gezuiverd met behulp van TiO2 pulldown. SAX-HPLC-analyses van [3H]- myo-inositol-gelabelde cellen die identiek werden behandeld, toonden slechts een stijging met 15% van [3H]-InsPmyo6. Zoals eerder vermeld, InsP lager dan InsP5 zijn niet op te sporen met PAGINA-analyse in de meeste gevallen. Radiolabeling gevolgd door SAX-HPLC lijkt de methode van keuze te zijn, zolang massaspectrometrische protocollen niet zijn geoptimaliseerd om deze groep zeer negatief geladen moleculen te detecteren.

Een andere resterende uitdaging is het onderscheiden van enantiomeren in SAX-HPLC-analyses (of in een andere methode voor InsP-analyse)10,17. Deze uitdaging kan worden aangepakt door de toevoeging van chirale selectors, dat wil zeggen, enantiopure verbindingen zoals L-arginine amide die interageren met de respectieve enantiomereische moleculen om diastereomeric complexen te vormen die kunnen worden gescheiden10. Voor zover wij weten, is deze aanpak alleen toegepast om de enantiomerische InsP5 isomers InsP5 [1-OH] en InsP5 [3-OH] te discrimineren door NMR analyses10. Discriminatie van andere enantiomereische paren of succesvolle discriminatie van enantiomeren door chirale SAX-HPLC-analyse of chirale PAGE-gebaseerde methoden zijn nog niet gemeld en moeten verder worden ontwikkeld. Gezien de geconserveerde synthese en de geconserveerde regulering van PP-InsP’s door fosforbeschikbaarheid, stellen we ons voor dat vooral niet-radioactieve methoden zoals PAGE- of MS-gebaseerde methoden, samen met voedingsanalyses, zullen helpen bij het bundelen van pogingen om teledetectiegegevens te kalibreren die zijn ontworpen om tekorten aan voedingsstoffen in gewassen te diagnosticeren17,18,24,25. Echter, de methode hier gepresenteerd kan momenteel nog steeds worden beschouwd als de gouden standaard voor InsP-analyses en zal instrumenteel zijn om nieuwe functies van deze intrigerende boodschappers in planten te ontdekken.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gefinancierd door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) in het kader van de Duitse Excellence Strategy – EXC-2070 – 390732324 (PhenoRob), de Research Training Group GRK2064 en individuele onderzoeksbeurzen SCHA1274/4-1 en SCHA1274/5-1 aan G.S.. We danken ook Li Schlüter en Brigitte Ueberbach voor technische bijstand.

Materials

Centrifuge Eppendorf AG model: 5430 R
Diammonium hydrogen phosphate, ≥97 % Carl Roth GmbH + Co. KG 0268.1
Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate, ≥99 %, p.a., ACS Carl Roth GmbH + Co. KG 8043.2
Falcon 12-well clear flat bottom TC-treated multiwell cell culture plate, with lid, individually wrapped, sterile Corning Inc. 353043
Fraction collector LAMBDA Instruments GmbH model: OMNICOLL single channel collector
Growth incubator poly klima GmbH model: PK 520-LED
HPLC pumps Kontron Instruments model: 420
HPLC syringe for Rheodyne valves, 1 mL Hamilton Company 81365
Injector for HPLC Supelco model: Rheodyne 9725
Inositol, myo-[1,2-3H(N)] American Radiolabeled Chemicals Inc. ART 0261
Liquid nitrogen University, Chemistry Department
Liquid scintillation counter PerkinElmer Inc model: TRI-CARB 2900TR
Micro pestle Carl Roth GmbH + Co. KG CXH7.1
Mixed cellulose Eester filter, ME range (ME 24), plain, 0.2 µm pore size, 47 mm circle GE Healthcare Life Sciences 10401770
Mixer for HPLC Kontron Instruments model: M 800
Murashige & Skoog medium, salt mixture Duchefa Biochemie M0221
OriginPro software OriginLab Corp.
Orthophosphoric acid, ≥85 %, p.a., ISO Carl Roth GmbH + Co. KG 6366.1
Partisphere 5 µm SAX cartridge column, 125 x 4.6 mm Hichrom Limited 4621-0505
Perchloric acid, 70 %, 99.999 % trace metals basis Sigma-Aldrich 311421
Petri dish, square, PS, clear, 120/120/17 mm, sterile Greiner Bio One International GmbH 688161
pH-indicator paper pH 5.5 – 9.0, Neutralit Merck KGaA 109564
Phytagel Sigma-Aldrich P8169
Potassium carbonate Carl Roth GmbH + Co. KG P743.2
Safe-Lock tubes, 1.5 mL Eppendorf AG 30120086
Sample loop for 9725 injectors, volume 2 mL, PEEK Supelco 57648
SNAPTWIST scintillation vial, 6.5 mL Simport Scientific Inc. S207-5
Sterile bench LaboGene model: ScanLaf MARS 900
Sucrose, ≥99,5 %, p.a. Carl Roth GmbH + Co. KG 4621.1
Ultima-Flo AP liquid scintillation cocktail PerkinElmer Inc 6013599
Ultra-pure deionized water Milli-Q
Wrenchless WVS End Fitting Kit Hichrom Limited 4631-1001
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berridge, M. J., Irvine, R. F. Inositol Phosphates and Cell Signaling. Nature. 341 (6239), 197-205 (1989).
  2. Streb, H., Irvine, R. F., Berridge, M. J., Schulz, I. Release of Ca-2+ from a Nonmitochondrial Intracellular Store in Pancreatic Acinar-Cells by Inositol-1,4,5-Trisphosphate. Nature. 306 (5938), 67-69 (1983).
  3. Krinke, O., Novotna, Z., Valentova, O., Martinec, J. Inositol trisphosphate receptor in higher plants: is it real. Journal of Experimental Botany. 58 (3), 361-376 (2007).
  4. Kuo, H. F., et al. Arabidopsis inositol pentakisphosphate 2-kinase, AtIPK1, is required for growth and modulates phosphate homeostasis at the transcriptional level. Plant Journal. 80 (3), 503-515 (2014).
  5. Kuo, H. F., et al. Arabidopsis inositol phosphate kinases IPK1 and ITPK1 constitute a metabolic pathway in maintaining phosphate homeostasis. Plant Journal. 95 (4), 613-630 (2018).
  6. Gillaspy, G. E., Capelluto, D. G. S. . Lipid-mediated Protein Signaling. , 141-157 (2013).
  7. Stevenson-Paulik, J., Bastidas, R. J., Chiou, S. T., Frye, R. A., York, J. D. Generation of phytate-free seeds in Arabidopsis through disruption of inositol polyphosphate kinases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (35), 12612-12617 (2005).
  8. Lemtiri-Chlieh, F., MacRobbie, E. A. C., Brearley, C. A. Inositol hexakisphosphate is a physiological signal regulating the K+-inward rectifying conductance in guard cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (15), 8687-8692 (2000).
  9. Lee, H. S., et al. InsP6-sensitive variants of the Gle1 mRNA export factor rescue growth and fertility defects of the ipk1 low-phytic-acid mutation in Arabidopsis. Plant Cell. 27 (2), 417-431 (2015).
  10. Blüher, D., et al. A 1-phytase type III effector interferes with plant hormone signaling. Nature Communications. 8, (2017).
  11. Murphy, A. M., Otto, B., Brearley, C. A., Carr, J. P., Hanke, D. E. A role for inositol hexakisphosphate in the maintenance of basal resistance to plant pathogens. Plant Journal. 56 (4), 638-652 (2008).
  12. Poon, J. S. Y., Le Fevre, R. E., Carr, J. P., Hanke, D. E., Murphy, A. M. Inositol hexakisphosphate biosynthesis underpins PAMP-triggered immunity to Pseudomonas syringae pv. tomato in Arabidopsis thaliana but is dispensable for establishment of systemic acquired resistance. Molecular Plant Pathology. 21 (3), 376-387 (2020).
  13. Wild, R., et al. Control of eukaryotic phosphate homeostasis by inositol polyphosphate sensor domains. Science. 352 (6288), 986-990 (2016).
  14. Shears, S. B. Inositol pyrophosphates: Why so many phosphates. Advances in Biological Regulation. 57, 203-216 (2015).
  15. Shears, S. B. Intimate connections: Inositol pyrophosphates at the interface of metabolic regulation and cell signaling. Journal of Cellular Physiology. 233 (3), 1897-1912 (2018).
  16. Desai, M., et al. Two inositol hexakisphosphate kinases drive inositol pyrophosphate synthesis in plants. Plant Journal. 80 (4), 642-653 (2014).
  17. Laha, D., et al. VIH2 Regulates the Synthesis of Inositol Pyrophosphate InsP8 and Jasmonate-Dependent Defenses in Arabidopsis. Plant Cell. 27 (4), 1082-1097 (2015).
  18. Laha, D., et al. Arabidopsis ITPK1 and ITPK2 Have an Evolutionarily Conserved Phytic Acid Kinase Activity. Acs Chemical Biology. 14 (10), 2127-2133 (2019).
  19. Dorsch, J. A., et al. Seed phosphorus and inositol phosphate phenotype of barley low phytic acid genotypes. Phytochemistry. 62 (5), 691-706 (2003).
  20. Flores, S., Smart, C. C. Abscisic acid-induced changes in inositol metabolism in Spirodela polyrrhiza. Planta. 211 (6), 823-832 (2000).
  21. Brearley, C. A., Hanke, D. E. Inositol phosphates in barley (Hordeum vulgare L) aleurone tissue are stereochemically similar to the products of breakdown of InsP(6) in vitro by wheat-bran phytase. Biochemical Journal. 318, 279-286 (1996).
  22. Laha, N. P., et al. ITPK1-Dependent Inositol Polyphosphates Regulate Auxin Responses in Arabidopsis thaliana. bioRxiv. , (2020).
  23. Laha, D., et al. Inositol Polyphosphate Binding Specificity of the Jasmonate Receptor Complex. Plant Physiology. 171 (4), 2364-2370 (2016).
  24. Dong, J. S., et al. Inositol Pyrophosphate InsP(8) Acts as an Intracellular Phosphate Signal in Arabidopsis. Molecular Plant. 12 (11), 1463-1473 (2019).
  25. Zhu, J., et al. Two bifunctional inositol pyrophosphate kinases/phosphatases control plant phosphate homeostasis. Elife. 8, (2019).
  26. Couso, I., et al. Synergism between Inositol Polyphosphates and TOR Kinase Signaling in Nutrient Sensing, Growth Control, and Lipid Metabolism in Chlamydomonas. Plant Cell. 28 (9), 2026-2042 (2016).
  27. Ito, M., et al. Hydrophilic interaction liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the quantitative analysis of mammalian-derived inositol poly/pyrophosphates. Journal of Chromatography A. 1573, 87-97 (2018).
  28. Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Inositol Phosphates Purification Using Titanium Dioxide Beads. Bio-Protocol. 8 (15), (2018).
  29. Loss, O., Azevedo, C., Szijgyarto, Z., Bosch, D., Saiardi, A. Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates. Jove-Journal of Visualized Experiments. (55), e3027 (2011).
  30. Harmel, R. K., et al. Harnessing C-13-labeled myo-inositol to interrogate inositol phosphate messengers by NMR Electronic supplementary information (ESI) available. Chemical Science. 10 (20), 5267-5274 (2019).
  31. Azevedo, C., Saiardi, A. Extraction and analysis of soluble inositol polyphosphates from yeast. Nature Protocols. 1 (5), 2416-2422 (2006).
  32. Shears, S. B., Miller, G. J. . Inositol Phosphates: Methods and Protocols. , 1-28 (2020).
  33. Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Importance of Radioactive Labelling to Elucidate Inositol Polyphosphate Signalling. Topics in Current Chemistry. 375 (1), (2017).
  34. Stevenson-Paulik, J., et al. Inositol phosphate metabolomics: Merging genetic perturbation with modernized radiolabeling methods. Methods. 39 (2), 112-121 (2006).
  35. Liu, C., Riley, A. M., Yang, X., Shears, S. B., Potter, B. V. L. Synthesis and Biological Activity of d- and l-chiro-Inositol 2,3,4,5-Tetrakisphosphate: Design of a Novel and Potent Inhibitor of Ins(3,4,5,6)P4 1-Kinase/Ins(1,3,4)P3 5/6-Kinase. Journal of Medicinal Chemistry. 44 (18), 2984-2989 (2001).
  36. Hughes, P. J., Hughes, A. R., Putney, J. W., Shears, S. B. The regulation of the phosphorylation of inositol 1,3,4-trisphosphate in cell-free preparations and its relevance to the formation of inositol 1,3,4,6-tetrakisphosphate in agonist-stimulated rat parotid acinar cells. Journal of Biological Chemistry. 264 (33), 19871-19878 (1989).
  37. Shears, S. B., Kirk, C. J., Michell, R. H. The pathway of myo-inositol 1,3,4-trisphosphate dephosphorylation in liver. The Biochemical journal. 248 (3), 977-980 (1987).
  38. Stevenson-Paulik, J., Odom, A. R., York, J. D. Molecular and Biochemical Characterization of Two Plant Inositol Polyphosphate 6-/3-/5-Kinases. Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42711-42718 (2002).
  39. Stephens, L. R., Hawkins, P. T., Downes, C. P. An analysis of myo-[3H]inositol trisphosphates found in myo-[3H]inositol prelabelled avian erythrocytes. The Biochemical journal. 262 (3), 727-737 (1989).
  40. Saiardi, A., et al. Mammalian inositol polyphosphate multikinase synthesizes inositol 1,4,5-trisphosphate and an inositol pyrophosphate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (5), 2306 (2001).
  41. Azevedo, C., Burton, A., Bennett, M., Onnebo, S. M. N., Saiardi, A., Barker, C. J. . Inositol Phosphates and Lipids: Methods and Protocols. , 73-85 (2010).
  42. Saiardi, A., Caffrey, J. J., Snyder, S. H., Shears, S. B. The Inositol Hexakisphosphate Kinase Family: CATALYTIC FLEXIBILITY AND FUNCTION IN YEAST VACUOLE BIOGENESIS. Journal of Biological Chemistry. 275 (32), 24686-24692 (2000).
  43. Brearley, C. A., Hanke, D. E. Inositol phosphates in the duckweed Spirodela polyrhiza L. Biochemical Journal. 314, 215-225 (1996).
  44. Pollard, J. K., Steward, F. C., Shantz, E. M. Hexitols in Coconut Milk – Their Role in Nurture of Dividing Cells. Plant Physiology. 36 (4), 492 (1961).
  45. Donahue, J. L., et al. The Arabidopsis thaliana Myo-inositol 1-phosphate synthase1 gene is required for Myo-inositol synthesis and suppression of cell death. Plant Cell. 22 (3), 888-903 (2010).
  46. Desfougeres, Y., Wilson, M. S. C., Laha, D., Miller, G. J., Saiardi, A. ITPK1 mediates the lipid-independent synthesis of inositol phosphates controlled by metabolism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (49), 24551-24561 (2019).

Tags

Inositol PolyphosphatesRadiolabelingSAX-HPLCPlant MetabolismPlant DevelopmentExtractionQuantificationLotus SeedsMyo-inositolSample PreparationHPLC Setup

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Gaugler, P., Gaugler, V., Kamleitner, M., Schaaf, G. Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC. J. Vis. Exp. (160), e61495, doi:10.3791/61495 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image