El protocolo presentado aquí proporciona información sobre la electroencefalografía simultánea (EEG) y la evaluación del comportamiento en tiempo real. Hemos discutido todos los pasos involucrados en este protocolo como una solución atractiva para los investigadores en muchos campos de la neurociencia, particularmente en las áreas de aprendizaje y memoria.
La amplitud de las ondas cerebrales obtenida de la electroencefalografía (EEG) ha sido bien reconocida como una base para la capacidad cognitiva, la memoria y el aprendizaje en animales y humanos. El mecanismo de neurogénesis adulta también está relacionado con la mejora de la memoria y el aprendizaje. Tradicionalmente, los investigadores solían evaluar los parámetros de aprendizaje y memoria en modelos de roedores mediante tareas de comportamiento. Por lo tanto, el monitoreo simultáneo de los cambios de comportamiento y el EEG es particularmente interesante para correlacionar los datos entre la actividad cerebral y los comportamientos relacionados con las tareas. Sin embargo, la mayoría de los equipos necesarios para realizar ambos estudios son complejos, costosos o utilizan una red de configuración cableada que dificulta el movimiento de los animales naturales. En este estudio, el EEG se registró con un dispositivo de electrofisiología inalámbrico junto con la ejecución de una nueva tarea de reconocimiento de objetos (NORT). El comportamiento del animal fue monitoreado simultáneamente por un sistema de seguimiento de video. Ambas grabaciones se analizaron fuera de línea por sus marcas de tiempo que se sincronizaron para vincular las señales de EEG con las acciones del animal. Los sujetos consisten en ratas Wistar adultas después de un tratamiento de enriquecimiento ambiental a mediano plazo. Seis electrodos de tornillo de cráneo se fijaron en pares en ambos hemisferios sobre las regiones frontal, central y parietal y se hizo referencia a un electrodo ubicado en la parte posterior del hueso nasal. El protocolo NORT consiste en exponer al animal a dos objetos idénticos durante 10 min. Después de 2 h y 24 h, uno de los objetos fue reemplazado por uno novedoso. El tiempo de exploración de cada objeto fue monitoreado por un software de seguimiento del comportamiento (BTS) y el registro de datos de EEG. El análisis del EEG sincronizado con datos de comportamiento consiste en estimaciones de la potencia de banda relativa alfa y beta y comparaciones entre el reconocimiento de objetos novedosos frente a la exploración de objetos familiares, entre tres etapas experimentales. En este manuscrito, hemos discutido el proceso de fabricación de electrodos, la cirugía de implantación de electrodos epidurales, el protocolo de enriquecimiento ambiental, el protocolo NORT, la configuración BTS, el acoplamiento EEG – BTS para monitoreo simultáneo en tiempo real y el análisis de datos de EEG basado en la detección automática de eventos.
La prueba de comportamiento es crucial en la investigación en neurociencia para una gran cantidad de información generada en un contexto in vivo. En este sentido, los investigadores han estado utilizando ampliamente diferentes pruebas de comportamiento para analizar la función sensorio-motora, las interacciones sociales, el comportamiento similar a la ansiedad y depresivo, la dependencia de sustancias y diversas formas de funciones cognitivas1. El registro manual de las pruebas de comportamiento puede ser difícil, agotador e inexacto incluso para la mayoría de los observadores expertos. A pesar de que se han hecho algunos esfuerzos para desarrollar software libre y de código abierto para el registro del comportamiento (por ejemplo, la aplicación sexrat macho2 para el comportamiento sexual), varias alternativas permiten el registro automático y en tiempo real del comportamiento de diferentes especies animales, desde peces3 hasta roedores 4,5,6. El seguimiento de vídeo es un método valioso para la grabación rápida y precisa del comportamiento utilizado en una amplia variedad de aplicaciones7. Una característica más potencial en el área de registro del comportamiento es explorar la actividad neuronal durante la manifestación del comportamiento. El registro simultáneo de la actividad neuronal (desde células individuales hasta las principales áreas cerebrales) y tareas conductuales podría mostrarnos cómo el cerebro genera patrones de comportamiento específicos8. Los comportamientos son una secuencia de componentes menores que podrían revelar correlaciones entre la actividad neuronal y los movimientos o acciones. Si la actividad neuronal y los patrones de comportamiento pudieran registrarse simultáneamente a través de múltiples escalas de tiempo, podrían explicar cómo cada estado cerebral se correlaciona con cada comportamiento particular (para un examen más profundo del registro del comportamiento, consulte Datta et al., revisión8 de 2019). Por lo tanto, el registro sincronizado de la actividad conductual y neuronal a la escala deseada (desde neuronas hasta grandes áreas del cerebro) se considera una herramienta extremadamente útil. Existen varios sistemas destinados a integrar registros conductuales con otras mediciones como la actividad neuronal 4,5.
Aunque la electroencefalografía es considerada una de las técnicas más utilizadas en el campo de la neurociencia clínica y de investigación, la movilidad relativamente alta, así como el tamaño del dispositivo de registro de EEG, hace que esta técnica sea única y desafiante para la detección en el caso de modelos in vivo9. Se han desarrollado algunas soluciones a este problema, por ejemplo, el uso de cables y dispositivos giratorios que permiten a los animales moverse libremente en la arena. Sin embargo, los sistemas basados en cables a menudo imponen problemas para realizar estudios, por ejemplo, durante la transferencia de un animal de una jaula a otra, se observa un obstáculo o enredo del animal con los cables. Se han desarrollado dispositivos telemétricos para grabaciones electrofisiológicas inalámbricas para aumentar la flexibilidad de la situación de registro10,11. Sin embargo, estos sistemas han mostrado limitaciones considerables debido a su bajo número de canales de grabación y bajas frecuencias de muestreo11. En este estudio, utilizamos un sistema inalámbrico disponible comercialmente que envía señales de EEG del animal a través de una conexión Wi-Fi con un sistema de roedores que se mueve libremente12. El aparato pesa 6 gramos y soporta hasta 16 canales registrados a 1 kSps. Este sistema permite el registro de EEG o picos en el entorno animal, con una perturbación reducida, sirviendo como una solución económica en comparación con los sistemas electrofisiológicos tradicionales en el mercado. Además, hemos sincronizado estos datos utilizando un software de seguimiento de video para proporcionar correlación entre EEG y patrones de comportamiento. Esta sincronización se realiza fuera de línea mediante la alineación e interpolación de datos y eventos en función de las marcas de tiempo generadas por ambos sistemas y se procesa en MATLAB.
La neurogénesis adulta se define como la proliferación, supervivencia y diferenciación en neuronas de células recién generadas en el giro dentado de animales13,14. Se sabe que este proceso está asociado con la mejora de la memoria y el aprendizaje, lo que aumenta la neurogénesis adulta en roedores a través de condiciones de ambiente enriquecido (EE)15. La EE consiste en alojar roedores en pequeños grupos dentro de una gran jaula provista de juguetes y tubos, donde los animales tienen novedad y complejidad pero sin relevancia biológica15. Aunque la EE estimula la neurogénesis del hipocampo, también varía en muchos factores, como la edad, la tensión animal, las condiciones de estimulación específicas o el procedimiento de detección de neurogénesis. En ratones de mediana edad expuestos al alojamiento de EE durante siete días, se ha reportado el nacimiento de nuevas células granulares (GC) en el giro dentado del hipocampo (DG)16. Los estudios que intentan extirpar selectivamente la neurogénesis adulta en ratas adultas han sugerido que se requieren nuevas células granulares de aproximadamente 1 a 2 semanas de edad en la respuesta aprendida17. Alrededor de 2 o 3 semanas después del nacimiento de la GC en adultos DG, comienzan a aparecer varios rasgos característicos, como las espinas dendríticas, que son esenciales para la transmisión sináptica excitatoria18. Zhao et al. realizaron un análisis cuantitativo para mostrar que el pico de crecimiento de la columna vertebral ocurre durante las primeras 3 – 4 semanas19. Varios estudios electrofisiológicos in vivo sugieren que sólo tres semanas de condiciones de alojamiento EE producen alteraciones en la transmisión sináptica del DG y aumentan la excitabilidad celular20. Además, se ha informado que la exposición a un ambiente enriquecido a las 1-4 semanas después de las inyecciones de BrdU aumentó significativamente la densidad de las células BrdU / NeuN en la capa granular DG en ratones21. Estos autores sugieren que existe un período crítico entre una y tres semanas después de la exposición a EE, ya que se observó un aumento sustancial en el número de nuevas neuronas21. Los estudios de neurogénesis del hipocampo adulto (AHN) en humanos han sido controvertidos ya que no hubo evidencia directa. Sin embargo, un informe reciente describió las etapas de desarrollo de la AHN en el cerebro humano adulto, identificando miles de neuronas inmaduras en la DG, y demostrando así la importancia de la AHN durante el envejecimiento en humanos22. Sobre la base de la evidencia mencionada anteriormente, el estudio de la AHN en modelos animales es más importante que nunca (para un examen más profundo de la AHN, véase Leal-Galicia et al., revisión15 de 2019).
Como se mencionó anteriormente, el hipocampo se ha relacionado con una función fundamental en las capacidades de aprendizaje y memoria. La formación de memorias pasa por tres procesos distintos: codificación (adquisición de memoria), consolidación (almacenamiento de memoria) y recuperación (reconocimiento de memoria)23. La memoria de reconocimiento en humanos se prueba utilizando la tarea24 de comparaciones pareadas visuales. Los fundamentos de los modelos humanos y animales de memoria y amnesia son las pruebas de comportamiento que evalúan la capacidad de reconocer un estímulo previamente presentado25,26, como lo hace la tarea de comparaciones visuales pareadas en humanos. Por lo tanto, una de las pruebas de comportamiento más utilizadas para evaluar la capacidad de un roedor para reconocer un estímulo previamente presentado, es decir, la capacidad de aprendizaje y memoria es la tarea espontánea de reconocimiento de objetos novedosos (NORT)23,27. El protocolo NORT consiste en dos objetos novedosos idénticos en un ámbito familiar durante 10 minutos en la prueba de adquisición. Después de un tiempo específico entre 0 28 y48 horas29 (tiempo variable según cada protocolo), el animal es devuelto a la misma arena que contiene uno de los mismos objetos familiares y un objeto novedoso. El animal explora espontáneamente el objeto novedoso si el objeto familiar fue memorizado26. La relación de preferencia se utiliza comúnmente para evaluar el rendimiento de la exploración. Se determina dividiendo el tiempo total de exploración del objeto del tiempo de exploración del objeto nuevo o familiar. El NORT tiene algunas ventajas sobre otras pruebas de memoria de reconocimiento. Lo más importante es que no requiere motivación externa, recompensa o castigo. No genera condiciones estresantes. Finalmente, no se necesita entrenamiento para evocar el comportamiento de explorar los objetos (para un examen más profundo de NORT, ver ref.23).
Por lo tanto, el registro simultáneo de múltiples modalidades de datos y su integración en el estudio del aprendizaje y la memoria, como efecto de la neurogénesis del hipocampo adulto, es muy atractivo y proporciona una solución convincente para los investigadores en el campo. El presente trabajo expondrá todos los procesos involucrados en la evaluación simultánea del seguimiento de video conductual (tarea de reconocimiento de objetos novedosos) y la grabación inalámbrica de electroencefalografía. Aquí hemos revisado el proceso de fabricación de electrodos, la cirugía de implantación de electrodos epidurales (tornillo de cráneo), el protocolo de enriquecimiento ambiental (para la inducción de neurogénesis del hipocampo), siguiendo el protocolo NORT, la configuración BTS, el acoplamiento EEG – BTS para la monitorización simultánea en tiempo real, y el análisis de datos de EEG y comportamiento ejecutados en el entorno informático MATLAB.
La investigación conductual y de electroencefalografía es difícil y desafiante por naturaleza. Por lo tanto, la combinación de ambas técnicas presenta pasos críticos significativos. Por lo tanto, ambas técnicas concurrentes no se utilizan ampliamente. En la práctica real, cada grupo en todo el mundo realiza pruebas de comportamiento con condiciones especiales, como animales, parámetros analizados o tratamientos. Lo anterior crea controversias significativas en el campo y la necesidad de desarrollar procedimientos estándar disponibles para todos. Aquí, hemos preparado este procedimiento detallado con todos los pasos críticos y consideraciones metodológicas que generalmente no se describen o mencionan en la mayoría de los artículos publicados. Estos se discuten a continuación.
La producción de los materiales necesarios es un paso fundamental en el éxito de esta técnica. En este sentido, el electrodo debe construirse desde cero utilizando tornillos de acero inoxidable, cables de cobre y soldador de plata. Estos materiales son difíciles de soldar entre sí de forma permanente, de tal manera que la conductividad y la resistencia de cada electrodo deben verificarse antes de su uso. Es posible utilizar otro tipo de cable para el conjunto del electrodo; Sin embargo, el cobre es lo suficientemente flexible como para manipular el electrodo para insertarlo en el conector del amplificador. En este sentido, el uso de electrodos comerciales es deseable, pero su adquisición podría ser complicada y costosa. La cirugía es uno de los pasos más críticos en este protocolo. Es muy recomendable e incluso necesario contar con un cirujano experimentado, especialmente para la implantación de electrodos. Dado que la cirugía con frecuencia requiere alargar el tiempo de anestesia y, a veces, una aplicación de soldadura durante la cirugía, cada laboratorio debe realizar las pruebas necesarias con la anestesia adecuada (se pueden usar diferentes cócteles) para cada cepa de roedores, particularmente en condiciones de vivero, diferencias entre camadas e incluso diferencias individuales entre animales. La planificación y consideración adecuadas podrían evitar la pérdida de animales durante las cirugías. La implantación de electrodos es otro paso crucial. Requiere mucho cuidado para evitar golpear el cráneo y dañar las meninges o el tejido cerebral. Los tornillos deben colocarse correctamente, es decir, completamente fijados en el cráneo, de lo contrario, el ruido y los artefactos se presentarán en las señales, como las relacionadas con una pésima colocación o movimiento que no utiliza la grabación del EEG. El tratamiento y las condiciones pre y postoperatorias siempre deben realizarse y observarse para evitar el sufrimiento del roedor. La lidocaína subcutánea se puede usar en la piel de la cabeza antes de hacer la incisión con el bisturí. Una gota de solución salina en los ojos del animal ayudará a prevenir la sequedad. Además, se debe administrar una solución salina en la boca, y después de la cirugía, se debe administrar 1 ml por vía subcutánea o intraperitoneal para compensar el equilibrio de líquidos del animal y prevenir la deshidratación. Inmediatamente después de la cirugía, se debe administrar un medicamento antiinflamatorio (para reducir el dolor), así como antibióticos a través de antibióticos subcutáneos o tópicos, directamente en la periferia del cuero cabelludo donde se encuentra la tapa de cemento dental (para disminuir la probabilidad de infección). Repita el procedimiento anterior 24 h después de la cirugía. El posicionamiento del amplificador de EEG en la espalda del animal es la principal dificultad para la grabación simultánea. El diseño y la fabricación de un chaleco se basan específicamente en el tamaño de los animales. El chaleco debe permitir el movimiento natural del roedor (ver Figura 5). Esto último garantizará la principal ventaja de la técnica, que es el registro de movimientos libres. Dado que los animales no intentaron quitarse el chaleco, el conector de la cabeza o los cables después de la cirugía y durante los días posteriores, se presume que la configuración no generó restricción de movimiento significativamente ni causó dolor o incomodidad. Para una correcta segmentación del EEG en épocas basada en eventos marcados por el BTS es obligatorio anotar un protocolo bien definido. Las marcas temporales podrían combinarse mediante manipulación de series temporales porque ambos sistemas utilizan el mismo reloj para configurar sus marcas de tiempo. Lo anterior amplía las posibilidades de experimentación animal incorporando datos electrofisiológicos para su análisis.
La técnica aquí presentada se puede utilizar en cualquier área de investigación en neurociencia y con las especies murinas más comunes e incluso otras especies. La versatilidad del software de seguimiento de comportamiento es una de las ventajas más significativas, ya que podría usarse en una gran versatilidad de laberintos como el laberinto de agua Morris, campo abierto, reconocimiento de objetos novedosos, preferencia de lugar condicionado, tablero de agujeros, laberinto elevado plus, laberinto en Y, laberinto de brazo radial, laberinto de Barnes y otros. Se pueden utilizar hasta 16 cámaras simultáneamente. Además, se pueden informar cientos de medidas diferentes (para obtener información más detallada, consulte los manuales31,32). Tenga en cuenta que este trabajo describe la experimentación para grabaciones de EEG, algunas otras técnicas como los potenciales de campos locales o la grabación de una sola unidad son posibles. Sin embargo, los usuarios deben tener en cuenta que la configuración general y varios pasos preparatorios deben cambiar para otros fines. Entonces, cuando esta técnica se usa junto con la grabación de EEG Wi-Fi, las posibilidades se amplían, porque agrega nuevas perspectivas a estudios en animales como los realizados en seres humanos para evaluar varias características de la integración y dinámica del EEG, como la conectividad, la potencia de la banda EEG o las respuestas evocadas. A diferencia de los seres humanos, la experimentación animal es posible para evaluar la administración de fármacos, modificaciones genéticas o expresión, entre muchos otros paradigmas experimentales. Para el análisis de EEG, considere que algunos protocolos tienen un número muy bajo de repeticiones de los comportamientos deseados, lo que restringe la posibilidad de promediar respuestas y obtener resultados confiables. Por lo tanto, tenga cuidado de diseñar los protocolos de grabación y análisis que se considera realizar antes de comenzar el experimento. Sin embargo, debe contemplarse que trabajar en experimentación animal no es posible para evitar el movimiento, aumentando la complejidad del protocolo experimental y las consideraciones para el análisis de señales y tareas conductuales. Actualmente, los equipos para sistemas completos de seguimiento y grabaciones de EEG no están estandarizados ni modulares, lo que significa que su configuración está destinada a un solo protocolo y adaptaciones para explorar otras tareas de comportamiento, lo que implica / sugiere mayores costos para un gran número de laboratorios. Esta situación podría resolverse siguiendo las opciones explicadas en este estudio. Sin embargo, se podrían realizar varias mejoras para experimentos más confiables. El trabajo se puede mejorar en varios pasos, desde la fabricación de electrodos hasta el procesamiento de señales y comportamiento. No obstante, está demostrado que el seguimiento de animales y la adquisición de EEG son posibles utilizando una configuración asequible de alta tecnología pero económica.
En resumen, el presente trabajo es un intento de ayudar a los científicos, particularmente en el campo de las neurociencias, a poder utilizar estas dos técnicas que no se usan comúnmente en combinación. La técnica de grabación simultánea de EEG y pruebas de comportamiento utilizando software de seguimiento del comportamiento tiene muchas ventajas, y puede ser particularmente útil en muchos campos de la neurociencia, particularmente en áreas de aprendizaje y memoria. Teniendo en cuenta que este equipo tiene otras capacidades como un registro profundo de estructuras subcorticales como el hipocampo, pero como se mencionó, varios pasos preparatorios cambiarán. Los equipos inalámbricos resuelven casi todas las limitaciones de un enfoque de cable convencional, como los problemas de movilidad de los animales de una jaula a otra, los animales obstaculizados o enredados con los cables. Esta técnica de configuración es fácil de usar, como se describió anteriormente, y un grupo de expertos o individuos casi no capacitados o no especializados puede usar este software. El precio del equipo de EEG es más bajo que un amplificador de EEG regular. El software de seguimiento del comportamiento es también uno de los programas más asequibles para el seguimiento de video en el mercado. Este software requiere licencias anuales. El equipo se puede utilizar en más de una configuración experimental, diferentes animales y el tipo de versatilidad. Esperamos que este esfuerzo ayude a la comunidad científica y proporcione un fácil acceso para estudiar simultáneamente el comportamiento y la electroencefalografía.
The authors have nothing to disclose.
Queremos agradecer al Sr. Miguel Burgos y al Sr. Gustavo Lago por brindar asistencia técnica. Agradecemos a Stoelting Co. por cubrir los costos de producción de video, Jinga-hi, Inc. por brindar asistencia técnica, y a la División de Investigación y Posgrado de la Universidad Iberoamericana Ciudad de México por otorgar fondos para este trabajo.
#2 Variable speed rotary tool tip | Reorder #310048, Lenght 44.5mm | SS White | For making the holes where the screws will be inserted |
#4 Scalpel and blade | |||
50 X 50 X 50 cm Open Field Black Mate Arena | |||
8 pin Receptacle Housing Female | Amphenol FCI | 10147606-00008LF | |
8 pin Receptacle Housing Male | Amphenol FCI | 10147603-00008LF | |
Acrylic Resin | MDC Dental | NicTone | For fixating the screws to the skull |
ANY-maze video tracking software | Stoelting, Co. | version 6.1 | http://www.anymaze.co.uk/) |
benzalkonium chloride antiseptic solution | Benzal | Benzal | |
Bulldog clamps | Cientifica VelaQuin | For retracting the skin | |
Camera | Logitech | c920 | |
Copper wire | |||
Crimp contact | Amphenol FCI | 10147604-01LF | |
DELL PC | DELL | ||
Electrode | |||
JAGA16 | Jinga-Hi, Inc. | JAGA16 | |
Ketamine | PiSA Agropecuaria | ANESKET | For anesthesia |
MATLAB | R2020a | MathWorks | Script was develop ped in collaboration with Jinga-Hi, Inc. |
Monomer | MDC Dental | NicTone | For fixating the screws to the skull |
Neurophys software | Jinga-Hi, Inc./ Neurosys, LLC | Neurosys 3.0.0.7 | |
Screwdrive | For inserting the screws into the skull | ||
Screws | |||
Screws equiped with electrode | |||
Stereotaxic instrument | KOPF | For the surgery | |
Variable speed rotary tool | Dremel 3000 | Dremel | For making the holes where the screws will be inserted |
Voltmeter | PROAM | MUL-040 | For confirming that the electrode conducts electricity |
Xilazine | PiSA Agropecuaria | PROCIN | For anesthesia |