Na⁺/K⁺ 泵对节奏爆裂的贡献，通过建模和动态夹紧分析探索

注：无脊椎动物实验科目不受NIH或埃默里和佐治亚州立大学的监管。尽管如此，我们还是采取了所有措施，尽量减少这项工作中使用的水痘的痛苦。 1. 从水痘神经线准备孤立的结石 7 在 12：12 光暗循环中以 16 °C 在去电离水中稀释的人工池塘水中（含 0.05% w/v 的海盐）中保持水痘Hirudo verbana。 将水痘冷麻醉在碎冰床上>10分钟，直到不动，为解剖做好准备。 将一个黑色树脂衬里解剖盘填充到 ±1 厘米的深度，在去电离水中含有 115 mM NaCl、4 mM KCl、1.7 mM CaCl2、10mM D-葡萄糖和 10 mM HEPES 的冷藏盐水;ph 调整为 7.4 与 1 M Naoh 。将水痘背侧固定在黑色树脂衬里室（至少 20 厘米 x 10 厘米，深度至少比树脂高 2 厘米，至少 2 厘米厚）。 在20倍放大的体质显微镜下，用斜光引导照明，用5毫米弹簧剪刀穿过身体1/3部分 的体壁，使纵向切割至少3厘米长。使用别针拉开身体壁，暴露内部器官。注：任何储存的血餐都可以通过用火抛光巴斯德移液器吸走。 孤立单个中体结节7（第七个自由段结节烧结到大脑）。 使用 5 mm 弹簧剪刀打开神经线所在所在鼻窦。一定要将鼻窦以圆周方式分裂，并通风留下两条鼻窦。使用锋利的 #5 钳子帮助引导切割和保持鼻窦。 将鼻窦附着在结石中产生的两个双边神经根（它紧紧粘附于每个根部）上，用这些鼻窦条固定结石。 通过切割连接结肠（尽可能远离第 7束结石）和鼻窦条的结肠和结肠结扎神经束，从体内取出结石，然后横向切开根部，直线切至从鼻窦中浮出的位置。 用缩短的细小昆虫针固定结石（使用旧钝化 #5 钳），在透明树脂衬里培养皿中将腹腔向上。将针脚插入鼻窦条和松散组织，粘附在根部以及椎骨和花椰菜结缔上，尽可能远离结石。注：如果在录制过程中要从下面获得良好的照明，树脂的厚度不得小于 3 毫米。确保结石是绷紧的，无论是纵向还是横向 将立体显微镜的放大倍数提高到40倍或更高，并调整倾斜照明，使神经元细胞体在腹膜正下方的结石的腹腔表面上很容易看到。 用微丝器去除结石（去皮）的内膜。 开始除套，在一侧的根部之间切割松动的护套，然后横向切开另一侧，确保剪刀刀片表面，不会直接伤害护套下方的神经元细胞体。 从中线的横切中做出类似的表面切口。 现在用细#5钳子抓住护套的腹腔皮瓣，把它从结石上拉开，然后用微丝刀切断它。 在另一侧重复;此过程暴露了两个HN（7）神经元，用于用微电极进行记录。 将制备盘放在录制设置中，并在室温下以 5 mL/min 的流量超盐水。 2. 用锋利的微电极识别和记录水痘心脏内膜 在 HN（7） 神经元（记录持续 30 到 60 分钟）期间，通过数字数据采集（模拟到数字、A 到 D）和刺激（数字到模拟、D 到 A）系统，以 5 kHz 的速度从神经生理电流采样中获取和数字化细胞内电流和电压痕迹， 并在计算机屏幕上显示。注：任何商业或定制软件和 A 到 D/D 到 A 板可用于数据采集（A 到 D）。动态夹具需要 D 到 A 和自定义软件。 在50-100x的恒河镜下，从下面暗场照明，初步确定一个HN（7）神经元的双边对的规范位置，在后体结石七的后部位置。 现在的目标是使用微操纵器，用充满2M醋酸钾和20mM KCl的锐利微电极穿透假定的HN（7）神经元。 将微电极放置在目标细胞体附近。 持续观察电表记录的电位，并在穿透神经元之前将该电位设置为 0 mV。 通过微电极慢慢地将电极沿着其长轴与操纵器一起驱动，从而穿透神经元。使用电表嗡嗡声功能，设置为 100 ms 嗡嗡声持续时间，直到观察到膜电位的负变化和剧烈的尖刺活动。 将电表设置在不连续电流夹模式 （DCC） ≥ 3 kHz，以同时记录膜电位并通过电流与单微电极（容量补偿设置为略低于振铃，然后拨回 10%）。 在示波器上监视 DCC 期间电极的沉降。 用电表稳定电流喷油器注入 -0.1 nA 的稳定电流一两分钟，以稳定记录。 通过其特有的尖峰形状和弱爆裂活动（图1Ci）确定HN（7）神经元。 实验完成后，在离线执行任何数据分析，并将所有数据保存在磁盘上。 3. 构建实时HN或其他模型神经元 使用数字信号处理板 （DSB） 构建自定义软件：D 到 A 和 A 到 D） 在桌面计算机中实时实现2、4或其他神经元或实验中描述的模型电流。 使用霍奇金-赫克斯利风格方程，因为它们是代表模型电流的通常首选方法。 请参阅7， 详细描述在添加泵电流之前实时 HN 模型和动态夹具的实现情况。请参阅介绍部分，介绍 HN 模型中活HN （7） 神经元的电流、细胞内 Na+ 浓度和导电。 4. 实现和改变动态夹导电导电/电流 使用 DSB 定制的动态夹紧软件，实时实现和更改任何图形用户界面 （图 3）（GUI） 可访问的 HN（7） 神经元 HN 实时模型的编程导电和电流。注：作为提醒， 是持久纳电 流（IP）和最大泵电流（I泵）的最大传导率。 使用软件中的 GUI 输入框在模型运行时，在 （PumpMaxL 框）和 （GpinHNLive 框） （图 3）中进行更改。注：GUI 输入框接受键入值，建议使用 0.1 nA 的步骤，并建议 1 nS 的步骤。 添加少量 和 动态夹子，以稳定HN（7）神经元的爆裂，该神经元被微电极引起的泄漏削弱，如图 1Cii所示。注：锐利的微电极渗透会导致膜损伤，表现为泄漏传导性增加或输入电阻降低。 首先添加 0.1-0.2 nA 值，它弥补了微电极诱发的泄漏，但抑制了兴奋性，然后逐渐增加 ，这增加了兴奋性，直到定期爆裂，通常在 +1-4 nS （图 4A）。 系统地将这些电流（增量为0.1 nA 表示，1 nS为 ）与动态夹子记录的HN（7）神经元（图3）共同变化，并评估它们对爆裂特性的影响：峰值频率（f：爆发期间间尖峰间隔平均值的对等）、爆发间隔（IBI：一次爆发中最后一个峰值到下一次爆发中第一个峰值之间的时间）， 爆裂持续时间（BD：在突发中的第一个峰值和在突发中的最后一个峰值之间的时间）和爆发周期（T：在突发中的第一个峰值和随后的爆发中第一个峰值之间的时间）。 改变价值 ，像视频演示一样，熟悉技术，然后冒险出去。 以特定的固定值保持，并在一系列 支持定期爆裂活动时以 1 nS 增量扫描。 现在将固定值增加 0.1 nA，并再次扫过一系列 支持常规爆裂活动。 对于每个实施的参数对，收集包含至少 8 次突发的数据，以便制定可靠的平均测量值 f、IBI、BD 和 T。 继续扫荡，只要神经元仍然可行，通过强尖刺和稳定的振荡基线潜力来评估。 从几个神经元（来自不同的动物）收集数据，生成复合图（图5）。