Contribution of the Na<sup>+</sup>/K<sup>+</sup> Pump to Rhythmic Bursting, Explored with Modeling and Dynamic Clamp Analyses

Ricardo  Javier Erazo-Toscano; Parker  J. Ellingson; Ronald  L. Calabrese; Gennady  S. Cymbalyuk

doi:10.3791/61473

JoVE Journal > Biology

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

생물학

مساهمة Na⁺/ K⁺ مضخة لانفجار الإيقاعي ، واستكشافها مع النمذجة وتحليلات المشبك الديناميكي

Published: May 09, 2021

doi:

10.3791/61473

Ricardo Javier Erazo-Toscano^1,2, Parker J. Ellingson², Ronald L. Calabrese*¹, Gennady S. Cymbalyuk*²

¹Department of Biology,Emory University, ²Neuroscience Institute,Georgia State University

Summary

هنا هو وسيلة للتحقيق في أدوار Na⁺/ K⁺ مضخة ومستمرة Na⁺ الحالية في interneurons القلب باستخدام المشبك الديناميكي.

Abstract

وNa⁺/ K⁺ مضخة, غالبا ما يعتقد من كدالة خلفية في نشاط الخلايا العصبية, يساهم التيار الخارجي (أنا_مضخة) التي تستجيب للتركيز الداخلي من نا⁺ ([نا⁺]_أنا). في انفجار الخلايا العصبية, مثل تلك الموجودة في مولد نمط مركزي (CPG) الشبكات العصبية التي تنتج الحركات الإيقاعية, [نا⁺]_أنا، وبالتالي أنا_مضخة, يمكن أن يتوقع أن تختلف طوال دورة انفجار. هذه الاستجابة للنشاط الكهربائي ، جنبا إلى جنب مع الاستقلال عن إمكانات الأغشية ، وهبت أنا_ضخ مع خصائص ديناميكية ليست شائعة في التيارات القائمة على القناة (على سبيل المثال ، الجهد أو أجهزة الإرسال بوابات أو تسرب القنوات). وعلاوة على ذلك، في العديد من الخلايا العصبية، يتم تعديل نشاط المضخة من قبل مجموعة متنوعة من المغيرات، وزيادة توسيع الدور المحتمل أنني_ضخ في النشاط الانفجار الإيقاعي. هذه الورقة تبين كيفية استخدام مزيج من النمذجة وطرق المشبك الديناميكي لتحديد كيفية _ضخ وتفاعلها مع نا^{المستمرة +} النشاط الإيقاعي التأثير الحالي في CPG. على وجه التحديد ، ستركز هذه الورقة على بروتوكول المشبك الديناميكي وطرق النمذجة الحسابية في الطفيليات القلبية من ال علقات طبية.

Introduction

ويقود ضربات القلب في الشقوق من قبل CPG تتكون من 9 أزواج ثنائية من interneurons القلب (HNs) موزعة عبر العديد من العقدة نصف الجسم مجزأة. في قلب CPG هي أزواج مثبطة للطرفين من interneurons تقع في^{3 rd} و^{4 العقدة} القطاعية التي تشكل مذبذبات نصف المركز (HCOs) (الشكل 1A). هذه الخلايا العصبية تستمر في الانفجار عندما معزولة بشكل متشابك الدوائية باستخدام بيكوكلين¹. البعض الآخر، مثل الزوج في العقدة القطاعية⁷ (محور هذا البروتوكول)، هي أيضا الانفجارات، وقادرة على إنتاج النشاط انفجار عندما معزولة متشابك. فهي ليست متصلة بشكل متبادل وتتلقى مدخلات تنازلية فقط ، وبالتالي يتم عزلها بسهولة عن طريق قطع العقدة عن بقية الحبل العصبي. هذا النشاط انفجار مستقلة حساسة لإدخال تسرب التيار الناجم عن الاختراق مع microelectrodes حادة للتسجيل ولكن انفجر بقوة عندما سجلت مع طرق التصحيح^{فضفاضة 1}.

وقد تم على غرار كل من الخلايا العصبية HN الفردية وHHN HCOs (هودجكين-هكسلي القائم على نماذج مقصورة واحدة متساوية الوعاء من الخلايا العصبية HN التي تحتوي على جميع التيارات ذات بوابات الجهد متشابك حددت تجريبيا)، وجميع خصائص انفجار النظام الحي قد استولت بنجاح². Myomodulin، وهو الببتيد العصبي الذاتية في الكراث، يقلل بشكل ملحوظ من الفترة (T) من إيقاع انفجار الخلايا العصبية HN معزولة وHCOs HN. هذا المغير يعمل على زيادة ح الحالية (فرط الاستقطاب تنشيط التيار الداخلي، وأنا_ح) وانخفاض أنا_ضخ³. أدت هذه الملاحظة إلى استكشاف كيفية _ضخ يتفاعل مع I_h، وكيف يساهم التعديل المشترك في النشاط الإيقاعي للخلايا العصبية HN. تفعيل المضخة عن طريق زيادة [Na⁺]_ط (باستخدام monensin ionophore) بسرعة إيقاع انفجار HN في كل من HCOs HN والخلايا العصبية HN معزولة⁴. وكان هذا الإسراع تعتمد على I_h. عندما تم حظر _ح (2 MM CS⁺)، لم يتم تغيير فترة الانفجار من قبل هذه الطريقة من تنشيط المضخة. ومع ذلك، تم تقليص مدة انفجار (دينار) ، والفاصل الزمني بين الانفجار (IBI) زيادة في كل من HCOs HN والخلايا العصبية HN معزولة⁴.

لهذا البروتوكول، يتم دمج جميع التيارات من الخلايا العصبية HN المعيشة (7)، بما في ذلك مضخة الحالية، وأنا_مضخة،في نموذج HN على النحو التالي:

(1)

حيث C هو سعة الغشاء (في nF)، V هو احتمال الغشاء (في V)، ر هو الوقت (في ق). وقد وصفت الأوصاف والمعادلات الأيونية الحالية مفصلة في مكان آخر²^،⁴. كامل HN نموذج الخلايا العصبية يعمل في الوقت الحقيقي (الشكل 2). سيتم توفير البرنامج على GitHub عند نشره وسيكون مناسبا للعمل على لوحة معالجة الإشارات الرقمية الموضحة في جدول المواد. هنا ، فإن محور التحقيق هو Na⁺/ K⁺ مضخة التيار (أنا_مضخة) والتيارات ذات بوابات الجهد المساهمة كبيرة نا⁺ تدفق : نا سريع⁺ الحالية (أنا_نا) ومستمرة نا⁺ الحالية (أنا_ف). التوصيلات القصوى لهذه التيارات هي على التوالي. وNa⁺/ K⁺ مضخة التبادلات ثلاثة داخل الخلية Na⁺ الأيونات لاثنين من خارج الخلية K⁺ الأيونات، وبالتالي إنتاج تيار صافي إلى الخارج. الأهم من ذلك، فإنه يضخ 3 أضعاف نا⁺ من الخلايا العصبية كما يشير هذا التيار، وهو أمر مهم لحساب Na داخل الخلية⁺ التركيز.

يعتمد تيار المضخة Na⁺K⁺ على تركيزات Na⁺ داخل الخلية ويتم التعبير عنه من خلال الدالة السينية التالية:

(2)

حيث [نا]_أنا هو داخل الخلية Na⁺ التركيز، هو أقصى نا⁺/ ك⁺ مضخة الحالية، [Na]_ih هو Na^داخل الخلية + تركيز لنصف تنشيط Na⁺/ K⁺ مضخة، و [Na]_هو حساسية Na⁺/ K⁺ مضخة إلى [Na]_i. [Na]_أنا يبني نتيجة للنا⁺ التدفقات التي يحملها أنا_P وأنا _نا ويتناقص من قبل Na⁺ efflux من Na⁺/ K⁺ مضخة. مساهمة أنا ح وأنا_تسرب إلى مجموع Na⁺ تدفق صغيرة ولا يعتبر في النموذج في الوقت الحقيقي.

(3)

حيث، v هو حجم (~ 6.7 pL) من خزان Na⁺ داخل الخلية، F هو ثابت فاراداي، ويتم الاحتفاظ بتركيز Na⁺ خارج الخلية ثابتا.

وقد تم التفريق بين التيارات ذات بوابات الجهد وتسرب هذه الاستجابة لإمكانات الغشاء – من تيار المضخة، الذي ينظمه Na داخل الخلية^{محسوبة +} تركيز ([Na⁺]_i). [نا⁺] _أنا تراكمت من خلال Na⁺ الدخول عبر نا سريع⁺ الحالي (أنا_نا) التي تنتج إمكانات العمل (المسامير) ونا^{المستمرة +} الحالية ( I_P) التي توفر إزالة الاستقطاب لدعم spiking. [نا⁺] _أنا ، بدوره ، خفضت من خلال عمل المضخة من خلال البثق من نا⁺. وقد افترض القيم HN المعيشة خط الأساس من (5nS) و (150 nS)، ونحن نأخذ في الاعتبار أي المشبك الديناميكي المضافة .

الهدف من البروتوكول الموصوف هنا هو التلاعب أنا_ضخ بدقة وعكسي في الوقت الحقيقي لاكتشاف كيف يتفاعل مع التيارات ذات بوابات الجهد (نا^{المستمرة +} الحالية في البروتوكول الحالي) للسيطرة على الانفجار الإيقاعي في HNs واحد. ولتحقيق هذا الهدف، تم استخدام المشبك الديناميكي، الذي يقدم بشكل مصطنع، بناء على الأمر، كمية دقيقة من أي تيار يمكن حسابه أثناء تشغيل النموذج. هذه الطريقة لها مزايا على التلاعب الدوائي للمضخة ، والتي تؤثر على الأنسجة بأكملها ، يمكن أن يكون لها آثار خارج الهدف التي غالبا ما يصعب عكسها ، ولا يمكن التلاعب بها بدقة. المشبك الديناميكي⁵^،⁶ يقرأ الجهد من الخلايا العصبية المسجلة في الوقت الحقيقي ( الشكل1B) ويحسب ويحقن ، في الوقت الحقيقي ، ومقدار أي تيار على أساس معادلات النموذج والقيم المحددة لأي أو . ويمكن بسهولة تطبيق أساليب مماثلة على أي الخلايا العصبية التي يمكن تسجيلها داخل الخلايا. ومع ذلك، يجب إعادة قياس المعلمات إلى الخلايا العصبية المختارة، وينبغي عزل الخلايا العصبية من المدخلات متشابك، على سبيل المثال، الدوائية.

Protocol

ملاحظة: لا يتم تنظيم المواد التجريبية الحيوانية اللافقارية من قبل المعاهد القومية للصحة أو جامعة إيموري وجامعات ولاية جورجيا. ومع ذلك، اتخذت جميع التدابير لتقليل معاناة ال علقات الن علقات المستخدمة في هذا العمل. 1. إعداد العقدة المعزولة 7 من الحبل العصبي الحفاظ على ال علقات Hirudo verbana في بركة المياه الاصطناعية (التي تحتوي على 0.05٪ ث / الخامس من ملح البحر) المخفف في المياه غير المؤينة في 16 درجة مئوية على 12:12 دورة ضوء الظلام. إعداد الشقوق لتشريح عن طريق تخدير الباردة لهم في سرير من الجليد سحقت لمدة 10 دقائق > حتى غير متحركة. ملء الأسود، طبق تشريح مبطنة الراتنج إلى عمق ~ 1 سم مع المالحة المبردة التي تحتوي على 115 mM NaCl، 4 MM KCl، 1.7 mM CaCl2،10 MM D-الجلوكوز، و 10 MM HEPES في المياه غير المؤينة؛ درجة الحموضة المعدلة إلى 7.4 مع 1 M NaOH. قم بتثقيف الجانب الظهري لل في الحجرة السوداء المبطنة بالراتنج (على الأقل 20 سم × 10 سم مع عمق لا يقل عن 2 سم فوق الراتنج الذي لا يقل سمكه عن 2 سم). تحت منظار steromicroscope في التكبير 20x مع إضاءة دليل الضوء المائل، وجعل قطع طولي لا يقل عن 3 سم طويلة مع مقص الربيع 5 ملم من خلال جدار الجسم في الجزء الوردية 1/3rd من الجسم. استخدام دبابيس لسحب جانبا جدار الجسم وفضح الأعضاء الداخلية.ملاحظة: يمكن إزالة أي وجبة دم مخزنة عن طريق الشفط مع ماصة باستور مصقولة بالنار. عزل العقدة الفردية في منتصف الجسم 7 (السابعة الحرة العقدة القطاعية caudal إلى الدماغ). افتح الجيوب الأنفية التي يتواجد فيها الحبل العصبي باستخدام مقص الربيع عيار 5 مم. تأكد من تقسيم الجيوب الأنفية الظهر والبطين ترك شريطين من الجيوب الأنفية. استخدام حاد # 5 ملقط للمساعدة في توجيه القطع وعقد الجيوب الأنفية. الحفاظ على الجيوب الأنفية تعلق على كل من جذور العصب الثنائية اثنين التي تخرج من العقدة (فإنه يتمسك بإحكام إلى كل جذر) لاستخدام هذه الشرائط من الجيوب الأنفية لتعلق خارج العقدة. إزالة العقدة من الجسم عن طريق قطع حزم العصب الوردية والكودي الضام التي تربط العقدة (بعيدا عنالعقدة 7 ممكن) وشرائط الجيوب الأنفية، ومن ثم قطع الجذور الجانبية إلى حيث يخرجون من الجيوب الأنفية. دبوس العقدة (باستخدام القديم حاد # 5 ملقط) مع دبابيس الحشرات minuten تقصير، الجانب البطني حتى، في واضحة، اصطف الراتنج أطباق بيتري. إدراج دبابيس في شرائط من الجيوب الأنفية والأنسجة فضفاضة التمسك الجذور والربط الوردية والكودية، بعيدا عن العقدة ممكن.ملاحظة: يجب ألا يكون الراتنج أكثر سمكا من 3 مم إذا كان للإضاءة الجيدة من الأسفل أن تتحقق أثناء التسجيل. تأكد من أن العقدة مشدودة ، سواء الطولي أو الجانبي زيادة تكبير المنظار المجسم إلى 40x أو أكثر، وضبط الإضاءة المائلة بحيث يمكن رؤية أجسام الخلايا العصبية بسهولة على السطح البطني للعصابة أسفل العجان مباشرة. إزالة بيرينوريوم من العقدة (desheath) مع الميكروسيسورات. بدء desheathing عن طريق قطع غمد فضفاضة بين الجذور على جانب واحد، ومواصلة قطع أفقيا إلى الجانب الآخر، مع التأكد من الحفاظ على شفرات مقص سطحية وعدم إيذاء أجسام الخلايا العصبية مباشرة تحت غمد. جعل قطع سطحية مماثلة caudally من قطع الجانبية على طول خط الوسط. الآن الاستيلاء على رفرف caudolateral من غمد على جانب واحد مع ملقط # 5 غرامة ، وسحبه بعيدا عن العقدة ، وقطع عليه مع microscissors. كرر على الجانب الآخر؛ هذا الإجراء يكشف كل من HN (7) الخلايا العصبية للتسجيل مع microelectrodes. ضع طبق التحضير في إعداد التسجيل، وسخف مع المالحة بمعدل تدفق 5 مل/دقيقة في درجة حرارة الغرفة. 2. تحديد وتسجيل المعتقلين القلب مع microelectrodes حادة لمدة تسجيل الخلايا العصبية HN (7) (التسجيلات تستمر بين 30 إلى 60 دقيقة)، والحصول على ورقمنة آثار التيار والجهد داخل الخلية من أخذ العينات الكهربائية العصبية الفسيولوجية بمعدل 5 كيلوهرتز مع اكتساب البيانات الرقمية (التناظرية إلى الرقمية، من A إلى D) والتحفيز (الرقمية للتناظرية، D إلى A) النظام، وعرضها على شاشة الكمبيوتر.ملاحظة: يمكن استخدام أي برنامج تجاري أو مخصص ومن A إلى D/D إلى A board للحصول على البيانات (من A إلى D). D إلى A والبرامج المصممة خصيصا مطلوبة للمشبك الديناميكي. تحت منظار steromicroscope في 50-100x مع الإضاءة الحقل المظلم من أسفل، وتحديد مؤقتا HN (7) العصبية من الزوج الثنائي من خلال موقعها الكنسي في موقف posteriolateral في العقدة منتصف الجسم سبعة. تهدف الآن إلى اختراق الخلايا العصبية HN المفترضة (7) مع microelectrode حادة مليئة خلات البوتاسيوم 2 M و 20 MM KCl باستخدام micromanipulator. ضع الميكرونيكترودي جدا بالقرب من جسم الخلية الهدف. مراقبة باستمرار الإمكانات المسجلة مع electrometer، وتعيين هذه الإمكانية إلى صفر mV قبل اختراق الخلايا العصبية. اختراق الخلايا العصبية مع microelectrode، عن طريق قيادة ببطء القطب على طول محورها الطويل مع المتلاعب. باستخدام وظيفة طنين الكهربائي، تعيين إلى 100 مللي ثانية مدة الطنانة، حتى لوحظ تحول سلبي في إمكانات الغشاء ونشاط الارتجاف قوية. تعيين electrometer في وضع المشبك الحالي متقطعة (DCC) ≥ 3 كيلوهرتز لتسجيل إمكانات الغشاء في وقت واحد وتمرير الحالية مع microelectrode واحد (تعويض القدرة تعيين إلى أقل قليلا من رنين ثم طلب مرة أخرى 10٪). مراقبة استقرار القطب خلال DCC على منظار الذبذبات. حقن تيار ثابت من -0.1 نأ مع حاقن التيار الكهربائي ثابت لمدة دقيقة أو اثنتين لتحقيق الاستقرار في التسجيل. تحديد نهائيا HN(7) الخلايا العصبية من خلال شكلها ارتفاع مميزة وضعف النشاط انفجار (الشكل 1Cط). قم بإجراء أي تحليل للبيانات دون اتصال بعد اكتمال التجربة، واحفظ كافة البيانات على قرص. 3. بناء HN في الوقت الحقيقي أو خلية عصبية نموذج آخر بناء برامج مخصصة باستخدام لوحة معالجة الإشارات الرقمية (DSB; D إلى A و A إلى D) في جهاز كمبيوتر مكتبي لتنفيذ في الوقت الحقيقي التيارات النموذجية الموصوفة في2،4 أو تيارات نموذج مختلفة للخلايا العصبية الأخرى أو التجارب. استخدام معادلات نمط هودجكين هكسلي كما هي الطريقة المفضلة عموما لتمثيل التيارات النموذجية. انظر7 للحصول على وصف مفصل لتنفيذ نموذج HN في الوقت الحقيقي والمشبك الديناميكي قبل إضافة المضخة الحالية. الرجوع إلى قسم مقدمة لوصف التيارات, داخل الخلية Na+ تركيز, و موصلات HN المعيشة(7) الخلايا العصبية في نموذج HN. 4. تنفيذ وتتنوع التوصيلات المشبك الديناميكي / التيارات استخدام البرمجيات المشبك الديناميكية المصممة خصيصا لDSB لتنفيذ وتغيير في الوقت الحقيقي المشبك الديناميكي أي من واجهة المستخدم الرسومية(الشكل 3) (GUI) – يمكن الوصول إليها، التوصيلات المبرمجة التيارات من نموذج HN في الوقت الحقيقي من الخلايا العصبية HN(7).ملاحظة: كتذكير، وهي التوصيل القصوى من ناالمستمرة + الحالية ( IP) وضخ التيار القصوى (أنامضخة)، على التوالي. استخدام مربعات إدخال واجهة المستخدم الرسومية في البرنامج لإجراء تغييرات، كما هو قيد التشغيل النموذج، في (PumpMaxL مربع) و (GpinHNLive مربع) (الشكل 3).ملاحظة: تقبل مربعات الإدخال GUI القيم المكتوبة، ويوصى بخطوات 0.1 nA ويوصى بخطوات 1 nS ل . إضافة كميات صغيرة من ومع المشبك الديناميكي لتحقيق الاستقرار في انفجار الخلايا العصبية HN(7) ، والتي تضعف بسبب تسرب microelectrode الناجمة ، كما هو مبين في الشكل 1Cالثاني.ملاحظة: يؤدي اختراق الميكروكترودي الحاد إلى تلف الغشاء الذي يتم التعبير عنه على أنه زيادة في توصيل التسرب أو انخفاض مقاومة الإدخال. ابدأ بإضافة قيمة من 0.1-0.2 nA ، والتي تعوض عن التسرب الناجم عن microelectrode ، ولكنها تضعف الاستثارة ، ثم تزيد تدريجيا ، مما يزيد من الإثارة ، حتى يترتب على الانفجار المنتظم ، عادة عند ~ 1-4 nS (الشكل 4A). بشكل منهجي شارك تختلف هذه التيارات (زيادات من 0.1 nA ل و 1 nS ل) إلى الخلايا العصبية HN (7) المسجلة مع المشبك الديناميكي(الشكل 3)،وتقييم آثارها على خصائص الانفجار: تردد الارتفاع (و: المتبادلة من متوسط الفاصل الزمني بين البينية خلال انفجار)، الفاصل الزمني بين الانفجار (IBI: الوقت بين الارتفاع الأخير في انفجار واحد إلى الارتفاع الأول في القادم)، انفجر مدة الانفجار (دينار: الوقت بين الارتفاع الأول في انفجار والارتفاع الأخير في انفجار) ، وفترة الانفجار (T: الوقت بين الارتفاع الأول في انفجار والارتفاع الأول في الانفجار اللاحق). تغيير قيم و، كما هو الحال في مظاهرة الفيديو، لتصبح مألوفة مع هذه التقنية ومن ثم الخروج. اضغط على قيمة ثابتة محددة وامسح بزيادات 1 nS على نطاق من دعم نشاط الانفجار المنتظم. الآن زيادة القيمة الثابتة من قبل 0.1 nA واكتساح مرة أخرى على مدى مجموعة من دعم النشاط انفجار العادية. لكل زوج المعلمات المنفذة، جمع البيانات التي تحتوي على ما لا يقل عن 8 رشقات نارية بحيث يمكن إجراء مقاييس متوسط موثوق بها من و، IBI، دينار قبل المتوسط، و T. الاستمرار في عمليات التمشيط لطالما تبقى الخلايا العصبية قابلة للحياة، كما تم تقييمها من خلال الارتفاع القوي وإمكانات خط الأساس المستقرة للتذبذب. جمع البيانات من عدة خلايا عصبية (من مختلفة) لتوليد رسم بياني مركب (الشكل 5).

Representative Results

جلبت النمذجة مع إضافة أنا مضخة4 النتائج التجريبية المقدمة في قسم مقدمة في التركيز أكثر وضوحا وبدأت لشرح آلية مضخة بمساعدة من انفجار. وقد تم ضبط النموذج في الوقت الحقيقي أظهرت هنا (والمعلمات المختارة) بحيث تنتج النشاط الإيقاعي العادية التي تقع ضمن حدود النشاط العادي كما لوحظ في التجارب – و، IBI، BD، T – ويستمر في إنتاج مثل هذا النشاط عندما المعلمات myomodulin المعدلة (التيار مضخة القصوى) و (التوصيل الأقصى من ح التيار) متنوعة أو تشارك في التنوع في النموذج. يمكن استخدام قيم المعلمات المحددة كمعيار أو مجموعة أساسية لتجارب التصميم. في هذه الحالات النموذجية، وأناضخ يتذبذب طوال دورة انفجار كما [نا+]أنا حول مستوى خط الأساس. أنامضخة يساهم في إنهاء انفجار خلال مرحلة الانفجار، وفرط الاستقطاب أنها تنتج ينشط أناح خلال IBI؛ لاحظ المستوى الأقصى من Ih قرب بدء الاندفاع(الشكل 2). على الرغم من أن نموذج HN في الوقت الحقيقي قد نفذت جميع التيارات2،4 المتاحة لقط ديناميكية ، وكان التركيز هنا على و ، والتي تتوفر للتغييرات في حين أن النموذج قيد التشغيل في واجهة المستخدم الرسومية المشبك الديناميكي(الشكل 3). المشبك الديناميكي يسمح للمجرب لإضافة (أو طرح مع سلبية أو) أي التوصيل أو التيار في الخلايا العصبية بشكل مصطنع أن يحاكي الجهد والاعتماد الأيونية من التوصيل الحقيقي أو الحالية. وبالتالي، فمن الممكن لاستكشاف كامل كيف موصل معين / التيار يتفاعل مع التوصيلات الذاتية / التيارات داخل الخلايا(الشكل 1). نموذج HN في الوقت الحقيقي يشير إلى أن ناالمستمرة + الحالية (IP) في الخلايا العصبية HN يساهم الكثير من Na+ دخول تؤثر بقوة [نا+]أنا (الشكل 2) ، وبالتالي ، أنامضخة. لأنني P نشطة في إمكانات الغشاء السلبية نسبيا، فإنه يعارض أناضخ حتى خلال IBI. هذه الملاحظات تشير إلى أنه من المفيد لاستكشاف التفاعلات بين وفي الخلايا العصبية HN معزولة مع المشبك الديناميكي كما نوقش سابقا8,9,10. يتم تنفيذ هذه التجارب (الجارية) مع تسجيلات microelectrode حادة في واحد، معزولة متشابك HN(7) الخلايا العصبية (العقدة السابعة المقطوعة من الحبل العصبي). حتى الآن، تظهر هذه التجارب أن يتم استعادة انفجار قوي في الخلايا العصبية HN نشطة منشط (بسبب اختراق microelectrode أدخلت تسرب) من خلال إضافة مشاركة من IP وأنامضخة مع المشبك الديناميكي(الشكل 4). هذه ملاحظة هامة تشير إلى أن آلية الانفجار متاحة في هذه الخلايا العصبية (حتى عندما يتعرض تسرب للخطر) أن النتائج من التفاعل أنامضخة وأنا P. وتشير النتائج الأولية إلى تفاعلها المعقد القوي، الذي يمكن استكشافه في النموذج والتجارب(الشكل 5). في الختام، أناضخ استجابة لزيادات دورية في [Na+]i أثناء انفجار النشاط يساهم في إيقاع انفجار من خلال إنهاء انفجار (انخفاض دينار قبل الكني). التفاعل بين أناP وأنامضخة يشكل آلية كافية لدعم النشاط انفجار الذاتية; هذه الآلية يمكن أن تعيد انفجار قوي في interneurons HN سجلت داخل الخلايا في العقدة 7. التفاعل بين أناوP أناضخ من خلال [نا+]أنا يؤثر على فترة انفجار HN غير رتابة ويضمن قوة الانفجار الذاتي. هذه الاستنتاجات تتماشى مع التجارب والنمذجة في النظم الفقارية11،12. الشكل 1: ليتش القلب interneuron النشاط الكهربائي وتنفيذ أنا مضخة وأنا P مع المشبك الديناميكي. (أ) نشاط انفجار عادي سجلت في وقت واحد، خارج الخلية (أعلى) وداخل الخلية (أسفل)، في دقات القلب HCO من العقدة الثالثة، وتخطيطي من الخلايا العصبية المسجلة واتصالاتهم متشابك المثبطة للطرفين في اليمين. (ب) التخطيطي المشبك الديناميكي عند تسجيل HN(7) interneuron في العقدة المعزولة 7; ملاحظة لا يوجد تفاعل متشابك بين اثنين من HN (7) interneurons. (ج1) انفجار في تسرب للخطر HN(7) interneuron. (ج2) ويمكن إنتاج انفجار أكثر قوة عن طريق إضافة المشبك الديناميكي أنامضخة ( = 0.1 ن أ)، مما يعوض عن تسرب microelectrode الناجمة، ولكن الاكتئاب استثارة، و (1 nS)، مما يزيد من استثارة. خطوط متقطعة سوداء تشير إلى قيم الأساس. الاختصارات: HN = قلب داخلي; HCO = مذبذب نصف مركز; أنامضخة = التيار الخارجي. IP = نا المستمر+ الحالي; = الحد الأقصى نا+/ ك+ مضخة الحالية؛ = التوصيل الأقصى للناالمستمرة + الحالية؛ Vm = الغشاء المحتملة; [نا+] i = التركيز الداخلي ل Na+. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2: نموذج واحد HN interneuron تظهر آثار لإمكانات الغشاء (Vm), أنا ح, أنامضخة, [Na+]i, و IP. التيارات القطبية الخارج سلبية، وتيارات إزالة الاستقطاب الداخلي إيجابية. خطوط متقطعة سوداء تشير إلى قيم الأساس. الاختصارات: HN = قلب داخلي; أنامضخة = التيار الخارجي. IP = نا المستمر+ الحالي; = الحد الأقصى نا+/ ك+ مضخة الحالية؛ Ih = تيار داخلي نشط من خلال الاستقطاب الفائق؛ = التوصيل الأقصى للناالمستمرة + الحالية؛ = التوصيل الأقصى للتيار الداخلي المنشط من خلال الاستقطاب الفائق؛ Vm = الغشاء المحتملة; [نا+] i = التركيز الداخلي ل Na+. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3: واجهة المستخدم الرسومية من قلب في الوقت الحقيقي نموذج داخلي (HN) والمشبك الديناميكي تنفيذها على لوحة معالجة الإشارات الرقمية. أعلى اليسار: مربعات الرياضيات الحمراء هي مربعات معلمات يحددها المستخدم للطراز في الوقت الحقيقي، في حين أن مربعات Blue Live هي مربعات معلمات يحددها المستخدم وتستخدم في المشبك الديناميكي. El = إمكانية عكس تيار التسرب؛ Gl = تسرب التوصيل؛ Gh = h-الحالي التوصيل القصوى; سباق الجائزة الكبرى = P التوصيل القصوى الحالية; GCaS = بطء التوصيل القصوى الحالية الكالسيوم; PumpMax = مضخة التيار الأقصى؛ [GSyn2 التوصيل متشابك القصوى إلى الخلايا العصبية المعنية; ThreshSyn2 ارتفاع عتبة عبور للتوسط في إمكانات متشابك — وهذه تستخدم لجعل الهجين (المعيشة / نموذج) نصف مركز مذبذب لا يتضح هنا.]. اليسار السفلي للمشبك الديناميكي. في اليسار جدا هي 5 القيم المحسوبة من المتغيرات المشبك الديناميكي: أنامضخة = ضخ الحالية حقن؛ Ih = ح الحالية حقن (لا تستخدم هنا)؛ IP = P الحالي حقن; NaI = حساب داخلي Na+ التركيز; ENa = إمكانية عكس الصوديوم المحسوبة. اليسار السفلي للمشبك الديناميكي. إلى يمين المتغيرات المحسوبة هي 6 مربعات المعلمة تحديد المستخدم: GNa = يفترض الذاتية عالية الصوديوم استخدام التوصيل الأقصى لحساب Na+ تدفق المرتبطة إمكانات العمل; PumpMaxL = مضخة القصوى الحالية ليتم حقنها عن طريق المشبك الديناميكي; نايح انظر المعادلة (2)؛ Gh = التوصيل الأقصى لتحديد h-current ليتم حقنه بواسطة المشبك الديناميكي؛ سباق الجائزة الكبرى = يفترض الذاتية P الحالي استخدام التوصيل الأقصى لحساب Na+ تدفق المرتبطة الذاتية P الحالية; GpinHNLive = التوصيل الأقصى لتحديد P الحالي ليتم حقنها عن طريق المشبك الديناميكي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4: تحليل المشبك الديناميكي من HN المستقلة (7) انفجار. Upregulation من (A) 4.0 nS إلى (B) 9.0 nS يبطئ إيقاع انفجار HN المستقلة. تظهر الآثار التجريبية انفجار إيقاعي في الخلايا العصبية HN(7) المعزولة مع المشبك الديناميكي. نطاقات التذبذب من [Na+]i و Vm زيادة مع upregulated . آثار من أعلى إلى أسفل: سجلت Vm، حقن أنامضخة،محسوبة [نا+]أنا،وحقن أناP. خطوط متقطعة سوداء تشير إلى قيم الأساس. الاختصارات: HN = قلب داخلي; أنامضخة = التيار الخارجي. IP = نا المستمر+ الحالي; = الحد الأقصى نا+/ ك+ مضخة الحالية؛ = التوصيل الأقصى للناالمستمرة + الحالية؛ Vm = الغشاء المحتملة; [نا+] i = التركيز الداخلي ل Na+. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 5: تحليل المشبك الديناميكي من HN المستقلة(7) انفجار. Upregulation من يميل إلى الانخفاض، تليها زيادة فترة انفجار HN. في التجارب الفردية (النقاط المتصلة بالخطوط) باستخدام المشبك الديناميكي ، تم مسح القيم أثناء الاحتفاظ بها ثابتة. تمثل الألوان مستويات ثابتة مختلفة من الإضافة المستخدمة في تجارب مختلفة. الاختصارات: HN = قلب داخلي; = الحد الأقصى نا+/ ك+ مضخة الحالية؛ = التوصيل الأقصى للناالمستمرة + الحالية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

النمذجة، المشبك الديناميكي، والتحليلات الناتجة التي تمكنها هي تقنيات مفيدة لاستكشاف كيفية مساهمة الفرد والمجموعات من التوصيل الأيونية / التيارات في النشاط الكهربائي للخلايا العصبية (الشكل 1، الشكل 2،الشكل 4، والشكل 5). استخدام هذه التقنيات يبين كيف Na⁺/ K⁺ مضخة الحالية (أنا_مضخة) يتفاعل مع التيارات ذات بوابات الجهد، ولا سيما المستمر Na⁺ الحالية (I_P)، لتعزيز انفجار قوي في نمط ضربات القلب الرئيسية HNs مولد. من خلال الجمع بين التجارب المشبك الديناميكي والنمذجة، فمن الممكن لاختبار نماذج بشكل مباشر أكثر مما هو ممكن مع تسجيل الجهد العادي وتقنيات المشبك الحالية. النتائج التي تم جمعها من التجارب المشبك الديناميكي(الشكل 5)وسوف تستخدم لزيادة صقل نموذج HN. يمكن تخصيص الطريقة الأساسية لقط ديناميكية أظهرت هنا لتعكس خصائص أي خلية عصبية قيد الدراسة إذا كان يمكن تحديد نموذج رياضي من التيارات العصبية مع التجارب المشبك الجهد.

يتطلب الانتهاء الناجح من تجارب النوع الموضح هنا طعنا دقيقا ل HN أو خلية عصبية أخرى عند استخدام microelectrode حاد ، لأن الانفجار القوي يتم تقليصه عن طريق اختراق القطب^{الكهربائي 1}. (تقنيات تسجيل التصحيح الخلية الكاملة، والتي تقلل من تسرب أدخلت، تنطبق أيضا على الخلايا العصبية الأخرى، ولكن لا تعمل بشكل جيد على الخلايا العصبية علقة.) ومن الأهمية بمكان أن التشوه من الخلايا العصبية HN يسبب الحد الأدنى من الضرر للخلية العصبية (تسرب المضافة), وينبغي رصد مقاومة المدخلات ويجب أن تكون في حدود 60-100 MOhms للتجارب الناجحة⁴.

المشبك الديناميكي هو تقنية قوية ، ولكن لديها قيود تفرضها هندسة الخلايا العصبية لأن التوصيلات الاصطناعية يتم تنفيذها في موقع القطب التسجيل – عادة جسم الخلية – ليس في الموقع الذي عادة ما تكون فيه التيارات المولدة للإيقاع مترجمة⁵^،⁶^،¹⁰. في الخلايا العصبية HN, جسم الخلية هو كهربائيا قريبة من منطقة التكامل (neurite الرئيسي) من الخلايا العصبية حيث يتم توطين معظم التيارات النشطة, وتبدأ المسامير.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر كريستيان Erxleben للتجارب الأولية المشبك الديناميكي على HN (7) الخلايا العصبية التي أظهرت قدراتها انفجار. ساعدت أنجيلا وينينج التجارب بنصيحة الخبراء. ونحن نعترف المعاهد القومية للصحة لتمويل هذا العمل من خلال منحة 1 R21 NS111355 إلى GSC وRLC.

Materials

ANIMALS
Hirudo verbana	Leech.com, https://www.leech.com/collections/live-leeches		live leeches 2-3 grams
CHEMICALS
ARTIFICIAL POND WATER
CaCl₂	Sigma Aldrich	C5670-100G	1.8 mM add last after adjusting pH
glucose	Sigma Aldrich	G7021-100G	10 mM
HEPES	Sigma Aldrich	H4034-100G	10 mM
Instant Ocean (sea salt )	Spectrum Brands Inc., Madison, WI		0.05% (w/v) diluted in deionized water
KCl	Sigma Aldrich	P9333-500G	4 mM
NaCl	Sigma Aldrich	S7653-250G	115 mM
NaOH 0.1 N Solution	Sigma Aldrich	2105-50ML	Adjust to pH 7.4 with NaOH
MICROELECTRODES
K Acetate	Sigma Aldrich	P1190-100G	2 M
KCl	Sigma Aldrich	P9333-500G	20 mM
SALINE
EQUIPMENT
#5 Forceps	Fine Science Tools Dumont	11251-30 OR 11251-20	For general leech dissection
AxoClamp 2A/2B DCC electrometer	Axon Instruments Molecular Devices	2A/2B	For recording of neuronal membrane potential and discontinuous current clamp
Black resin	Dow Sylguard	170	Lines general dissect dish
Capilary glass 1 mm outer diameter, 0.75 mm inner diameter	A-M Systems	615000	For fabricating sharp microelectrodes
Clear resin	Dow Sylguard	184	Lines Petri dish used to mount ganglion for electrophysilogy
Dark field condenser	Nikon	Dry 0.95-0.80 MBL 1210	For illuminating the ganglion preparation during cell impalement
Digidata 1440A	Axon CNS Molecular Devices	1440A	Performs A to D and D to A for data acquisition and stimulation during electrophysiology
Digital signal processing board	dSpace	CLP1104	Our software implements all the conductances/currents in our model HN neuron on a DS1103 dSPACE PPC Controller Board in real-time at a rate of 20 kHz with a ControlDesk GUI (dSPACE, Paderborn, Germany)9.
Falming/Brown Microelectrode Puller	Sutter Instruments	P-97	For fabricating sharp microelectrodes
Fiber-Lite high intensity illuminator	Dolan Jenner Industries	170D	For illuminating the general dissection and for illuminating the ganglion preparation during cell impalement
Headstage amplifier for AxoClamp 2A	Axon Instruments	HS-2A Gain:0.1LU	Now part of Molecular Devices for recording of neuronal membrane potential and discontinuous current clamp
Light guide	Dolan Jenner Industries	Rev R 38 08 3729107	For illuminating the general dissection and for illuminating the ganglion preparation during cell impalement
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-385	Micromanipulator for cell impalement with microelectrodes
Micromanipulator controller	Sutter Instruments	MPC-200	Controls micromanipulators for cell impalement with microelectrodes
Minuten pins	BioQuip	0.15 mm diameter 1208SA	Should be shortened by curtting to ~5 mm
Optical Breadboard 3' x 5' x 8"	Newport	Obsolete	With the 4 pneumatic Isolators below used to construct a vibration free workspace for electrophysiology
Oscilloscope	HAMEG Instruments	HM303-6	To monitor electrode setteling during DCC
Pascheff-Wolff spring scissors	Moria		Supplied by Fine Science Tools (Foster City, CA) catalog # 15371-92
pClamp 9 Software	Axon Instruments	9	Now part of Moleculear Devices uses the Digidata 1440 for data acquisition and stimulation during electrophysiology
Pneumatic Isolators 28"	Newport	Obsolete	With optical breadboard used to construct a vibration free workspace for electrophysiology
Simulink / MATLAB software	MathWorks	2006 (Obsolete)	Implements dynamic clamp on the digital signal processing board
Stereomicroscope	Wild	M5A	10x Eye Pieces used for dissecting the leech and removingand desheathing ganglia
Steromicroscope	Wild	M5	20x Eye Pieces used in electrophysiologcal station to visualize neuron for microelectrode penetration
Student Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	91500-09	For general leech dissection

References

Cymbalyuk, G. S., Gaudry, Q., Masino, M. A., Calabrese, R. L. Bursting in leech heart interneurons: cell-autonomous and network-based mechanisms. Journal of Neuroscience. 22, 10580-10592 (2002).
Hill, A. A., Lu, J., Masino, M. A., Olsen, O. H., Calabrese, R. L. A model of a segmental oscillator in the leech heartbeat neuronal network. Journal of Computational Neuroscience. 10, 281-302 (2001).
Tobin, A. E., Calabrese, R. L. Myomodulin increases Ih and inhibits the NA/K pump to modulate bursting in leech heart interneurons. Journal of Neurophysiology. 94, 3938-3950 (2005).
Kueh, D., Barnett, W. H., Cymbalyuk, G. S., Calabrese, R. L. Na(+)/K(+) pump interacts with the h-current to control bursting activity in central pattern generator neurons of leeches. eLife. 5, 19322 (2016).
Sharp, A. A., O’Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. Journal of Neurophysiology. 69, 992-995 (1993).
Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp comes of age. Trends in Neuroscience. 27, 218-224 (2004).
Barnett, W., Cymbalyuk, G., Jung, R. Hybrid systems analysis: real-time systems for design and prototyping of neural interfaces and prostheses. Biohybrid systems: nerves, interfaces, and machines. , 115-138 (2011).
Sorensen, M., DeWeerth, S., Cymbalyuk, G., Calabrese, R. L. Using a hybrid neural system to reveal regulation of neuronal network activity by an intrinsic current. Journal of Neuroscience. 24, 5427-5438 (2004).
Olypher, A., Cymbalyuk, G., Calabrese, R. L. Hybrid systems analysis of the control of burst duration by low-voltage-activated calcium current in leech heart interneurons. Journal of Neurophysiology. 96, 2857-2867 (2006).
Calabrese, R. L., Prinz, A. A., DeSchutter, E. Realistic modeling of small neuronal networks. Computational Modeling Methods for Neuroscientists. , 285-316 (2010).
Rybak, I. A., Molkov, Y. I., Jasinski, P. E., Shevtsova, N. A., Smith, J. C. Rhythmic bursting in the pre-Bötzinger complex: mechanisms and models. Progress in Brain Research. 209, 1-23 (2014).
Picton, L. D., Nascimento, F., Broadhead, M. J., Sillar, K. T., Miles, G. B. Sodium pumps mediate activity-dependent changes in mammalian motor networks. Journal of Neuroscience. 37, 906-921 (2017).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Erazo-Toscano, R. J., Ellingson, P. J., Calabrese, R. L., Cymbalyuk, G. S. Contribution of the Na⁺/K⁺ Pump to Rhythmic Bursting, Explored with Modeling and Dynamic Clamp Analyses. J. Vis. Exp. (171), e61473, doi:10.3791/61473 (2021).