تحسين UPLC-UV طريقة ل الكم من فيتامين (ج) في أصناف الخس(Lactuca sativa L.) والمحاصيل البرية الأقارب(Lactuca spp.)
Summary
نقدم طريقة سريعة وموثوق بها لتحديد فيتامين C في لاكوكا SPP. باستخدام UPLC-UV، التي يحتمل أن تكون قابلة للنقل إلى نباتات أخرى. الخطوات الرئيسية هي إعداد العينة واستخراج فيتامين (ج) في ظل ظروف مستقرة، والحد من حمض ديهيدرواسكوبيك إلى حمض الاسكوربيك وتحسين الإجراء الكروماتوغرافي.
Abstract
الفيتامينات، وخاصة فيتامين (ج)، هي المغذيات الدقيقة الهامة الموجودة في الفواكه والخضروات. فيتامين C هو أيضا مساهم رئيسي في قدرتها المضادة للأكسدة. الخس هو واحد من الخضروات الأكثر شعبية بين المستهلكين في جميع أنحاء العالم. بروتوكول دقيق لقياس محتوى فيتامين (ج) في الخس والأنواع الأخرى ذات الصلة أمر بالغ الأهمية. نحن نُصف هنا طريقة تستخدم تقنية التصوير اللوني -فوق البنفسجية-البنفسجية السائلة فائقة الأداء، حيث تم تحسين إعداد العينة، واستخراج الفيتامينات، وظروف التصوير اللوني.
تم جمع عينات لتمثيل المصنع بأكمله، والمجمدة في -80 درجة مئوية وlyophilized لمنع الأكسدة غير المرغوب فيها وجعل التلاعب بهم أسهل. تم استخراج فيتامين (ج) في وسائل الإعلام الحمضية، مما ساهم أيضا في استقراره. كما يمكن أن يكون فيتامين (ج) موجودة في شكلين مختلفين، حمض الاسكوربيك (AA) وحمض ديهيدرواسكوبيك (DHAA)، وينبغي قياس كل من المركبات لقياس دقيق. تم قياس DHAA بشكل غير مباشر بعد تخفيضه إلى AA لأن AA يظهر absorptivity أعلى من DHAA في نطاق الأشعة فوق البنفسجية من الطيف. من المقتطف نفسه, تم إجراء قياسين, واحد قبل وواحد بعد أن الحد من التفاعل. في الحالة الأولى، كنا تحديد كمية المحتوى AA، وفي الثانية، ونحن كمي مجموع AA وDA (TAA: مجموع حمض الأسكوربيك) في شكل AA. ثم تم الحصول على كمية DHAA بشكل غير مباشر عن طريق طرح AA قادمة من القياس الأول من TAA. تم تحديدها بواسطة UPLC-UV، وذلك باستخدام معيار AA التجاري لبناء منحنى المعايرة وتحسين الإجراء الكروماتوغرافي، للحصول على قمم AA التي تم حلها بالكامل في وقت قصير. ويمكن استقراء هذا البروتوكول بسهولة على أي مواد نباتية أخرى مع تغييرات طفيفة أو معدومة. وكشفت دقته عن اختلافات ذات دلالة إحصائية غير من تصور. وتناقش نقاط القوة والقيود الأخرى في عمق أكثر في المخطوطة.
Introduction
الخس المزروع(Lactuca sativa L.) هو واحد من أكثر الخضروات الورقية المنتجة والمستهلكة في جميع أنحاء العالم ، مع إنتاج إجمالي حوالي 27.3 مليون طن في عام 20181. وينظر المستهلكون إلى الخس على أنه صحي. وتعزى الخصائص الغذائية أساسا إلى مصدر المركبات المضادة للأكسدة في المحصول، مثل فيتامين C، من بين أمور أخرى مثل البوليفينول وفيتامين E2. فيتامين ج هو المغذيات الدقيقة الأساسية للبشر على عكس العديد من الفقاريات الأخرى، كما أننا غير قادرين على إنتاجه بسبب الطفرات الموجودة في الترميز الجيني للانزيم الخطوة الأخيرة في المسار البيولوجي3. وهو مطلوب لعملية التمثيل الغذائي للخلايا الطبيعية، كما أنه يلعب دورا هاما في الاستجابات المناعية أساسا بسبب نشاطها المضادة للأكسدة3,4.
يتكون مجموع فيتامين C من حمض الاسكوربيك (AA) وحمض ديهيدرواسكوبيك (DHAA). AA هو الشكل الأكثر نشاطا بيولوجيا من فيتامين، ولكن DHAA (منتج الأكسدة) يظهر أيضا النشاط البيولوجي ويمكن تحويلها بسهولة إلى AA في جسم الإنسان5. ولذلك، فإن تحديد كلا الشكلين مهم لتحديد إجمالي محتوى فيتامين C لأي محصول بستين، بما في ذلك الخس.
وقد استخدمت مجموعة واسعة من النهج على أساس تقنيات تحليلية مختلفة لقياس فيتامين (ج) في الخضروات، مثل الأنزيمية، الطيفية، وأساليب titrimetric6،7،8. على الرغم من أن هذه الطرق بسيطة، فهي ليست محددة كيميائيا لAA9. وبالتالي، يفضل أساليب الكروماتوغرافي، وخاصة تقنية التصوير اللوني عالي الأداء السائل -الأشعة فوق البنفسجية (HPLC-UV)، وذلك بسبب دقتها العالية10. وقد استخدمت HPLC-UV لتحديد فيتامين C في تنوع كبير من المحاصيل, مثل القرنبيط, السبانخ والخس11,12,13. ومع ذلك، فإن القياس الكمي المتزامن للـ AA و DHAA معقد بسبب انخفاض الاستيعاب في DHAA في نطاق الأشعة فوق البنفسجية للطيف. بدلا من ذلك، يمكن تحديد DHAA بشكل غير مباشر باستخدام عامل خفض أن يحول DHAA إلى AA، وقياس مجموع حمض الاسكوربيك (TAA)، ومن ثم حساب الفرق بين TAA وAA. نظرا لضرورة انخفاض التفاعل, في بعض الدراسات, فقط AA تم تحديد كميا14, والتي يمكن أن تمثل في الواقع التقليل من نشاط فيتامين (ج). وهناك حاجة أيضا إلى أن رد فعل التخفيض إضافية لتحديد DHAA بشكل غير مباشر حتى عندما يتم استخدام التقدم الأخير في تقنيات الكروماتوغرافيا السائلة، لونية سائلة فائقة الأداء (UPLC). وتستفيد هذه الخطوة أيضا من المزايا التي يعرضها UPLC عند مقارنتها بـ HPLC: زيادة الكفاءة والدقة، وزيادة الحساسية، وتحليل الوقت الأقصر، والاستهلاك الأقل للمذيبات15. ونتيجة لذلك، تم استخدام تقنية UPLC-UV لتحديد كمية فيتامين C في المحاصيل المختلفة16.
بالإضافة إلى ذلك ، AA هو جزيء لاتمل جدا . وهكذا، من المهم وضع بروتوكول يمنع تدهوره أثناء تخزين الخس وتحليل فيتامين C9. وفي هذا السياق، يقدم البروتوكول التالي تحديدًا كميًا سريعًا ومحسّنًا لمحتوى فيتامين C في الخس بواسطة UPLC-UV، بالإضافة إلى إجراء استخراج فعال. ولم تدرج أصناف النخبة في هذه الدراسة فحسب، بل أدرجت أيضا في الأراضي التقليدية وبعض الأقارب البرية بسبب اهتمامهم المحتمل بتربية المحاصيل، وتحديدا في تحسين القيمة الغذائية للخس.
Protocol
Representative Results
Discussion
فيتامين ج هو عنصر غذائي مهم جدا، لكنه مركب لتيل جدا جدا، لذلك له UPLC-الأشعة فوق البنفسجية الكم يعتمد على عوامل متعددة، مثل تخزين العينة وإعداد، وطريقة الاستخراج والظروف الكروماتوغرافي. لذلك، كان هناك حاجة إلى إجراء سريع وبسيط لمنع AA (مع قوة مضادة للأكسدة) أكسدة إلى DHAA (بدون خصائص مضادة للأكسدة). وكان من الضروري أيضا تجنب ارتفاع درجة الحرارة ودرجة الحرارة الظروف، فضلا عن الضوء الشديد والغلاف الجوي المؤكد أثناء العلاج عينة لتعزيز استقرار المجمع.
للحد من أكسدة AA، اتخذت التدابير التالية. أولاً، تم حقن العينات كمواد بداية لكلا البروتوكولين لضمان التحديد الكمي الدقيق لمحتوى فيتامين C والتلاعب بسهولة بالعينات. وكان يفضل هذا الخيار على طحن غرامة، وجدت عادة في جميع أنحاء الأدب19، كما يذوب الغبار بسرعة كبيرة حتى يصبح الماء المتاحة مرة أخرى. أثناء إجراء الاستخراج، تم استخدام حجم أعلى من محلول أكثر حمضية (8٪ حمض الخليك و 1٪ من الـ MPA) كمستخرج في البروتوكول الأمثل(الملف التكميلي 2)، والذي يعمل أيضًا كمثبت عن طريق منع تدهور AA. هذا الحل الوارد أيضا EDTA كعامل شيلاتينغ لزيادة الاستقرار16، على عكس الاستخراج في البروتوكول غير الأمثل(ملف تكميلي 2). وعلاوة على ذلك، اختبرنا ما إذا كان من الممكن تعزيز إجراء الاستخراج باستخدام اثنين من الاستخراج المتتالية مع 2.5 مل من الاستخراج بدلا من واحد مع 5 مل وتحت الغلاف الجوي N2 بدلا من الظروف الجوية القياسية. تم التوصل إلى أفضل النتائج باستخدام استخراج واحد فقط في ظل جو غير معدل، مما أدى إلى تبسيط البروتوكول من خلال اتخاذ خطوات إضافية غير ضرورية (البيانات غير مبينة). كما أدخلت تغييرات طفيفة أخرى في البروتوكول من أجل تعزيز استخراج (أي صوتنة)، والحصول على استخراج أوضح (الترشيح أدق) وتقليل مدة البروتوكول(ملف إضافي 2). وفيما يتعلق بالظروف الكروماتوغرافية، تم التحقق من الطريقة كما ذكر قبل18،وضمان المعلمات التحليلية الجيدة(الجدول 3). الى جانب ذلك، واستخدام المياه فائقة الpure مع حمض فورميك (pH 2.0) والميثانول (98:2 v:v: v) مع تدفق 0.3 مل مين-1، بدلا من فوسفات مونوبوتاسيوم 30 مل م (pH 3.0) في 1 مل دقيقة-1 كما المرحلة المتنقلة(ملف تكميلي 2)،أدى إلى تحسين طريقة. وكان من المرجح أن يكون التقدم الأكثر أهمية باستخدام نظام UPLC بدلاً من HPLC ، مما سمح لنا بقدر أكبر من التحكم في الظروف المؤثرة (مثل درجة الحرارة) مما أدى إلى حل قمم AA دون تدخلات من قبل مركبات غير معروفة ، في وقت أقصر واستهلاك حجم أقل من استخراج (ملف إضافي 2).
ومع ذلك، هناك حدان رئيسيان لهذه الطريقة. الأول هو أنه لا يمكن قياس DHAA مباشرة باستخدام كاشف الأشعة فوق البنفسجية بسبب انخفاض الاستيعاب في نطاق الأشعة فوق البنفسجية من الطيف. من المهم تحديد محتوى DHAA لأنه يعرض بعض الأنشطة البيولوجية ويسهل تحويلها إلى AA في جسم الإنسان5. لذلك، هناك حاجة إلى رد فعل إضافي للحد من DHAA إلى AA، جنبا إلى جنب مع تشغيل الكروماتوغرافي الثاني من أجل قياس TAA ومن ثم تحديد DHAA بشكل غير مباشر عن طريق طرح AA المحتوى من TAA(الشكل 3). في هذا المعنى، وقد تم تحسين خطوة التخفيض باستخدام تركيز أعلى من وكيل خفض (DTT)، وزيادة وقت رد الفعل من 5 إلى 30 دقيقة، ووقف التفاعل مع حامض الكبريتيك(ملف تكميلية 2). ويشكل انخفاض استقرار AA القيد الثاني للأسلوب. كما AA يبدأ في التحلل 4 ح بعد استخراج (ملف تكميلية 1),فمن الضروري أن يحدد كميا في هذا الفاصل الزمني. لذلك، فإن عدد العينات لاستخراج مشروط من قبل إجراء الكروماتوغرافي. هذا هو السبب في أننا نقترح تجميدها في تلك الخطوة في هذا البروتوكول ، على الرغم من أنه في هذه الحالة ، لا يمكن وضعها جميعًا في أوتزل أوتوماتيبلر ليتم قياسها تلقائيًا. لحسن الحظ، RT مخفضة لAA سمح لنا للحصول على الكروماتوميجرامات 3 دقيقة، أقصر بكثير من الكروماتوجرامات 7 دقيقة التي تم الحصول عليها باستخدام HPLC (ملف تكميلية 2). وبالتالي، يمكن تحديد محتوى فيتامين C في عدد كبير من العينات في نافذة 4 ساعة.
الشكل 3: سير عمل القياس الكمي لفيتامين C في الخس وبعض الأقارب البرية.
مخطط تخطيطي للبروتوكول الأمثل الذي يظهر فرعين لتحديد AA فقط أو AA + DHAA (TAA). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
كما فيتامين (ج) هو المغذيات الأساسية للبشر ونظرا لفوائده الصحية الهامة, أصبح موضوع العديد من الدراسات. ولذلك، تم تحديد كميا في مجموعة كبيرة ومتنوعة من المحاصيل، بما في ذلك الخس، واحدة من أكثر الخضروات استهلاكا في جميع أنحاء العالم. وقد تم استبدال الطرق الكلاسيكية البسيطة تدريجيا من قبل تقنيات الكروماتوغرافيا السائل لأنها أكثر تحديدا ودقة10. ومع ذلك، نظرا للحاجة إلى رد فعل إضافي لقياس كل من، AA وDA عبر HPLC، في بعض الدراسات على الخس، فقط AA14 أو فقط TAA11 (دون تحديد كمية AA قبل الحد من DHAA إلى AA) تم قياسها. وعلاوة على ذلك، فإن عدد قليل فقط من المؤلفين قد كمية AA وDA، على الرغم من مساهمة كل من الجزيئات في نشاط فيتامين C المضادة للأكسدة2. ومع ذلك، أصبحت تقنية UPLC أكثر أهمية في الآونة الأخيرة بسبب أدائها العالي عند قياس فيتامين C في العديد من المحاصيل16. وبمقارنة النتائج التي تم الحصول عليها في هذه الدراسة مع المنهجيتين، UPLC و HPLC، تم تأكيد هذه المزايا: تم تحقيق مستويات عالية من الحساسية في AA، وفي أوقات قصيرة جداً، مما يعني أيضاً استهلاك موارد أقل. وعلى الرغم من كفاءة UPLC، فإن تشن وآخرون20 فقط هي التي طبقت هذه التقنية لقياس محتوى فيتامين C في الخس، مما أدى إلى التقليل من شأن ذلك حيث تم تحديد كمية نموذج AA فقط.
باختصار، يمثل هذا العمل أول محاولة ناجحة لتحديد إجمالي محتوى فيتامين C ليس فقط في أصناف مختلفة من الخس ولكن أيضًا في بعض أقاربهم البرية. كما أن تحديد كمي فيتامين ج ضروري لتحديد الخس الذي يحتوي على نشاط مضاد للأكسدة أعلى في برامج التربية. في هذا المعنى، وزيادة إجمالي فيتامين C المحتوى في الخس الأقارب البرية وجدت هنا وزيادة محتوى AA ذكرت في الدراسات السابقة14، فضلا عن غيرها من المركبات المضادة للأكسدة21، يوسع المرشحين المناسبين لتحسين القيمة الغذائية للخس.
في الختام, حتى مع بعض القيود الكامنة في طبيعة فيتامين (ج), مثل تدهوره التدريجي بعد ساعات قليلة من استخراجها أو الحاجة إلى رد فعل الحد بسبب انخفاض DHAA UV-absorptivity, فإنه يوفر أقل كثافة العمل وأقل وقتاً تستغرق طريقة لقياس محتوى فيتامين (ج). بالإضافة إلى ذلك، كما أنها قوية جدا ويظهر حساسية عالية وقوة القرار. وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن نقلها بسهولة ليس فقط إلى المواد النباتية الأخرى مع تغييرات طفيفة أو معدومة، ولكن أيضا للمنتجات المصنعة التي توفر المداواة الغذائية من فيتامين (ج) إلى البشر، مما يؤدي إلى مجموعة واسعة من التطبيقات في المستقبل في مجال الناشئة من اختبار لجودة الغذاء موثوق بها.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونعترف بامتنان بنك جرثومبلاس النباتي في سرقسطة (BGHZ-CITA، إسبانيا) ومركز الموارد الوراثية (CNG، واغينغن، هولندا) لتوريد البذور اللازمة لهذا العمل. نشكر ج. أ. أرانجويلو، أ. كاستيانوس و”مختبر الفُرْقِة” من CITA على الدعم التقني، وD. L. Goodchild لاستعراض اللغة الإنجليزية. وقد تم تمويل هذا العمل من المشروعين RTA2017-00093-00-00 من المعهد الوطني للبحوث الزراعية والغذائية والتكنولوجيا (INIA) LMP164_18 من حكومة أراغون؛ والبرنامج التشغيلي فيدر أراغون 2014-2020 والصندوق الاجتماعي الأوروبي من الاتحاد الأوروبي [Grupos Consolidados A12-17R: “Grupo de investigación en fruticultura: caracterización, adaptación y mejora genéica” و A14-17R: “Sistemas agroganaderos alimentarios sostenibles” (SAGAS)]. وقد تم دعم I.M.L. بعقد ما قبل الدكتوراه لتدريب الأطباء من وزارة العلوم والابتكار والجامعات الإسبانية (MCIU) والوكالة الإسبانية للبحوث الحكومية (AEI).
Materials
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) ≥98% (Ellman′s reagent) | Roche | 10197777001 | |
| 10 mm f stainless steel ball | Euro Aznar Supplies S.L. | 20112100 | |
| 15 mL polypropylene tube for centrifuge | DeltaLab | 429946 | |
| 2 mL HPLC amber vial | Agilent | 5190-9063 | |
| 2 mL syringe with needle | DeltaLab | JS2 | |
| 20 mL polypropylene tubes | Dealtalab | 202840 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIS) ≥99.9% (titration) | Roche | 10708976001 | |
| 50 mL polypropylene tube | DeltaLab | 429951 | |
| Acetic acid (CH3COOH) ≥99% purity glacial, ReagentPlus | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Acetonitrilo, HPLC super gradient grade (99.9+% CH3CN-0.2 µm filtrated) | Chem-lab | CL00.0189 | |
| Acquity UPLC HSS T3 column (150 mm x 2.1 mm x 1.8 µm) | Waters | 186003540 | |
| Beaker 1 L, 200 mL | DeltaLab | 191725, 191722 | |
| Dipotassium phosphate (KH2PO4) | Panreac | 766384 | Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2) |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium salt (EDTA x 2H2O) 99-101% assay, ACS reagent | Panreac | 131669 | |
| Fisherbrand Analog MultiTube Vortexer | Thermo Fisher Scientific | 15549004 | |
| Formic acid 98-100% for HPLC LiChropur | Supelco | 5438040100 | |
| Freeze dryer VirTis genesis 25EL | VirTis | na | |
| Heidolph Multi Reax mixer | Heidolph | na | |
| Heidolph Reax top mixer | Heidolph | na | |
| Hewlett Packard HPLC 1050 equipped with an eλ Detector | Hewlett Packard | na | Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2) |
| Hydrochloric acid (HCl) 37% purity, ACS reagent | Sigma-Aldrich | 320331 | |
| L-Ascorbic acid ≥99%, ACS reagent | Sigma-Aldrich | 255564 | |
| Meta-phosphoric acid (MPA) ACS reagent, chips, 33.5-36.5% | Sigma-Aldrich | 239275 | |
| Methanol ≥99.9% (HPLC supergradient grade) | ChemLab | CL00.0189.2500 | |
| Micropipettes 10-1000 μL | Socorex | na | |
| Nucleosil 120 C18 Tracer column (250 mm x 4 mm x 5 µm) | Merck (Sigma-Aldrich) | 54919 | Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2) |
| PTFE-silicone cap with preaperture | Agilent | 5190-9067 | |
| Refrigerated centrifuge Gyrozen 1248R | Gyrozen | na | |
| Regenerated cellulose filters 0.22 µm (13 mm) | Agilent | 1015190-5108 | |
| Regenerated cellulose filters 0.45-µm (13 mm) | Labbox | SFCA-145-100 | Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2) |
| Spectrophotometer Heλios β | Thermo Scientific Corporation | na | |
| Sulfuric acid (H2SO4) 95.0-98.0% purity, ACS reagent | Sigma-Aldrich | 258105 | |
| Ultrapure water | WasserLab | na | |
| Ultrasons H-D | Selecta | na | |
| Volumetric flasks 1 L, 100 mL | DeltaLab | 191489, 191486 | |
| Waters Acquity UPLC H-Class equipped with a PDA eλ Detector | Waters | na |
References
- Llorach, R., Martínez-Sánchez, A., Tomás-Barberán, F. A., Gil, M. I., Ferreres, F. Characterisation of polyphenols and antioxidant properties of five lettuce varieties and escarole. Food Chemistry. 108 (3), 1028-1038 (2008).
- Carr, A. C., Frei, B. Toward a new recommended dietary allowance for vitamin C based on antioxidant and health effects in humans. American Journal of Clinical Nutrition. 69 (6), 1086-1107 (1999).
- Carr, A. C., Vissers, M. C. M. Synthetic or food-derived vitamin C-Are they equally bioavailable. Nutrients. 5 (11), 4284-4304 (2013).
- Lee, S. K., Kader, A. A. Preharvest and postharvest factors influencing vitamin C content of horticultural crops. Postharvest Biology and Technology. 20 (3), 207-220 (2000).
- Shekhovtsova, T. N., Muginova, S. V., Luchinina, J. A., Galimova, A. Z. Enzymatic methods in food analysis: determination of ascorbic acid. Analytica Chimica Acta. 573-574, 125-132 (2006).
- Zhan, L., et al. Light exposure during storage preserving soluble sugar and L-ascorbic acid content of minimally processed romaine lettuce (Lactuca sativa L.var. longifolia). Food Chemistry. 136 (1), 273-278 (2013).
- Malejane, D. N., Tinyani, P., Soundy, P., Sultanbawa, Y., Sivakumar, D. Deficit irrigation improves phenolic content and antioxidant activity in leafy lettuce varieties. Food Science and Nutrition. 6 (2), 334-341 (2017).
- Tarrago-Trani, M. T., Phillips, K. M., Cotty, M. Matrix-specific method validation for quantitative analysis of vitamin C in diverse foods. Journal of Food Composition and Analysis. 26 (1-2), 12-25 (2012).
- Klimczak, I., Gliszczyńska-Świgło, A. Comparison of UPLC and HPLC methods for determination of vitamin C. Food Chemistry. 175, 100-105 (2015).
- Złotek, U., Świeca, M., Jakubczyk, A. Effect of abiotic elicitation on main health-promoting compounds, antioxidant activity and commercial quality of butter lettuce (Lactuca sativa L.). Food Chemistry. 148, 253-260 (2014).
- Koh, E., Charoenprasert, S., Mitchell, A. E. Effect of organic and conventional cropping systems on ascorbic acid, vitamin C, flavonoids, nitrate, and oxalate in 27 varieties of spinach (Spinacia oleracea L). Journal of Agricultural and Food Chemistry. 60 (12), 3144-3150 (2012).
- Kałuzewicz, A., et al. The influence of short-term storage on the content of flavonoids and vitamin C in Broccoli. European Journal of Horticultural Science. 77 (3), 137-143 (2012).
- van Treuren, R., van Eekelen, H. D. L. M., Wehrens, R., de Vos, R. C. H. Metabolite variation in the lettuce gene pool: towards healthier crop varieties and food. Metabolomics. 14 (11), 1-14 (2018).
- Swartz, M. E. UPLC: An introduction and review. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 28 (7), 1253-1263 (2005).
- Spínola, V., Mendes, B., Câmara, J. S., Castilho, P. C. An improved and fast UHPLC-PDA methodology for determination of L-ascorbic and dehydroascorbic acids in fruits and vegetables. Evaluation of degradation rate during storage. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 403 (4), 1049-1058 (2012).
- Ball, G. F. M. . Water-soluble vitamin assays in human nutrition. , (1994).
- Bertolín, J. R., et al. Simultaneous determination of carotenoids, tocopherols, retinol and cholesterol in ovine lyophilised samples of milk, meat, and liver and in unprocessed/raw samples of fat. Food Chemistry. 257, 182-188 (2018).
- Spínola, V., Llorent-Martínez, E. J., Castilho, P. C. Determination of vitamin C in foods: Current state of method validation. Journal of Chromatography A. 1369, 2-17 (2014).
- Chen, Y., et al. radiation is beneficial for yield and quality of indoor cultivated lettuce. Frontiers in Plant Science. 10, 1-10 (2019).
- Damerum, A., et al. Elucidating the genetic basis of antioxidant status in lettuce (Lactuca sativa). Horticulture Research. 2 (15055), 1-13 (2015).
