フローサイトメトリーによる主要なマウス海馬ニューロンの主要組織適合性複合体クラスIの発現の評価

すべての手順は、国立衛生研究所の実験動物のケアと使用のためのガイドの勧告に従って、動物を含む生物医学研究のための国際指導原則に従って行われました。この議定書は、ノースカロライナ大学シャーロット制度動物の世話と使用委員会(プロトコル#19-020)によって承認されました。 1. 文化の準備 注:これらの手順は、組織培養指定のバイオセーフティキャビネットで無菌条件下で行う必要があります。メディアとソリューションについては 、表 1 を参照してください。 自己シール滅菌袋でオートクレーブすることにより、すべての解剖ツールを殺菌します。 12ウェルの文化料理を扱うためのポリD-リジンの作業ストックを準備します。 ポリD-リジンを1xホウ酸バッファーに100 μg/mL(10x濃縮)の濃度に溶解します。必要になるまで-20°Cで約1mLのアリコートを保管してください。 10倍濃縮ポリD-リジンをdPBSで10μg/mL(1x)に希釈し、フィルター滅菌します。 12ウェル培養プレートを、1xポリD-リジンのウェルあたり0.5 mLで、室温で少なくとも1時間または翌日に使用するために一晩治療します。ポリD-リジンの体積が培養領域の底部を完全に覆うのに十分であることを確認してください。 使用の直前に、培養プレートからポリD-リジンを取り除き、滅菌水で3倍すすいで、細胞をプレートする準備ができるまで滅菌水に入れます。めっき細胞の前に徹底的な吸引によって液体のすべての痕跡を除去する。 ニューロン成長培地とFACSバッファを準備します。フィルターは滅菌し、使用するまで4°Cで保存します。ニューロン成長培地は約2 wksのために保つことができます。FACS バッファは約 4 wk のために保つことができます。 2. 胚海馬の解剖 注:この手順は、海馬の髄液および微細解剖の除去のためのステレオ顕微鏡の使用を必要とするため、ベンチトップで行うことができます。潜在的な汚染を最小限に抑えるために厳格な無菌技術に従います。 CO2チャンバーの胚性18日目に、時を超えた妊娠C57BL/6Jメスマウスを安楽死させる。 腹部の皮膚と毛皮に70%のEtOHをスプレーし、組織鉗子で皮膚をつまみ、外科用ハサミで小さな切開を行います。腹部を切開して内臓と子宮を露出させる。 標準的なパターン鉗子で子宮をつかみ、空洞から持ち上げ、細かいはさみでメソムトリウムへの接続を切断します。胚を含む子宮を氷の上に置かれた100mmの無菌プラスチック培養皿に移す。 細かいはさみと細かい鉗子を使用して、慎重に子宮を切断し、胚嚢を取り除いて胚を放出する。氷の上に置かれたdPBSを含む新しい100mmの無菌プラスチック培養皿に胚を移す。 細かいはさみを使用して胚の子犬を切断し、氷の上に置かれたHibernate-E培地を含む新しい100mmの無菌プラスチック培養皿に頭を移す。 脳を取り除くために、片手に細かい鉗子を持って頭を持つ。一方、湾曲したデュモン#7鉗子を使用して、頭蓋骨の基部に鉗子の先端を挿入し、脳を突き刺すことなく、正中線に沿って前に動く骨と上の皮膚をつまみます。 湾曲した鉗子を使用すると、皮膚と頭蓋骨を引き離して脳を露出させます。露出した嗅球から小脳まで脳の下の湾曲した鉗子を掃いて、頭蓋骨から脳を持ち上げます。氷の上に置かれたHibernate-E培地を含む新しい100ミリメートルの無菌プラスチック培養皿に脳を移す。各脳について繰り返します。注: 実験に特化した目的で別々にする必要がない限り、すべての脳を単一の培養皿に集めてもよい。 ステレオ解剖顕微鏡の下で、一度に1つの脳と2組の無菌デュモン#5鉗子で働き、嗅球をつまんで髄を引き離します。髄液の徹底除去は、他の細胞による培養汚染を避け、さらなる解剖を可能にするために必要である。 髄液が適切に除去されると、皮質の上側が横に開き、海馬を露出させる。デュモン#5鉗子を使用して、付属の皮質から海馬をつまみ、氷の上に5mLのHibernate-E培地を含む無菌15 mL円錐管に隔離された海馬を慎重に移す。 各胚性マウスの子犬の両方の脳半球の解剖を繰り返し、実験固有の目的のために別々に必要でない限り、すべての海馬を単一の15 mL円錐形チューブに組み合わせる。 皮質ニューロンを培養するために、皮質は皮質下皮質から分離され、海馬ニューロンと同じように処理され得る。注: この時点で、プロトコルが一時停止する可能性があります。B27を補充したハイベルネートE培地の脳または解剖カバピを保存する(2%)4 °Cで最大1ヶ月間、延長遅延は生存細胞の数を損なう可能性がある。 3. 海馬ニューロンの解離と培養 注:すべての手順は、組織培養指定バイオセーフティキャビネットで無菌条件下で行われるべきです。 海馬解離のために胚当たり0.5mLのパパイン解離液を調製する。解離に必要な解離液の量は、解剖される胚脳の数によって異なります。注:皮質ニューロン培養の場合、1胚あたり1.0 mLのパパイン溶液を調製してください。 ハイバネートE培地の1mL当たり20μLのパパイン懸濁液を約3分間ボルテックスで溶解します。 パパインが溶解した後、溶液の1 mLあたり1μLのDNase Iを加えます。これは酵素を失活させることができるので、DNase Iが添加された後に溶液を渦出しないでください。 遠心分離機15 mL海馬組織を含む円錐管(ステップ2.10)で1,000xgで5分間。 上清を取り除き、パパイン溶液を加えます。数回反転して組織を再中断します。37°Cで30分間インキュベートし、10分ごとに組織を再懸濁させる。 皮質ニューロンを培養する場合は、すべての皮質を新しい100mm滅菌培養皿に移し、プレートから慎重に吸引し、細かいはさみやカミソリの刃を持つミンチ組織を作ります。培養皿にパパイン溶液を加え、無菌移動ピペットを用いて15 mL円錐管にパパイン溶液を用いて皮質組織を移管する。37°Cで30分間、組織と酵素溶液をインキュベートし、10分ごとに攪拌する。 30分間のインキュベーション中に、3つの火で磨かれたガラスのパスツールピペットを準備してください:1完全に開いて、1半分開いて、そして1四分の一開き。 30分インキュベーション後、消化された脳組織を含む15 mL円錐管を10分間 125xg で遠心分離する。酵素溶液を取り除き、新鮮なハイベルネートE培地の等量に置き換えます。 完全に開いたパスツールピペットを使用して、組織を10倍にトリチュレートする。組織を2分間落ち着かせ、その後、上清細胞懸濁液を滅菌50 mL円錐管に移します。同じ量の休止E培地を組織に追加します。 半分開いたパスツールピペットを使用して、トリチュレート組織10x。組織を2分間落ち着かせ、上清細胞懸濁液を前工程と同じ50mL円錐管に移します。同じ量の休止E培地を組織に追加します。 四半期オープンパスツールピペットを使用して、トリチュレート組織10x。組織を2分間落ち着かせ、上清細胞懸濁液を前のステップと同じ50 mL円錐形に再び移します。解ciaしていない残りの組織を捨てます。 遠心分離機は、細胞懸濁液からの上清を含む50mLの円錐管を 125xg で5分間用いた。まだ行われていない場合は、滅菌水でポリD-リジンコーティングされたプレートを洗浄し、遠心分離中に徹底的な吸引によって液体のすべての痕跡を取り除きます。 遠心分離後、上清を捨て、細胞ペレットをニューロン成長培地の5 mLで再懸濁します。トリパンブルーとヘモサイトメーターを使用して生細胞を数えます。 皮質ニューロンを培養する場合, 少ない密度の細胞とより正確なカウントのためのニューロン成長培地の少なくとも 10 mL を追加. ニューロン成長培地を用いた細胞を希釈し、1ml当たり5 x 105個の生存細胞の最終的なめっき密度を実現し、12ウェルプレートの各ウェルに希釈細胞懸濁液1mLを加えます。5%CO2で37°Cでニューロンを維持する。注:典型的には、1胚マウス脳からの海馬、すなわち、2海馬は、約1 x 106 生存細胞を生み出す。この数値は実験計画目的でのみ提供され、各培養のセル数の代替と見なされるべきではありません。 培養後の翌日に培養後の培地の半分を取り除き、すなわち0.5mL、培養細胞を破壊しないようにウェルの側面に等量の新鮮な培地を加えて培養した。文化の寿命に対して、週2回の半分のメディア変更を完了します。 4. フローサイトメトリーによるMHCI発現の評価 インターフェロンβ(IFNβ)またはニューロン成長培地中の希釈剤の等量を希釈することによって治療を準備する。培地交換は半量変化となるため、2倍濃縮IFNβで処理培地を用意する。すなわち、12ウェルプレートの3つのウェルを100 U/mLのIFNβで処理し、培地処理コントロール用に200 U/mL IFNβまたは同量のIFNβと等量のIFNβを1.5mL調製する。 ニューロンの各ウェルから0.5 mLを除去し、各ウェルにIFNβの有無にかかわらず、ニューロン成長培地の0.5 mLを追加します。実験条件およびシグナル最適化に応じて、通常の成長条件(37°C、5%CO2)で6-72時間インキュベートします。 治療時間の後、すべての培養培地を取り除き、サプリメントを欠いた冷たい神経基底培地(B27、L-グルタミン、ペンストレップ)で1回静かに洗います。 1 μg/mLのFcブロックを含む非補製の冷たいニューロ基底培地を0.5 mL、各ウェルに1μg/mLの蛍光共役抗MHCI抗体を加えます。4°Cで45分間光から保護。 抗体含有培地を取り除き、冷たいdPBSで一度丁寧に洗浄してください。各ウェルに0.5 mLの室温酵素フリー細胞解離バッファーを加え、攪拌して細胞を取り除きます。逆組織培養顕微鏡を使用して解離を監視します。 細胞が培養皿から切り離されたら、各ウェルに0.5mLのFACSバッファーを加え、細胞をトリチュレートして塊を分散させ、各ウェルの総体積を個々の1.7 mLマイクロ遠心分離管に移します。 遠心分離機 1,000 x g 5分間上清を取り除き、FACSバッファーの100 μLで細胞ペレットを再懸濁し、各チューブの総体積を96ウェルUボトムプレートの個々のウェルに移します。 各ウェルに100μLの固定化試薬を加えます。細胞が凝集するのを避けるために数回トリチュレートし、光から保護された室温で15分間インキュベートします。 500 x g で 5 分間の遠心分離機。上清を取り外し、FACSバッファの200 μlで再中断します。 500 x g で 5 分間の遠心分離機。上清を取り除き、蛍光共役抗NeuN抗体(1:100希釈)を各ウェルに含むパーメアビライズ試薬を100μLで再懸濁します。よく混ぜ、光から保護された室温で20分間揺れ動きます。 インキュベーション後、500xgで5分間遠心分離機を使用する。上清を取り外し、FACSバッファの100 μLで再中断します。2x を繰り返します。 最終洗浄後、FACSバッファーで希釈した2%パラホルムアルデヒドの100 μLで細胞を再懸濁します。細胞が凝集するのを防ぐためによく混ぜます。フローサイトメーターで読み取る準備ができるまで、光から保護された4°Cで保管してください。1週間以内に、できるだけ早くサンプルを読んでください。 5. データの定量化と評価 各蛍光色素の補償制御を測定し、スペクトルの重複を補正します。理想的な補償制御には、染色されていない培養ニューロン、抗MHCIのみで染色され、抗NeuNのみで染色されたニューロンが含まれます。 可能であれば、各サンプル (少なくとも 10,000) に対して 100,000 個のイベントを記録し、FCS ファイルとして保存します。 適切な解析ソフトウェアを使用してデータを分析するには、 図1A-C に示すように、NeuN-陽性ニューロンを選択するシーケンシャルゲートを設定します。 SSC-A (ログ) と FSC-A (線形) をプロットします。細胞集団(P1)にゲートを描画し、細胞の破片を分析から排除します。 P1細胞集団内で、FSC-H(線形)対FSC-A(線形)をプロットします。単一セルの母集団にゲートを描画します。 単一セルの母集団内で、SSC-A (ログ) と NeuN (ログ) をプロットします。NeuN陽性集団に、染色されていない細胞またはMHCIのみの染色された細胞をガイドとして使用してゲートを描画します。 Y軸上でモードに正規化された細胞イベントを用いてMHCI蛍光のヒストグラムをプロットする。染色されていないまたはNeuNのみの染色されたニューロンをガイドとして使用して、水平ゲートを描き、MHCIに陽性のニューロンパーセントを定量化する。 統計評価およびグラフ描画のために、MHCIに陽性のパーセント細胞と、NeuN陽性集団のMHCIの蛍光強度の中央値(MFI)をエクスポートします。