ライブセル上の近くの同時レーザー走査共焦点と原子間力顕微鏡(コンポカル)

1. 楽器、文化メディア、食器類の準備 コンフォーカル顕微鏡と原子間力顕微鏡の両方の電源と、コンポカルの間に使用される他の関連機器やデバイスの電源をオンにします。測定を開始する前に、測定器が熱的に平衡化し、安定するのに十分な時間を与えます。典型的には、1時間で十分である。 1つのクリーンな、システム承認のガラス底のペトリ皿を準備し、半分いっぱいに充填しますが、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)または同様の透明な液体で、3分の2以下がいっぱいです。この皿(「キャリブレーション皿」と呼ばれる)は、サンプル皿とは別に、原子間力顕微鏡(AFM)の片持ち体を見つけて較正するために使用されます。注:液体が透明で、蛍光スペクトルとの干渉を防ぐために、低い自己蛍光を有することが重要です。PBSは生物学的環境を模倣するので推奨されます。 関連する液体が少なくとも半分いっぱいの皿を満たすような実験的なサンプル料理を準備する。サンプルが蛍光灯の場合は、必要になるまで覆われたり暗い場所に置かれていることを確認してください。レンズクリーナーとレンズワイプを使用して、すべてのガラス皿の底部をきれいにします。 コンピュータのハード ドライブ上に、コンフォーカルおよび AFM 用のデータストレージ フォルダを作成します。 2. 細胞または微生物の選択 細菌ストック溶液を作成するために、接種レンサ球菌変異体細菌を接種ループを用いて、トッド・ヒューイット酵母(THY)の15 mLで一晩(指数相の場合)5%CO2インキュベーターに。 1時間前に一晩のインキュベーションが完了し、ポリl-リジン溶液の1 mLまたはガラス底皿のガラス部分をカバーし、1時間のバイオセーフティキャビネットに残すのに十分な実験的なサンプル皿をコーティングします。設定後、ポリl-リジン溶液を吸引し、PBSで3倍の食器を洗いすす。 細菌インキュベーションの18 – 24時間後、0.6 -0.7の光学密度が達成されるまで細菌懸濁液の1 mLでTHYを接種する(接種のための典型的な値は、皿あたりの細菌懸濁液の1 mLでTHYの3 mLである)。各ポリl-リジンコーティング皿に新しい細菌溶液1 mLを加え、1時間インキュベートします。最後の10分の間に、各皿に1mLの緑色蛍光膜染色(1μMの濃度)を加えます。 各皿を3倍にPBSで洗いすします。バイオセーフティキャビネット内の室温で15分間、4%パラホルムアルデヒド溶液の約1mLで細菌を静かに固定します。各皿3倍を固定後にPBSで洗いす。 ヒト胚性腎臓(HEK)293細胞を液体窒素に保存する。めっきする前に37°Cの水浴で速い解凍を行います。 細胞培養液中の基膜マトリックス溶液1 mLを各細胞サンプル皿に加え、37°Cで1時間インキュベート(5%CO2)します。溶液を吸引し、細胞培養培地で洗う。必要な数のHEK 293細胞(例えば、35mm皿あたり10万個の細胞)をプレートし、2mLの細胞培養培地を加えます。その後、細胞を37°Cで48時間インキュベートする(5%CO2)。 48時間後、各細胞サンプル皿に蛍光微小管細胞骨格色素(濃度1x)を2μL加え、30分間インキュベートします。色素を含む溶液を吸引し、細胞3xをPBSで洗浄し、2mLの細胞培養培地を添加した。 サンプルディッシュに1μLのプラズマ膜色素(濃度10μM)を加え、30分間インキュベートします。色素3xを含む溶液をPBSで洗浄し、2mLの細胞培養培地を加える。 サンプルディッシュに1μLの核酸色素(濃度10μM)溶液を加えて核核に対抗し、30分間インキュベートします。3xの染料を含む溶液をPBSで洗浄し、2mLの培養培地を加える。 3. AFM手順 コンピュータ上のソフトウェアアイコンをクリックして、原子間力顕微鏡(AFM)動作ソフトウェアを開きます。 低倍率の空気の目的(推奨 10x または 20x)に回転または挿入します。5 mm 以上の長時間の作業距離は、チップの低下とキャリブレーションの際に有益です。 選択したセル・サンプル・ステージをまだインストールしていない場合は、マウントします。ライブサンプルの場合は、皿ヒーターを使用してサンプルを希望の温度に保ちます。 PBS(ステップ1.2で調製)または同様の透明な液体(キャリブレーション皿)の半分充填されたクリーンな、システム承認ペトリ皿をロードします。サンプルステージにクラスプが内蔵されている場合は、これらを使用し、それ以外の場合は真空グリースを使用してサンプルを安定させ、 目的のデータ収集に適した AFM 片持ちレバーを選択し、以下の手順に従ってインストールします。 手袋を使用して、AFMチップ取り付けステージ、ピンセット、および小さなドライバーを使用して、AFMチップをガラスブロックに取り付けます。慎重にガラスブロックにAFMチップを配置し、それが中央になるようにそれを向けます。片持ちは、AFMチップの非常に小さな部分を加えて、取り付けブロックの可視、非不透明な部分にする必要があります。 チップがガラスブロックにぴったりとぴったりになるまでネジを締めて、スクリュードライバーでチップを固定します。ステレオ顕微鏡またはハンドヘルドスパイグラスを使用して、AFM片持ちレバーの向きが正しいことを確認します。必要に応じて調整します。適切に向けた後、適切な方向でガラスブロックをAFMヘッドに配置し、所定の位置にロックします。注:ガラスブロック内のAFMチップの向きは、システムレーザーがカンチレバーの裏側を目指し、光検出器に正しく反射するように重要です。この手順では、AFMチップ、片持ちレバー、またはチップが破損する可能性がありますので、配置中にネジを締め過ぎないように注意してください。 共焦点顕微鏡の明視野オプションを使用して、フォーカスノブを使用してキャリブレーション皿の底部を見つけます。この z 高さを顕微鏡の目的に対して皿の底が位置する値として注意してください。 Zステッパーモーターを作動させるコンピュータ上のAFMシステムのモーターコントロールパネルを使用して、AFM片持ちレバーをサンプルから2000μm上方に移動します。 両手を使用して、AFMチップを搭載したAFMヘッドをサンプルステージにそっと置き、AFMヘッドの垂直ポイントのそれぞれがAFMステージの指定された溝にしっかりと設定されていることを確認します。AFMヘッドが所定の位置に置かれたら、片持ちホルダーが皿にどれだけ近いかを視覚的に見ます。AFMヘッドが接触しているか、サンプル皿の上部から1mm以内にあるように近すぎると思われる場合は、サンプルに向かってAFMチップを下げる前にzステッパーモーターを使用して戻します。 明視野照明を使用して、AFMソフトウェアのzステッパーモーターコントロールパネルを使用して、ガラス皿の底部にAFMチップをゆっくりと下げます。計器プラットフォーム上のAFMヘッドのx-yまたは面内の動きを制御するマニュアルマイクロメータを見つけます。カンチレバーが見えてくるとAFMヘッドを補正することで、視野内のAFM片持ち面の位置を調整します。 この時点では皿の底に関する位置は不明なので、ペトリ皿にAFMチップをクラッシュさせないように100〜200 μmのステップで低くします。通常、チップは800〜2000 μm下げる必要があります。先端が下がるにつれて、AFM先端が皿の底に近づいているのを示す顕微鏡ソフトウェアビューに影が現れるのを見てください。 20 ~50 μm に増分を減らします。カメライメージの参照テーブル(LUT)は、先端が皿の中に下がるように、コンフォーカルソフトウェアの[LUT]パネルを使用して調整してください。小さなステップを使用して AFM チップを下げて、ほとんどがフォーカスされるまで引き続き下げます。 先端が十分に暗く、一般的な形状が視野に見えて中央に表示されるようにします。また、チップがぼやけて表示され、まだ皿の底に遭遇していないことを確認します。 先端が焦点を合わせ、目的の作業距離を念頭に置いて顕微鏡の焦点を調整します。より高い倍率の目的に移動する前に、顕微鏡測定ツールを使用して、共焦点ソフトウェアの測定ツールパネルにアクセスしてAFM片持ち器の幅と長さを収集します。これらの測定値に注意してください。注:サンプル皿がAFMチップに接触し、潜在的に損傷を与える可能性のあるサンプル皿の底に目的をクラッシュさせないようにすることが重要です。 レーザー光フィルターが存在する場合は、レーザー光フィルタを取り外し、AFMレーザーがオンになっていることを確認して、光学でレーザー光が見えるようにします。 レーザーアライメントダイヤルを使用して、レーザーを視野に移動し、AFMチップの近くに移動します。レーザーがこの位置に入ったら、レーザー光フィルターを交換してください。 レーザーアライメントダイヤルを使用して、AFMチップがカンチレバーにある場所の裏側にレーザーを置きます。この時点で、レーザー位置合わせパネルは、0.0 V より大きい合計信号を読み取る必要があります。合計信号が得られない場合は、手動で制御されたミラーノブを使用して、0.0 Vより大きい信号が画面で読み取られるまでミラーを調整します。 最大合計信号が達成されるまで、AFM片持ち面のすべての方向に少量のレーザーを動かしますが、位置はAFM先端にあります。レーザー位置を設定したら、手動で制御されたたわみダイヤルを使用して、垂直および横方向の偏向をゼロにします。 AFMソフトウェアのレーザーアライメントパネルを観察し、AFMヘッドの垂直および横方向の偏向ノブを使用して、ターゲットが中央(十字線の中心に赤い点)になり、垂直または横方向の偏向がないように検出器を位置合わせします。 AFMソフトウェアでキャリブレーションウィンドウを開きます。すべての実験固有の情報を入力します。キャリブレーションを行う前に、コンフォーカル顕微鏡の光源をオフにし、該当する場合はAFMエンクロージャを閉じて、部屋の光や部屋の振動から発生する潜在的なノイズを減衰させます。次に、キャリブレーションボタンを押して、システムが自動的にチップをキャリブレーションできるようにします。キャリブレーションが完了すると、カンチレバー(N/m)の剛性と感度(nm/V)がキャリブレーションパネル内に表示されます。後で分析するために、これらをメモします。 ステッパーモーターで少なくとも2000 μmのAFM片持ちレバーを引き込みます。AFMヘッドをステージから外し、キャリブレーション皿を取り外します。目的の目標に回転または挿入します。システムが目標間で同じ焦点面を維持するようにプログラムされている場合は、作業距離の目標10%を撤回します。これが油の目的である場合は、目的の目に浸漬油の1滴を置きます。注: 目的の取り消しは、配置中にサンプル皿に接触する客観的な可能性を低減します。 サンプル皿を所定の位置に固定するには、綿棒を使用してサンプルステージ内のサンプルリングの端に真空グリースの小さなダブを塗布するか、サンプルクリップを使用します。サンプル皿を慎重にサンプルステージに積み込みます。 サンプルを入れたら、それを数回回転させて、グリスを介してサンプルホルダーに皿の良好なシールを確保します。油が目的の目の上にウィックするまで、皿の底に目的を上げます。 顕微鏡を用いて、ステージ上にAFMヘッドを置かずに、サンプルが焦点を合わせるようにイメージングシステムをフォーカスする。参照用にこの z 高さに注意してください。 AFMヘッドを慎重にプラットフォームに交換してください。 zステッパーモーターを使用して、サンプルに向かって先端を下げます。AFM チップが下がった場合は、必要に応じて、明視野の画像でテーブル (LUT) を検索します。先端をほぼ鋭くなるまで下げます。手動で操作されたAFMチップ位置マイクロメータを使用して、AFM先端が中央または左の視野中央に置かるようにAFMヘッドを動かします。注:AFMのz高さはステップ3.6で前に指摘されていたので、AFM先端を下げるためにより大きなステップが取られるかもしれませんが、グリースは皿の底に加え、潜在的に目的に油を加えられたので、この値は参照のためだけです。50 ~ 100 μm のステップをとり、チップが焦点を合わせると調整を小さくすることをお勧めします。 AFMヘッドの手動マイクロメーターを使用して、レーザー位置を調整します。必要に応じて、それぞれのノブを調整して垂直および横方向の偏向をゼロにし、サンプル皿のAFM片持ち体を再調整します。注: カンチレバーがサンプルとは異なる媒体で較正された場合、屈折率の潜在的な変化を考慮して、スキャン媒体で再較正する必要があります。さらに、レーザーは騒音や温度変化のためにカンチレバーの裏側からドリフトする可能性があります。レーザーを再調整し、必要に応じて再較正し、非接触キャリブレーションを使用する場合はガラス基板上のサンプル皿に再キャリブレーションします。接触キャリブレーションを使用する場合は、サンプル媒体を使用してキャリブレーション皿の内部を再調整します。 高品質の共焦点顕微鏡画像を実現するには、電流減衰光フィルタを、すべてのAFMレーザー光を遮断するフィルタに交換してください。このライトフィルターはAFMレーザーの明るい光からの干渉を保障しない。 一般的に下向きの矢印で示される自動アプローチコマンドボタンを使用して、サンプル皿の底部に先端を下げます。スキャンのサイズ/エリア、解像度、設定ポイント、z の長さ、ピクセル時間(またはキャリブレーション/伝播された値を使用)をイメージングコントロールパネルで設定し、スキャンを開始します。 スキャンが完了したら、サンプル皿の新しい測定位置に移動する前にAFMチップ50–100 μmを持ち上げます。新しい場所が見つかったら、ガラスに近づき、手順3.21と3.22に従って再スキャンを開始します。 [ 自動保存 ] オプションを選択するか、[保存] をクリックして、個々のスキャンから生成された各ファイルを手動で 保存します。 4. 共焦点手順 コンフォーカル動作ソフトウェアを開きます。関連するすべての周辺機器、光源、およびコントローラの電源が入っており、正常に機能していることを確認します。 サンプルを表示するには、低倍率(10xまたは20x)の目的を回転または挿入します。目的がサンプル皿の場所から安全な作業距離にあることを確認し、必要に応じて、目的とサンプルの潜在的な衝突を避けるために目的をバックアウトします。綿棒を使用して、サンプル皿リングの端の周りに真空グリースをダブ。油の目的を使用する場合は、目的のフロントレンズに浸漬油の一滴を置きます 目的のサンプルをサンプルステージに配置します。サンプルを数回回転して、真空グリースがサンプルステージの挿入部に密着した結合を生成しているか、サンプルクリップを使用していることを確認します。油の目的を使用する場合は、油がちょうどガラスの底の上にウィックするように皿の底に目的を上げます。過度の漂白を避けるために、周囲の照明を最小限に抑えます。 カメラまたは接眼レンズを介して明視野または蛍光モードを使用して、サンプルを見つけ、フォーカスノブを使用して、複数の細胞または単一の細胞を含む対象領域に焦点を当てます。光学顕微鏡内の視野は、AFMシステムのx-y走査ウィンドウ(100 x 100 μm)よりも大きくなることがよくあります。AFMスキャンと共焦点光学が同じ機能をイメージングするように、AFMソフトウェアのモーターコントロールパネルを使用して、共焦点分野内のAFM位置を調整します。注: 視野内では、通常はセルが数個しかないので、どのセルを探す必要があるかを簡単に判断できます。AFMが実施されると、セルはAFMソフトウェア上で見えるようになり、そこから、ユーザーはプローブに関心のある特定の領域を特定することができます。 必要に応じて、サンプルのラベル、フォーカスノブ、および顕微鏡ソフトウェアのキャプチャボタンに基づいて、カメラまたはCLSMモードを使用して明視野または蛍光の画像をキャプチャします。 顕微鏡ソフトウェアを使用して、オプションを選択するか、パネルを開いて共焦点機能(例えば、レーザーとその後のパラメータ)を有効にします。このオプションは、通常、レーザー線の波長値によって示されます。 サンプルの染色に使用する染料に適したレーザーラインを選択します。1 つまたは複数のレーザー ラインをオンにして、サンプル内のフィーチャを励起してイメージします。 ゲインを、サンプルの蛍光を最適化する値に設定しますが、ノイズの量を制限します。一般的な開始値はゲイン 70 です。 飽和ピクセルを避けるが、ダイナミックレンジを最大化するためにレーザーパワーを調整します。レーザーパワーの一般的な開始範囲は1~3%です。 ピンホールのサイズを 1 Airy ユニットに設定して、光断面の解像度を最大化します。サンプルが薄暗く、レーザーパワーがすでに高い場合は、ピンホールを開けて、z軸の分解能を下げる費用で信号を増やします。 ピクセルのドウェル時間(すなわち、スキャン速度)を設定します。2 μs のドウェル時間から始めて、必要に応じてサンプルの明るさを反映するように調整します。ナイキストオプションボタンと画像内の選択したピクセル数を使用して計測器に計算させることで、選択した目的のピクセルサイズ/スキャンサイズを選択します。注: 厚いサンプルの長いドウェル時間は、z スタックが収集される際に過度の漂白につながる可能性があります。 計測器のソフトウェアで[スキャン ]オプションを選択し、データ収集を開始します。メモ:機器に複数のレーザーがある場合、それぞれを個別に最適化し、マルチ蛍光画像に対して同時に実行することができます。 フォーカスノブを使用してズームインとズームアウトを行い、サンプル内の最適な視野を見つけます。 システムの キャプチャ ボタンを使用してイメージをキャプチャし、コンピューターのハード ドライブまたはローカルの外付けハード ドライブ上の目的の場所/フォルダーにサンプルのすべての必要なファイル形式を保存します。 ゲイン、レーザーパワー、ピンホールサイズ、サンプリングレートなどの値を調整し続けて、画像を最適化します。ピクセルの彩度インデックスをアクティブにして、ピクセルが飽和状態になっているかどうかを確認できます。この過飽和が存在する場合、ゲインとレーザーパワーを再調整して飽和ピクセルを排除できます。特定の調整を行うガイドとして、この LU を使用します。 可能であれば、ソフトウェアに表示されるシステムのナイキストサンプリングレートをパネルまたはボタンとして使用して、画像が最大解像度で収集されるようにします。 共焦点システムの z スタックまたはイメージボリューム収集ツールをアクティブにします。ボトムツートップオプションを使用して、レーザーラインを1本のみ、特にサンプルのフィーチャを最も鮮明に照らすレーザーラインを使用して、測定するボリュームの開始面と終了平面を設定します。 Z スタック内の平面間の推奨間隔を使用して、計測器および使用したレーザーラインで得られる最適なアキシャル解像度のナイキストサンプリング基準を満たすために計算されます。 複数のレーザラインを使用する場合は、最短波長を使用して間隔を計算します。取得が完了したら、ファイルを適切なフォルダに保存します。 または、サンプルの厚さに 関する予備知識 がある場合は、最も明るくシャープに見える中央平面を選択して、体積を定義します。この場合、上部を中央平面の上のサンプル厚さの半分に、下部を中央平面の下の厚さの半分に設定します。 この視野でのサンプル収集が完了した後、またはサンプルが漂白された後、電動または手動で制御されたステージを使用してサンプル上の別の対象場所を見つけ、画像収集の手順を繰り返します。 5. クリーンアップ手順 CLSM と AFM の両方からのすべてのデータ・ファイルが適切な場所に保存されていることを確認します。 Zステッパーモーターを少なくとも2000 μm、またはサンプル表面に到達するために移動した距離を使用してAFMチップを引き込みます。AFMヘッドをステージから取り外し、慎重に休憩場所に置きます。 顕微鏡の目的を引き込み、サンプルから遠く離れる。油の目的が使用された場合、目的とサンプル基板との間に接触がなくなるように、目的を十分に引き込む必要があります。 手袋を使用して、サンプルを取り出し、サンプル皿の底からグリースと油をきれいにします。新しい、清潔で空のペトリ皿を取得し、70%エタノール溶液1分の1〜4分の3でそれを満たします。サンプルホルダーに入れ、AFMヘッドを交換して、AFMチップをエタノール溶液に5分間浸します。 AFMチップが浸漬している間、実験データを外付けハードドライブにコピーすることをお勧めします。AFMチップをエタノール溶液に5分以上浸漬した後、AFMヘッドを取り外し、その安静所に置きます。 手袋を使用して、AFMチップホルダーを取り外し、取り付けステーションに設置します。ゴムグリップ付きピンセットを使用して慎重にAFMチップを取り外します。使用した先端を、軸外の向きから来たボックスの位置に戻して、使用されたことを示します。今後の参考のために、実験で使用されたチップをメモしておきます。 エタノール溶液を充填したペトリ皿をシステムから取り出し、液体と皿を処分します。手袋、レンズクリーナー、レンズワイプを使用して、標準的なプロトコルに従って顕微鏡の目的から油を静かに洗浄します。グリスを取り除いてサンプルホルダーを清掃します。バイオセーフティプロトコルに従ってすべての廃棄物を廃棄し、既知の場所に工具を返却します。 コンピュータからのデータ収集を終了し、シャットダウンします。実験に使用するすべての機器、アクセサリ、周辺機器、またはその他のデバイスの電源を切ります。