Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) on Live Cells

Joree  N. Sandin; Surya  P. Aryal; Thomas Wilkop; Christopher  I. Richards; Martha E. Grady

doi:10.3791/61433

JoVE Journal > Bioengineering

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생체공학

À proximité de Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) on Live Cells

Published: August 11, 2020

doi:

10.3791/61433

Joree N. Sandin¹, Surya P. Aryal², Thomas Wilkop^3,4, Christopher I. Richards^2,4, Martha E. Grady¹

¹Department of Mechanical Engineering,University of Kentucky, ²Department of Chemistry,University of Kentucky, ³Department of Physiology,University of Kentucky, ⁴UK Light Microscopy Core,University of Kentucky

Summary

Présenté ici est le protocole de la technique Conpokal, qui combine la microscopie confoccale et de force atomique en une seule plate-forme d’instrument. Conpokal fournit la même cellule, la même région, l’imagerie confocale presque simultanée et la caractérisation mécanique des échantillons biologiques vivants.

Abstract

Les techniques disponibles pour la caractérisation mécanique à micro et nano-échelle ont explosé au cours des dernières décennies. De la poursuite du développement du microscope électronique à balayage et à transmission, à l’invention de la microscopie à force atomique et aux progrès de l’imagerie fluorescente, des progrès substantiels ont été réalisés dans les technologies qui permettent l’étude de petits matériaux. Conpokal est un portmanteau qui combine microscopie confoccale et microscopie à force atomique (AFM), où une sonde « pique » la surface. Bien que chaque technique soit extrêmement efficace pour la collecte qualitative et/ou quantitative d’images par elle-même, Conpokal offre la possibilité de tester avec l’imagerie par fluorescence mélangée et la caractérisation mécanique. Conçu pour l’imagerie confocale quasi simultanée et l’enquête sur la force atomique, Conpokal facilite l’expérimentation d’échantillons microbiologiques vivants. L’aperçu supplémentaire de l’instrumentation jumelée fournit la co-localisation des propriétés mécaniques mesurées(p. ex.,modulus élastiques, adhérence, rugosité de surface) par AFM avec des composants subcellulaires ou une activité observable par microscopie confocale. Ce travail fournit un protocole étape par étape pour le fonctionnement de la microscopie confocale et de force atomique à balayage laser, simultanément, pour atteindre la même cellule, la même région, l’imagerie confocale et la caractérisation mécanique.

Introduction

Des outils d’évaluation mécanique à micro ou nano-échelle sont souvent utilisés pour découvrir les caractéristiques de déformation au niveau d’une seule cellule ou micro-organisme, tandis que des outils distincts de microscopie haute résolution sont utilisés pour visualiser les processus subcellulaires et les caractéristiques structurelles. Conpokal, est la combinaison de microscopie confoccale à balayage laser et de microscopie à force atomique (AFM) en une seule plate-forme instrumentale. La technique conpokal a d’abord été mise en œuvre dans un système polymère non biologique, où l’objectif était de déterminer l’adhérence, l’élasticité et la tension de surface des surfaces dures en contact avec des surfaces molles. Les images confoccales ont fourni un rendu visuel de la façon dont le polymère déforme, adhère et libère de la sonde dure¹^,². Des polymères aux échantillons biologiques, cette technique offre la possibilité d’imagerie confococale quasi simultanée de cellules vivantes ou de micro-organismes et d’AFM.

Des changements dans l’élasticité cellulaire ont été impliqués dans la pathogénie de nombreuses maladies humaines³ y compris les troubles vasculaires⁴Paludisme⁵^,⁶Drépanocytose⁷Arthrite⁸Asthme⁹, et le cancer⁶^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵. Les techniques courantes pour mesurer la mécanique des cellules comprennent l’utilisation de perles magnétiques¹⁶^,¹⁷, pinces optiques¹⁸^,¹⁹, aspiration micropipette⁸^,²⁰^,²¹^,²², et l’AFM¹¹^,²³^,²⁴^,²⁵^,²⁶. Depuis l’application de l’AFM aux cellules vivantes, il a été facilement adapté pour caractériser la topographie cellulaire²⁷^,²⁸ ainsi que les propriétés mécaniques¹¹^,²⁴^,²⁹^,³⁰^,³¹ avec une précision nanométrique. L’AFM a été encore adaptée à la microrhéologie³²^,³³, modulation des fréquences³⁴^,³⁵, et fluage²⁵^,³⁶^,³⁷ d’étudier les propriétés viscollastiques de diverses lignées cellulaires. L’utilisation d’un modèle de nanocontact approprié est essentielle à l’extraction des valeurs quantitatives d’élasticité à partir des mesures d’indentation de force produites par l’AFM¹^,². Des études de l’AFM qui étudient l’influence des médicaments cytosquelettiques sur l’élasticité cellulaire ont montré que le module élastique était fortement affecté³⁸. Sur la base des mesures élastiques du module, de nombreux chercheurs ont montré que les cellules cancéreuses sont plus douces que leurs homologues non transformées¹¹^,³⁸^,³⁹. Une déformabilité accrue joue probablement un rôle de premier plan dans la capacité des cellules cancéreuses à métastaser et à infiltrer les tissus⁴⁰. Un tel comportement est régulé par des modifications dans l’organisation cytosquelettique des cellules³⁸^,⁴¹^,⁴². En plus du cancer, une autre classe de maladies mécaniques dépendantes sont les maladies respiratoires. Par exemple, le syndrome de stress respiratoire aigu touche de plus en plus d’humains chaque année. Il a été démontré que lorsque les patients sont mis sous ventilation mécanique, avec des concentrations élevées d’oxygène, leur état peut s’aggraver⁴³. Dans une série d’études observant les macrophages épithéliales alvéolaires avec AFM, les scientifiques ont constaté que l’addition d’un environnement riche en oxygène augmentait la rigidité des cellules dues à la formation d’actine ; un excellent exemple de l’impact de l’AFM sur notre compréhension détaillée de l’influence environnementale atmosphérique sur la fonction respiratoire au niveau cellulaire et, en fin de compte, sur la guérison et la santé humaines⁴⁴^,⁴⁵^,⁴⁶. La rigidité épithéliale des cellules pendant la migration vers une plaie peut également être évaluée par l’intermédiaire de l’AFM et qu’une variation du module élastique se produit pour signaler la propagation future des cellules⁴⁷^,⁴⁸. Par conséquent, il est nécessaire de mesurer quantitativement la mécanique cellulaire pour comprendre en quoi les cellules malades diffèrent et interagissent avec les cellules saines.

L’AFM est également utilisé pour étudier les propriétés adhésives et la structure de surface. Un microscope à force atomique a une variété de modes pour recueillir des informations sur un échantillon à l’aide de la mécanique de contact. Pour les échantillons biologiques vivants, deux des principaux objectifs sont d’obtenir des valeurs quantitatives des propriétés mécaniques(p. ex.,moduli élastique, forces adhésives) ainsi que la hauteur de surface de la carte. Ces modes incluent le mode de taraudage (également connu sous le nom de contact intermittent), qui maintient une amplitude constante en porte-à-faux en contactant par intermittence la surface de l’échantillon et le mode de contact, ce qui soulève ou abaisse le porte-à-faux pour maintenir une déviation constante⁴⁹. Les cartes d’adhérence peuvent être recueillies à l’aide de la cartographie de la force sur le système AFM. Le porte-à-faux en retrait de l’échantillon à une certaine force et est ensuite rétracté. La résistance à la rétractation de la force est mesurée par le détecteur pour générer un graphique de déplacement de la force. La force d’adhérence est la force maximale mesurée lors de la rétractation. La morphologie de surface fournit une vue détaillée de l’échantillon au niveau micro ou nano. Le porte-à-faux complète un balayage raster à travers l’échantillon basé sur l’indentation et la déflexion capturée par le mouvement du porte-à-faux à chaque pixel, révélant des caractéristiques micro- et nano-taille. Avec AFM, la taille de petites caractéristiques telles que la structure peptidoglycane⁵⁰, l’alignement de la chaîne^{polymère 51}, flagella⁵², lamellipodia⁵³, et filipodia⁵⁴ peut être mesurée. Bien que la puissance de l’AFM réside dans les courbes de déplacement de la force et les images topologiques non optiques, la microscopie confocale offre une imagerie détaillée des échantillons étiquetés fluorescents.

La microscopie confocale à balayage laser (CLSM) est une technique dominante pour l’imagerie des cellules vivantes, des cellules fixes et^{des tissus 55}^,⁵⁶^,⁵⁷. CLSM est utilisé pour l’imagerie biologique depuis 1955, c’est-à-diredepuis^{sa création 58}^,⁵⁹. Alors que le principe de travail des microscopes confocaux(c.-à-d.le rejet de la lumière hors foyer par un sténopé) est resté en grande partie le même, la mise en^{œuvre technique est devenue très diversifiée 56}^,⁵⁷^,⁵⁸^,⁶⁰. L’imagerie confocale peut être implémentée par balayage multipoint, comme dans un système de disque de^{filature 61,}balayage de point d’un faisceau laser simple, comme dans la numérisation^{en ligne 62,}ou l’imagerie de la fonction de propagation de point avec des réaffectations ultérieures de pixel par l’intermédiaire d’un détecteur multi-élément^57. Les progrès récents qui élargissent l’utilité de l’imagerie confocale incluent la capacité de balayage laser, le balayage de résonance à grande vitesse, et les détecteurs^{de sensibilité élevée 63}^,⁶⁴^,^65. L’avantage que tous les systèmes confocaux ont sur les microscopes widefield est la capacité d’effectuer la section optique dans l’axe z avec plus de détails, en particulier dans les échantillons épais. Les microscopes widefield utilisant la détection basée sur la caméra recueillent la lumière qui est émise par le plan focal et, simultanément, la lumière émise de partout dans le chemin d’éclairage. En fermant le sténopé, au prix de la réduction du signal, la résolution axiaale et latérale peut être augmentée^{de 66}. Dans CLSM, les images sont construites pixel par pixel grâce à la collecte de signaux d’émission comme un laser excitation est scanné à travers un champ de vision x-y. La collecte de plusieurs plans x-y le long de l’axe z de l’échantillon peut ensuite être utilisée pour reconstruire l’architecture tridimensionnelle de^{l’échantillon 57}^,⁶⁷. La microscopie confocale, conjuguée à l’introduction de protéines fluorescentes, a révolutionné notre compréhension de la biologie^{cellulaire 68}. Par exemple, il est devenu un outil essentiel en neurosciences⁶⁹. Le CLSM est régulièrement utilisé pour observer les tissus défrichés, et pour obtenir des images complètes du cerveau immunisé taché et de l’architecture du réseau neuronal⁷⁰. Cette application a donné lieu à de nouvelles perspectives sur les contacts synaptiques et la communication entre les neurones et les cellules gliales dans le^{cerveau 71}. Des cellules cérébrales aux vésicules, les protocoles de coloration fluorescente soutiennent l’inspection et la capture des fonctions cellulaires par microscopie confoccale pour les progrès des techniques^{thérapeutiques 72}^,⁷³.

Bien qu’il s’arme individuellement d’outils impressionnants et polyvalents, la combinaison de la microscopie confocale et atomique (Conpokal) permet aux chercheurs de corréler de façon unique les propriétés topographiques et micromécaniques cellulaires/tissulaires avec l’observation de divers organites cellulaires et de leur dynamique respective. L’instrumentation appariée permet aux utilisateurs, essentiellement, de « voir » ce qu’ils sondent; un énorme avantage sur une seule technique. Avec Conpokal, la cartographie des forces par l’intermédiaire de l’AFM est superposée à des images confoccales pour corréler la rigidité cellulaire, l’adhérence ou la morphologie à la structure cytosquelettique de l’échantillon, par exemple. L’objectif global de la méthode Conpokal est de fournir aux chercheurs une plate-forme pour étudier les échantillons vivants d’une manière concise et efficace, fournissant à la fois des données d’image et de propriété matérielle en une seule plate-forme. Dans ce travail, nous démontrons le fonctionnement de Conpokal, y compris la sélection et la préparation appropriées de l’échantillon, la configuration des instruments, l’étalonnage en porte-à-faux, et fournissons des lignes directrices pour réussir le dépannage. Après le protocole, nous fournissons des résultats représentatifs qui incluent la cartographie réussie de hauteur de bactéries et de cellules d’AFM, la cartographie de modulus d’AFM de bactéries et de cellules, et l’imagerie confocale des cellules multi-étiquetées, par l’intermédiaire de la même cellule confocal et de l’AFM. Nous concluons par une discussion des étapes critiques de la procédure Conpokal, des recommandations de dépannage, des limitations techniques, de l’importance et des perspectives futures de la méthode.

Protocol

1. Préparation d’instruments, de médias culturels, de plats Activez les sources d’énergie pour le microscope confocal et le microscope à force atomique, ainsi que pour tous les autres instruments ou dispositifs associés utilisés pendant Conpokal. Prévoyez suffisamment de temps pour que les instruments équilibrent thermiquement et se stabilisent avant de commencer les mesures. En général, 1 h suffit. Préparez une boîte de Pétri propre, approuvée par le système et à fond de verre et remplissez-la à moitié pleine, mais pas plus des deux tiers pleine, avec du salin tamponné au phosphate (PBS) ou un liquide clair similaire. Ce plat (appelé « plat d’étalonnage ») est séparé de l’échantillon de vaisselle et sera utilisé pour localiser et calibrer le porte-à-faux du microscope à force atomique (AFM).REMARQUE : Il est important que le liquide soit clair et qu’il ait une faible autofluorescence afin d’éviter toute interférence avec les spectres de fluorescence. PBS est recommandé parce qu’il imite l’environnement biologique. Préparer des échantillons expérimentaux de sorte que le liquide associé ait rempli le plat au moins à moitié plein. Si l’échantillon est fluorescent, assurez-vous qu’il est couvert ou dans un endroit sombre jusqu’à ce que nécessaire. Nettoyez le fond de tous les plats en verre à l’aide d’un nettoyant pour lentilles et de lingettes pour lentilles. Créez des dossiers de stockage de données pour le confocal et l’AFM sur le disque dur de l’ordinateur. 2. Sélection de cellules ou de micro-organismes Pour créer une solution de stock de bactéries, inoculer les bactéries Streptococcus mutans, à l’aide d’une boucle d’inoculation, dans 15 mL de levure Todd Hewitt (THY) du jour au lendemain (pour phase exponentielle) dans un incubateur de CO2 à 5 %. 1 h avant la fin de l’incubation pendant la nuit, enrober les plats d’échantillons expérimentaux de 1 mL de solution poly-l-lysine ou assez pour couvrir la partie en verre du plat à fond de verre et laisser dans l’armoire de biosécurité pendant 1 h. Après réglage, aspirer la solution poly-l-lysine et rincer la vaisselle 3x avec PBS. Après 18 à 24 h d’incubation bactérienne, inoculer THY avec 1 mL de suspension bactérienne jusqu’à ce qu’une densité optique de 0,6 à 0,7 soit atteinte (les valeurs typiques d’inoculation sont de 3 mL de THY avec 1 mL de suspension bactérienne par plat). Ajouter 1 mL de nouvelle solution bactérienne à chaque plat recouvert de poly-l-lysine et incuber pendant 1 h. Au cours des 10 dernières minutes, ajouter 1 mL de tache de membrane fluorescente verte (concentration de 1 μM) à chaque plat. Rincer chaque plat 3x avec PBS. Fixez doucement les bactéries avec environ 1 mL de solution de paraformaldéhyde de 4% pendant 15 min à température ambiante à l’intérieur d’une armoire de biosécurité. Rincer chaque plat 3x avec PBS après fixation. Conserver le rein embryonnaire humain (HEK) 293 cellules dans de l’azote liquide. Effectuez un dégel rapide à 37 °C avant le placage. Ajouter 1 mL de solution matricielle membranaire du sous-sol dans les médias de culture cellulaire à chaque plat d’échantillon cellulaire et incuber (5 % de CO2)à 37 °C pendant 1 h. Aspirez la solution et lavez la vaisselle avec des supports de culture cellulaire. Plaquez le nombre requis de cellules HEK 293(p. ex.,100 000 cellules par plat de 35 mm) et ajoutez 2 mL de médias de culture cellulaire. Puis, incuber (5% de CO2)les cellules à 37 °C pendant 48 h. Après 48 h, ajouter 2 μL d’un colorant fluorescent de cytosquelette de microtubule (concentration de 1x) à chaque plat d’échantillon de cellule et incuber pendant 30 min. Aspirer la solution contenant le colorant, laver les cellules 3x avec PBS, et ajouter 2 mL de médias de culture cellulaire. Ajouter 1 μL de colorant à membrane plasmatique (concentration de 10 μM) à l’échantillon de vaisselle et incuber pendant 30 minutes. Lavez la solution contenant le colorant 3x avec PBS et ajoutez 2 mL de médias de culture cellulaire. Contrestain le noyau en ajoutant 1 μL d’un colorant à l’acide nucléique (concentration de 10 μM) solution à la vaisselle échantillon et incuber pendant 30 min. Lavez la solution contenant le colorant 3x avec PBS et ajoutez 2 mL de médias culturels. 3. Procédure AFM Ouvrez le logiciel d’exploitation du microscope à force atomique (AFM) en cliquant sur l’icône logicielle de l’ordinateur. Tournez vers ou insérez un objectif d’air à faible grossissement (recommandé 10x ou 20x). Une longue distance de travail de 5 mm ou plus est bénéfique lors de l’abaissement de la pointe et de l’étalonnage. Montez l’étape de l’échantillon cellulaire choisi si elle n’est pas déjà installée. Pour les échantillons vivants, utilisez un chauffe-vaisselle pour garder l’échantillon à la température désirée. Chargez la boîte de Pétri propre et approuvée par le système remplie à moitié pleine de PBS (préparée à l’étape 1.2) ou d’un liquide clair similaire (plat d’étalonnage). Si l’étape de l’échantillon a des fermoirs intégrés, utilisez-les, sinon, utilisez de la graisse sous vide pour stabiliser l’échantillon. Sélectionnez un porte-à-faux AFM approprié pour la collecte de données souhaitée et installez-le en suivant les étapes ci-dessous. À l’aide de gants, montez la puce AFM dans le bloc de verre à l’aide de la scène de montage des copeaux AFM, d’une pince à épiler et d’un petit tournevis. Placez soigneusement la puce AFM sur le bloc de verre et orientez-la de telle sorte qu’elle soit centrée. Le porte-à-faux, plus une très petite partie de la puce AFM, devrait se faire dans la partie visible et non opaque du bloc de montage. Fixez la puce avec le tournevis en serrant la vis jusqu’à ce que la puce soit bien ajustée contre le bloc de verre. Vérifiez que le porte-à-faux AFM est bien orienté à l’aide d’un microscope stéréo ou d’un verre espion portatif. Ajustez au besoin. Une fois bien orienté, placez le bloc de verre dans la tête de l’AFM dans l’orientation appropriée et verrouillez-le en place.REMARQUE : L’orientation de la puce AFM à l’intérieur du bloc de verre est importante pour que les lasers du système visent à l’arrière du porte-à-faux et réfléchissent correctement sur le photodétecteur. Veillez à ne pas trop étancher les vis pendant le placement car cette procédure pourrait provoquer la rupture de la puce, du porte-à-faux ou de la pointe de l’AFM. En utilisant l’option brightfield du microscope confocal, localiser le fond du plat d’étalonnage en utilisant le bouton de mise au point. Notez cette hauteur z comme la valeur où le fond du plat est situé par rapport à l’objectif microscope. À l’aide du panneau de commande moteur du système AFM sur l’ordinateur qui actionne les moteurs z stepper, éloignez le porte-à-faux AFM de l’échantillon vers le haut de 2000 μm. À l’aide des deux mains, placez doucement la tête de l’AFM avec la puce AFM sur la scène de l’échantillon en vous assurant que chacun des points verticaux de la tête de l’AFM est solidement placé dans leurs rainures désignées sur la scène AFM. Une fois que la tête AFM est en place, voyez visuellement à quel point le support en porte-à-faux est proche du plat. S’il semble trop proche, de sorte que la tête de l’AFM est en contact ou à moins de 1 mm du dessus du plat de l’échantillon, reculez à l’aide des moteurs z stepper avant d’abaisser la pointe AFM vers l’échantillon. À l’aide d’un éclairage à champ lumineux, abaissez lentement la puce AFM au fond du plat en verre à l’aide du panneau de commande du moteur z stepper sur le logiciel AFM. Localisez les micromètres manuels qui contrôlent le mouvement x-y ou en plan de la tête AFM sur la plate-forme de l’instrument. Ajustez la position du porte-à-faux AFM dans le champ de vision en corrigeant la tête de l’AFM au fur et à mesure que le porte-à-faux entre en vue. Puisque l’emplacement en ce qui concerne le fond de la boîte est inconnu pour le moment, plus bas avec des étapes de 100 – 200 μm pour éviter de planter la pointe de l’AFM dans la boîte de Pétri. En règle générale, la pointe doit être abaissée de 800 à 2000 μm. Lorsque la pointe est abaissée, surveillez l’apparaître d’une ombre sur la vue logicielle du microscope, ce qui indique que la pointe de l’AFM se rapproche du fond du plat. Diminution des incréments à 20 à 50 μm. Assurez-vous d’ajuster les tables de rechercher (LUTs) de l’image de la caméra que la pointe se abaisse dans le plat en utilisant le panneau LUTs sur le logiciel confocal. Continuer à abaisser la pointe AFM en utilisant de petites étapes jusqu’à ce qu’il soit principalement au point. Assurez-vous que la pointe est assez foncée pour que la forme générale de celui-ci puisse être vue et centrée dans le champ de vision. Assurez-vous également que la pointe semble floue, ce qui confirme qu’elle n’a pas encore rencontré le fond du plat. Ajustez la mise au point au microscope de telle sorte que la pointe est maintenant au point, en gardant à l’esprit la distance de travail de l’objectif. Avant de passer à un objectif de grossissement plus élevé, utilisez l’outil de mesure du microscope pour recueillir la largeur et la longueur du porte-à-faux AFM en accédant au panneau des outils de mesure sur le logiciel confocal. Prenez note de ces mesures.REMARQUE : Il est important de ne pas planter l’objectif dans le fond du plat de l’échantillon, ce qui peut également amener le plat de l’échantillon à entrer en contact avec la pointe de l’AFM, ce qui pourrait l’endommager. S’il est présent, retirez le filtre laser et assurez-vous que le laser AFM est allumé, de sorte que la lumière laser devienne visible dans l’optique. À l’aide des cadrans d’alignement laser, déplacez le laser dans le champ de vision et près de la pointe AFM. Une fois que le laser est à cet endroit, remplacez le filtre laser. À l’aide des cadrans d’alignement laser, placez le laser à l’arrière de l’endroit où se trouve la pointe AFM sur le porte-à-faux. À ce stade, le panneau d’alignement laser devrait lire un signal de somme supérieur à 0,0 V. Si aucun signal de somme n’est obtenu, ajustez le miroir en utilisant le bouton miroir commandé manuellement jusqu’à ce qu’un signal de somme supérieur à 0,0 V se lit sur l’écran. Déplacez le laser en petites quantités dans toutes les directions sur le porte-à-faux AFM jusqu’à ce que le signal de somme maximale soit atteint, mais la position est à la pointe AFM. Une fois la position laser réglée, zéro déflexion verticale et latérale à l’aide des cadrans de déflexion contrôlés manuellement. Observez le panneau d’alignement laser sur le logiciel AFM et en utilisant les boutons de déflexion verticale et latérale sur la tête de l’AFM, alignez le détecteur de sorte que la cible soit centrée (point rouge au centre du réticule) et qu’il n’y ait pas de déflexion verticale ou latérale. Ouvrez la fenêtre d’étalonnage du logiciel AFM. Entrez toutes les informations spécifiques à l’expérience. Avant de calibrer, éteignez la source de lumière du microscope confocal et fermez l’enceinte AFM, le cas échéant, pour atténuer tout bruit potentiel provenant de la lumière ambiante ou des vibrations ambiantes. Appuyez ensuite sur le bouton d’étalonnage pour permettre automatiquement au système de calibrer la pointe. Une fois l’étalonnage terminé, la rigidité du porte-à-faux (N/m) et sa sensibilité (nm/V) seront fournies dans le panneau d’étalonnage. Notez-les pour une analyse ultérieure. Rétractez le porte-à-faux AFM d’au moins 2000 μm avec les moteurs stepper. Retirez la tête de l’AFM de la scène et retirez le plat d’étalonnage. Tournez vers ou insérez l’objectif désiré. Rétracter l’objectif de 10% de la distance de travail si le système est programmé pour maintenir le même plan focal entre les objectifs. S’il s’agit d’un objectif pétrolier, placez une goutte d’huile d’immersion sur l’œil de l’objectif.REMARQUE : La rétractation de l’objectif réduit la probabilité que l’objectif contacte le plat de l’échantillon pendant le placement. Pour maintenir solidement le plat de l’échantillon en place, utilisez un coton-tige pour appliquer de petites tampons de graisse sous vide autour du bord de l’anneau de l’échantillon à l’étape de l’échantillon, ou utilisez des pinces d’échantillon. Chargez soigneusement le plat d’échantillon dans l’étape d’échantillon. Une fois que l’échantillon est placé, faites-le pivoter à quelques reprises pour assurer un bon joint du plat au porte-échantillon par l’intermédiaire de la graisse. Soulevez l’objectif au fond du plat jusqu’à ce que l’huile ne s’évacue que sur l’œil de l’objectif. À l’aide du microscope, sans la tête de l’AFM sur la scène, concentrez le système d’imagerie de sorte que l’échantillon soit au point. Notez cette hauteur z pour référence. Remplacez soigneusement la tête AFM sur la plate-forme. À l’aide des moteurs z stepper, abaissez la pointe vers l’échantillon. Lorsque la pointe AFM est abaissée, ajustez les tables de resserré (LUT) dans l’image brightfield au besoin. Baisser la pointe jusqu’à ce qu’elle soit presque tranchante. À l’aide des micromètres de position de pointe AFM actionnés manuellement, déplacez la tête de l’AFM de sorte que la pointe AFM soit au centre ou à gauche centrée dans le champ de vision.REMARQUE : Étant donné que la hauteur z de l’AFM a été notée auparavant à l’étape 3.6, de plus grandes mesures peuvent être prises pour abaisser la pointe de l’AFM, cependant, de la graisse a été ajoutée au fond du plat et potentiellement de l’huile à l’objectif, de sorte que cette valeur est juste pour référence. Il est recommandé de prendre des mesures de 50 à 100 μm et de s’ajuster plus petit au fur et à mesure que la pointe est mise au point. Réajuster la position laser en utilisant les micromètres manuels sur la tête AFM. Si nécessaire, zéro déflexions verticales et latérales en ajustant les boutons respectifs et recalibrer le porte-à-faux AFM dans le plat échantillonné.REMARQUE : Si le porte-à-faux a été calibré dans un milieu différent de l’échantillon, il doit être recalibré dans le support de numérisation pour tenir compte d’un changement potentiel de l’indice réfractif. En outre, le laser peut dériver de l’arrière du porte-à-faux en raison du bruit ou des changements de température. Réajustez seulement le laser et recalibrer si nécessaire et dans le plat d’échantillon au-dessus du substrat en verre si vous utilisez un étalonnage sans contact. Si vous utilisez l’étalonnage de contact, recalibrer à l’intérieur du plat d’étalonnage à l’aide du milieu de l’échantillon. Pour obtenir des images de microscope confocal de haute qualité, remplacez le filtre lumineux atténuant actuel par le filtre qui bloque toute la lumière laser AFM. Ce filtre lumineux n’assure aucune interférence de la lumière vive du laser AFM. À l’aide du bouton de commande d’approche automatisé, généralement indiqué par une flèche orientée vers le bas, abaissez la pointe au bas du plat de l’échantillon. Définissez la taille/zone de l’analyse, la résolution, le point de défini, la longueur z et le temps de pixel (ou utilisez les valeurs calibrées/propagées) sur le panneau de commande d’imagerie et commencez à numériser. Une fois l’analyse terminée, soulevez la puce AFM de 50 à 100 μm avant de naviguer vers une nouvelle position de mesure dans le plat de l’échantillon. Une fois qu’un nouvel emplacement est trouvé, approchez le verre et recommencez à numériser en suivant les étapes 3.21 et 3.22. Sélectionnez l’option Autosave, ou enregistrez manuellement chaque fichier généré à partir de chaque analyse individuelle en cliquant sur Enregistrer. 4. Procédure confoccale Ouvrez le logiciel d’exploitation confoccal. Assurez-vous que tous les périphériques, sources lumineuses et contrôleurs associés sont allumés et fonctionnent normalement. Faites pivoter ou insérez un objectif de faible grossissement (10x ou 20x) pour afficher l’échantillon. Assurez-vous que l’objectif est à une distance de travail sécuritaire de l’endroit où se trouvera le plat de l’échantillon et, au besoin, de revenir sur l’objectif afin d’éviter toute collision potentielle de l’objectif avec l’échantillon. À l’aide d’un coton-tige, tamponner la graisse sous vide autour du bord de l’anneau de vaisselle de l’échantillon. Si vous utilisez un objectif pétrolier, placez une seule goutte d’huile d’immersion sur la lentille avant de l’objectif Placez l’échantillon désiré dans l’étape de l’échantillon. Faites tourner l’échantillon à quelques reprises pour vous assurer que la graisse sous vide a généré un lien serré avec l’insert de l’étape de l’échantillon ou employez des clips d’échantillon. Si vous utilisez un objectif d’huile, augmenter l’objectif au fond du plat de sorte que l’huile se mèche juste sur le fond de verre. Pour éviter un blanchiment excessif, réduisez au minimum l’éclairage ambiant. À l’aide de modes de champ lumineux ou d’épifluorescence via la caméra ou les oculaires, localiser l’échantillon et utiliser le bouton de mise au point, se concentrer sur une zone d’intérêt contenant plusieurs cellules ou une seule cellule. Souvent, le champ de vision à l’intérieur du microscope optique sera plus grand que la fenêtre de balayage x-y sur le système AFM (100 x 100 μm). Faites des ajustements de la position AFM dans le champ de vision confocal en utilisant le panneau de commande moteur dans le logiciel AFM de sorte que l’analyse AFM et l’optique confocale sont l’imagerie des mêmes caractéristiques.REMARQUE : Dans le champ de vision, il n’y a généralement que quelques cellules, de sorte qu’il est plus facile de déterminer quelle cellule est désirée pour sonder. Au fur et à mesure que l’AFM est menée, la cellule devient visible sur le logiciel AFM et, à partir de là, l’utilisateur peut identifier des régions spécifiques d’intérêt à sonder. Si vous le souhaitez, capturez des images en champ lumineux ou en épifluorescence à l’aide d’un appareil photo ou de modes CLSM basés sur l’étiquette de l’échantillon, concentrez les boutons et capturez les boutons sur le logiciel microscope. À l’aide du logiciel microscope, sélectionnez l’option ou ouvrez le panneau pour activer les capacités confoccales(p. ex.,lasers et paramètres subséquents). Cette option est généralement notée par les valeurs de longueur d’onde de la ligne laser. Sélectionnez les lignes laser appropriées pour les colorants qui sont utilisés pour tacher les échantillons. Allumez une ou plusieurs lignes laser pour exciter et imager ces fonctionnalités dans l’échantillon. Réglez le gain à une valeur qui optimise la fluorescence des échantillons, mais limite la quantité de bruit. Une valeur de départ typique est un gain de 70. Ajustez la puissance laser pour éviter les pixels saturés mais maximisez la plage dynamique. Une plage de départ typique pour la puissance laser est de 1 à 3 %. Réglez la taille du sténopé à 1 unité aéroy pour maximiser la résolution pour la section optique. Si l’échantillon est faible et que la puissance laser est déjà élevée, ouvrez le sténopé pour augmenter le signal au prix de la diminution de la résolution de l’axe z. Réglez le temps de vie pixel(c.-à-d.,la vitesse de numérisation). Commencez avec un temps de vie de 2 μs et si nécessaire, ajustez-le pour refléter la luminosité de l’échantillon. Choisissez la taille/scan du pixel pour l’objectif sélectionné en laissant l’instrument le calculer via le bouton d’option Nyquist et le nombre choisi de pixels dans l’image.REMARQUE : Des temps de vie plus longs dans des échantillons plus épais peuvent entraîner un blanchiment excessif lorsque des piles z sont collectées. Sélectionnez l’option Scan sur le logiciel de l’instrument et commencez la collecte de données.REMARQUE : Si l’instrument dispose de plusieurs lasers, chacun peut être optimisé indépendamment, puis utilisé simultanément pour des images multi-fluorescentes. Utilisez le bouton de mise au point pour zoomer et sortir et localiser le champ de vision optimal dans l’échantillon. Capturez des images en utilisant le bouton Capture du système et enregistrez tous les formats de fichiers nécessaires de l’échantillon à l’emplacement/dossier désiré sur le disque dur de l’ordinateur ou sur le disque dur externe local. Continuez d’ajuster le gain, la puissance laser, la taille des trous d’épingle, le taux d’échantillonnage et d’autres valeurs en conséquence pour optimiser l’image. L’indice de saturation des pixels peut être activé pour vérifier si les pixels sont sursaturés. Si cette sursaturation est présente, le gain et la puissance laser peuvent être réajustés pour éliminer les pixels saturés. Utilisez les LUT comme guide pour effectuer des ajustements spécifiques. Si possible, utilisez le taux d’échantillonnage Nyquist du système, qui est affiché dans le logiciel sous forme de panneau ou de bouton, pour vous assurer que les images sont collectées à la résolution maximale obtenue. Activez l’outil de collecte de volume z ou de volume d’image du système confoccal. À l’aide d’une option de bas en haut, avec une seule ligne laser, en particulier la ligne laser qui illumine une fonctionnalité de l’échantillon la plus claire, réglez les plans de démarrage et de finition pour que le volume soit mesuré. Utilisez l’espacement suggéré entre les plans dans la pile z, qui est calculé pour répondre aux critères d’échantillonnage Nyquist pour la meilleure résolution axiaale obtenue offerte par l’instrument et la ligne laser utilisée. Lorsque plusieurs lignes laser sont utilisées, utilisez la longueur d’onde la plus courte pour le calcul de l’espacement. Lorsque l’acquisition se termine, enregistrez le fichier dans le dossier approprié. Alternativement, si une connaissance a priori de l’épaisseur de l’échantillon existe, définissez le volume en sélectionnant le plan intermédiaire, celui qui apparaît le plus brillant et le plus pointu. Dans ce cas, réglez le dessus à la moitié de l’épaisseur de l’échantillon au-dessus du plan du milieu et le fond à la moitié de l’épaisseur au-dessous du plan du milieu. Une fois que la collecte de l’échantillon dans ce champ de vision est terminée, ou que l’échantillon a blanchi, utilisez l’étape motorisée ou contrôlée manuellement pour trouver un autre lieu d’intérêt sur l’échantillon et répéter les étapes de la collecte d’images. 5. Procédure de nettoyage Assurez-vous que tous les fichiers de données, tant du CLSM que de l’AFM, sont enregistrés aux emplacements appropriés. Rétractez la puce AFM à l’aide des moteurs z stepper d’au moins 2000 μm ou de la distance parcourue pour se rendre à la surface de l’échantillon. Retirez la tête AFM de la scène et placez-la soigneusement dans son lieu de repos. Rétractez l’objectif du microscope pour qu’il soit loin de l’échantillon. Si un objectif d’huile a été utilisé, l’objectif doit être rétracté suffisamment loin pour qu’il n’y ait plus de contact entre l’objectif et le substrat de l’échantillon. À l’aide de gants, retirer l’échantillon et nettoyer la graisse, et l’huile, le cas échéant, du fond du plat échantillonné. Acquérir une nouvelle boîte de Pétri propre et vide et la remplir d’une solution éthanol à 70 % de moitié à trois quarts pleine. Placez-le dans le porte-échantillon et remplacez la tête AFM pour permettre à la puce AFM de tremper dans la solution d’éthanol pendant 5 min. Pendant que la puce AFM est trempée, il est recommandé de commencer à copier les données de l’expérience sur un disque dur externe. Après immersion de la puce AFM dans la solution d’éthanol pendant au moins 5 minutes, retirez la tête de l’AFM et mettez-la à sa place de repos. À l’aide de gants, retirez le porte-puce AFM et placez-le dans la station de montage. Retirez soigneusement la puce AFM à l’aide d’une pince à épiler avec des poignées en caoutchouc. Placez la pointe utilisée de nouveau dans l’emplacement de la boîte, il est venu de orienté hors axe pour indiquer qu’il a été utilisé. Pour référence future, notez quel pourboire a été utilisé dans l’expérience. Sortez la boîte de Pétri remplie de la solution d’éthanol du système et jetez le liquide et le plat. À l’aide de gants, d’un nettoyeur de lentilles et de lingettes à lentilles, nettoyez doucement l’huile de l’objectif du microscope selon les protocoles standard. Nettoyez le porte-échantillon en enlevant toute graisse. Éliminer tous les déchets selon les protocoles de biosécurité et retourner les outils à leurs emplacements connus. Terminez la collecte de données à partir de l’ordinateur et arrêtez-les. Éteindre tous les instruments, accessoires, périphériques ou autres appareils utilisés pour l’expérience.

Representative Results

La technique Conpokal est représentée schématiquement dans la figure 1A et une image de la configuration est affichée dans la figure 1B. Afin de co-localiser avec précision les structures biologiques par microscopie confoccale avec les mêmes structures dans l’AFM, l’alignement des deux systèmes lors de l’installation est essentiel. Sélectionnez des fabricants confocals et AFM réputés qui connaissent bien les besoins spatiaux de l’autre. En outre, la mise en œuvre réussie de la technique repose sur de bonnes procédures de coloration, l’immobilisation de la structure biologique, et le choix approprié de la pointe AFM. La hauteur des cellules vivantes présente souvent un défi pour l’imagerie AFM. Un balayage d’AFM au-dessus d’une cellule vivante de HEK est montré dans la figure 2A. La hauteur de cette cellule HEK particulière était d’environ 10 μm, démontrée par l’analyse en ligne en vert (figure 2B). Une pointe AFM avec zéro décalage (la pointe est à l’extrémité du porte-à-faux) ou la hauteur de pointe supérieure à la hauteur de la cellule(p. ex.,hauteur de pointe ≥ 10 μm) produira une image hautement résolue des cellules individuelles. Un exemple de mauvaise analyse en raison d’un mauvais choix de pourboire afm est inclus dans la figure 2C. Dans cette image, des pixels noirs sont apparus au sommet de la cellule indiquant que le piezo AFM est hors de portée en raison d’une grande hauteur cellulaire. L’extrémité du porte-à-faux AFM est apparue dans l’image (un carré arrondi) en raison du décalage de pointe combiné avec la hauteur insuffisante de pointe comparée à la hauteur de cellule. Ces artefacts dans l’image AFM indiquent qu’une autre astuce AFM doit être choisie pour l’image de la cellule. L’étiquetage efficace dans la coloration de fluorescence avec la sonde correcte pour l’imagerie de cellules vivantes sont exigés pour cette méthode. Nous avons exécuté une image confocale tricolore montrée dans la figure 3A avec une tache nucléaire (fluorescing bleu), une tache de microtubule (fluorescing vert), et une tache lipophile de membrane (fluorescing rouge). Ces sondes cellulaires vivantes ont été choisies en raison de leur chevauchement spectral limité et de leur compatibilité avec les cubes de filtre standard. Nous avons également inclus l’image optique brightfield dans la figure 3B. De l’AFM, l’analyse des indentations de pointe avec un modèle nanomécanique, produit une carte modulus de la surface. Un exemple d’une carte modulus construite à l’aide d’un ajustement du modèle Hertz et d’un profil parabolique (rayon de 8 nm) pour la forme de la pointe est indiqué superposé à la reconstruction 3D de la forme cellulaire dans la figure 4A (qui est les deux mêmes cellules indiquées dans la figure 3). La projection 3D correspondante de la pile de z confoccal laser est indiquée dans la figure 4B. La méthode convient également aux petites structures biologiques, y compris les bactéries uniques dont les caractéristiques micro et nanoscopiques sont difficiles à résoudre à l’aide de microscopie légère. Une étude en cours utilise la technique Conpokal pour explorer les mécanismes mécaniques dans la paroi cellulaire qui influencent la résistance aux antibiotiques dans Streptococcus mutans.74 La manipulation des composants de la paroi cellulaire a entraîné des changements dans la morphologie et la résistance aux antibiotiques. Conpokal facilite la collecte de données en direct, en solution (p. ex.,morphologie de surface, module élastique, force d’adhérence et rugosité de surface) sur des échantillons de cellules identiques pour coupler les propriétés mécaniques avec la présence ou l’absence de composants muraux cellulaires. La figure 5A,B comprend un balayage de l’AFM et une carte modulus mesurée d’une bactérie Streptococcus mutans. Une meilleure résolution a été obtenue à cette échelle avec l’AFM qu’avec la microscopie confoccale traditionnelle. La figure 6 contient une image confocale d’une colonie d’Enterococcus faecalis teintée d’une tache verte de structure cellulaire fluorescente, qui se fixe à la paroi cellulaire. La figure 5 et la figure 6 démontrent l’applicabilité de la technique Conpokal aux microbes en plus des cellules eucaryotes. Figure 1 : La configuration conpokal.(A) Schéma de la technique Conpokal. (B) Image de la configuration de l’instrument. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 2 : Microscopie de force atomique des cellules vivantes.(A) Image AFM de deux cellules HEK. (B) Profil de hauteur (ligne verte en A) d’une cellule HEK indiquant que la hauteur de la cellule est assez grande à 10 μm. (C) Mauvaise image AFM d’une cellule astrocyte où le piezo AFM est hors de portée à l’apex de la cellule et il ya des preuves de l’imagerie inverse de l’extrémité en porte-à-faux. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 3 : Microscopie confoccale et brillante des cellules vivantes.(A) Microscopie confocale à balayage laser des cellules HEK vivantes tachées d’une tache nucléaire (bleu fluoré), d’une tache de microtubule (fluorescing green) et d’une tache de membrane lipophile (fluorescing red). (B) Image optique de champ lumineux correspondante. Les barres d’échelle sont de 10 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 4 : Comparaison des rendus 3D de l’AFM et de la microscopie confoccale des cellules HEK vivantes.(A) Modulus carte construite à l’aide d’un ajustement modèle Hertz et un profil parabolique (rayon de 8 nm) pour la forme de pointe superposée sur la reconstruction 3D de la cellule de l’AFM. (B) La projection 3D correspondante de la pile de z confocal laser avec une tache nucléaire (fluorescing bleu), une tache de microtubule (fluorescing vert) et une tache de membrane lipophile (fluorescing rouge). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 5 : AFM de l’échantillon de bactéries.(A) AFM balayage et (B) mesuré modulus carte d’une bactérie Streptococcus mutans. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 6 : Microscopie confoccale de l’échantillon de bactéries.Image confocale d’une colonie d’Enterococcus faecalis avec la tache fluorescente verte de membrane. La barre d’échelle est de 5 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

Conpokal est une technique avancée et efficace pour recueillir des images de haute qualité et des propriétés mécaniques in situ de biomatériaux vivants dans un environnement liquide. La capacité de recueillir des images exceptionnelles de morphologie et de topographie combinées à des propriétés mécaniques d’échantillons vivants s’étend au-delà des techniques typiques de microscopie électronique et lumineuse. Par ailleurs, un microscope confocal fournit des capacités confoccales de balayage de champ lumineux, d’épifluorescence et de balayage laser pour obtenir des images fluorescentes détaillées et de haute qualité d’échantillons. Un AFM fournit une caractérisation mécanique, mais sans optique auxiliaire, il devient difficile de naviguer dans l’échantillon. Avec les deux systèmes combinés, un utilisateur peut recueillir à la fois des images et des propriétés mécaniques de la même cellule exactement au cours de l’expérience, ce qui est un grand avantage sur deux instruments distincts. Le but de ce manuscrit est d’informer et de guider les utilisateurs sur les vastes capacités du système combiné Conpokal pour l’avenir de la biologie, de l’ingénierie et de la santé. Le protocole comprend la préparation d’instruments, de médias culturels, de plats, la sélection de micro-organismes, la procédure AFM, la procédure confoccale et le nettoyage. Les étapes les plus critiques pour une session Conpokal réussie en direct, en solution, sont l’immobilisation d’échantillons, la sélection judicieuse des conseils et l’exécution des taches vivantes. La section de discussion de ce manuscrit donnera des précisions sur les recommandations en matière de culture, les conseils de dépannage et les lignes directrices opérationnelles, ainsi que les travaux futurs pour la technique Conpokal. Les recommandations en matière de culture couvriront les conseils sur la culture d’échantillons, l’immobilisation et la coloration. Les conseils et lignes directrices de l’AFM, de l’confocal et de Conpokal discuteront de la sélection et de l’étalonnage des pourboires, de la résolution, des limitations et du fonctionnement quasi simultané. Les travaux futurs comprennent les perspectives et le potentiel des voies de recherche prospectives.

Le protocole couvre la culture, l’enquête et l’imagerie des échantillons de cellules vivantes et de bactéries fixes. Un défi présent lors de la conduite de l’AFM dans le liquide provient de l’obstruction du mouvement en porte-à-faux en raison de l’entrave de l’échantillon et de la traînée hydrodynamique. Si l’échantillon n’est pas bien adhéré au substrat, il est possible d’encrassement du porte-à-faux par des sections de l’échantillon flottant dans le liquide. Dans ce cas, les mesures sont compromises puisqu’il s’agit d’une supposition de l’adhérence élastique et des propriétés micromécaniques de l’échantillon. Les cellules HEK n’ont pas été traitées avec fixatif, cependant, S. mutans et E. faecalis exigent l’immobilisation additionnative, semblable à d’autres cellules procaryotes. Les bactéries choisies ont montré le mouvement actif qui a entravé l’enquête cellulaire et l’imagerie, par conséquent, les échantillons ont été doucement, chimiquement fixés pour favoriser l’immobilisation. Il existe des alternatives à la fixation chimique, telles que les membranes filtrante qui piègent physiquement les cellules individuelles dans les pores⁷⁵.

La sélection des conseils est également un élément essentiel à la configuration et au fonctionnement de l’AFM. Lorsque des propriétés mécaniques basées sur la déformation du biomatériau sont recherchées, il faut tenir compte de la rigidité en porte-à-faux et de la compatibilité de rigidité matérielle, ce qui est une tâche non triviale. L’objectif principal est de mieux assortir la rigidité du matériau avec la rigidité du porte-à-faux sélectionné. Si le porte-à-faux est beaucoup plus doux que l’échantillon, il sera soumis à trop de déviation. Si le porte-à-faux est plus rigide que l’échantillon, alors le détecteur AFM peut être incapable de capturer de telles petites déviations. Il est recommandé que lors de la sélection d’un porte-à-faux AFM approprié, de choisir en fonction de l’application expérimentale. Pour recueillir des images détaillées en mode contact intermittent, les pointes AFM dans une plage de 0,1 à 0,3 N/m pour la rigidité et le rayon de pointe dans un rayon de 5 nm à 100 nm sont efficaces pour l’imagerie cellulaire en direct. De petits conseils coniques sont recommandés. Les bouts pointus fournissent une petite zone de contact et la capacité d’indent davantage aider à recueillir de petits détails et dispositifs dans la morphologie^{d’échantillon 76.} Toutefois, les pointes pointues peuvent également être problématiques car elles sont sujettes à ponctuer les échantillons lorsque les paramètres(p. ex.,point défini, temps de pixel, vitesse d’approche) nécessitent trop d’indentation ou que l’indentation est trop rapide. Pour éviter les effets de taux de tension élevés, le durcissement de la souche locale près d’une pointe pointue, ou tout simplement pour contrôler la zone de contact et la vitesse d’approche, beaucoup choisissent d’utiliser la spectroscopie de force avec une pointe colloïdale pour mesurer un module élastique.

Des pointes d’AFM dans une gamme de 0,01 – 1,0 N/m pour la rigidité et le rayon de pointe dans un rayon de 1 à 5 μm sont recommandées pour mesurer le moduli élastique des cellules vivantes. Les grandes tailles de pointe, typiquement colloïdes en verre, fournissent une zone de contact connue et sont peu susceptibles de percer la cellule pendant le contact. Les cantilevers rectangulaires sont préférés à la triangulaire parce que pendant l’étalonnage, la méthode sans contact peut être utilisée pour la géométrie rectangulaire par rapport à l’étalonnage basé sur le contact pour les géométries triangulaires. En outre, en raison de la nature délicate des bouts d’AFM, il est recommandé que l’opérateur mette en œuvre des pinces à épiler avec des bouts en caoutchouc pour réduire le potentiel d’endommager la puce AFM délicate ou le bloc de montage. D’autres paramètres à garder à l’esprit incluent la vitesse d’approche de la pointe AFM et la quantité d’indentation dans l’échantillon. Une bonne ligne directrice est de maintenir l’indentation à environ 10% de l’épaisseur (ou de la hauteur) de l’échantillon et de choisir une vitesse qui empêche la résistance hydrodynamique potentielle vécue par le porte-à-faux³⁸.

Les instruments expérimentaux complexes sont généralement avec des barrages routiers qui nécessitent un dépannage dans l’instrument mis en place, l’étalonnage et le fonctionnement. Planter la pointe AFM ou le porte-à-faux dans l’échantillon ou le substrat de l’échantillon est une erreur courante pour les nouveaux utilisateurs. Pour éviter ce problème, le protocole suggère de soutenir le porte-à-faux sur 2000 μm. Cette étape garantit que la pointe n’entrera pas en contact avec le fond du plat si l’utilisateur précédent a oublié de reculer la pointe lors du nettoyage après l’expérimentation. Toutefois, la distance de 2000 μm a été choisie pour le support de plat sélectionné utilisé dans ce protocole. Une plage différente, plus grande ou plus petite, peut devoir être sélectionnée en fonction du style de support de plat utilisé. Lors de l’alignement du laser et du détecteur, le protocole mentionne l’ajustement d’un bouton miroir pour maximiser le signal de somme. Un bouton de réglage de miroir peut ne pas être présent sur tous les AFMs. S’il est présent, cependant, une façon de manipuler l’instrument pour dépanner un signal à faible somme est d’ajuster le bouton miroir, utilisé pour tenir compte du milieu dans lequel la numérisation aura lieu; liquide(p. ex., eau,médias, PBS) ou de l’air. En raison de la différence dans l’indice de réfraction pour la lumière à travers l’air et par le liquide, le bouton miroir peut avoir besoin d’être ajusté. La sensibilité maximale de flexion du porte-à-faux AFM sera à l’emplacement de la pointe AFM, par conséquent, la lumière laser, qui retourne la position de flexion par son placement sur une photodiode, doit être situé à l’emplacement de la pointe AFM. Selon la pointe AFM choisie, la valeur du signal de somme peut varier de 0,3 à 3,0 V. Un revêtement arrière sur le porte-à-faux AFM tel que Cr-Au ou Al augmentera le signal de somme et la sensibilité de la mesure.

La géométrie de pointe est pertinente lors de l’étalonnage de la pointe pendant le fonctionnement de l’AFM. Un bon accord a été observé entre le non-contact et l’étalonnage des contacts. Si le porte-à-faux AFM choisi n’est pas rectangulaire, l’étalonnage de contact devra être effectué. Gardez à l’esprit que le milieu dans lequel la pointe est calibrée doit être le même que le milieu de l’échantillon. Si ces fluides diffèrent, l’utilisateur doit recalibrer. Lors de l’utilisation des pointes AFM dans le liquide, la fréquence mesurée par le système devrait être d’un quart à un tiers de celle de la fréquence de résonance naturelle indiquée par le fabricant. Une bonne façon de vérifier que le système a calibré la pointe correctement est de vérifier les valeurs dans le fichier de bruit thermique qui est généré. Assurez-vous que ce fichier enregistre dans le dossier approprié. Si le système a de la difficulté à calibrer ou si des valeurs non probables sortent, recalibrer ou ajuster légèrement la position laser, puis recalibrer.

Une autre cause de faible signal de somme peut être due à l’alignement en porte-à-faux AFM. Lorsque la puce AFM est montée dans le bloc de verre, il est essentiel que la pointe du porte-à-faux reste à l’intérieur de la petite fenêtre laser (surface de verre lisse). Si la puce est trop loin vers l’avant, l’angle auquel repose naturellement le porte-à-faux peut causer un problème avec la réflexion sur le porte-à-faux, manquant le photodétecteur et entraînant un mauvais signal de somme. Si la puce est trop loin en arrière, le laser sera incapable de réfléchir à l’arrière du porte-à-faux, causant un signal de somme médiocre. Pour ces raisons, la puce AFM montée peut devoir être ajustée. En outre, un autre problème qui peut être rencontré se produit avec la hauteur de l’échantillon. L’instrument AFM utilisé dans ce protocole a une portée maximale piezo z (hauteur) de 15 μm. Si un utilisateur constate que le logiciel n’est pas en mesure de collecter les données de hauteur et de forcer des cartes dans un pixel particulier, une boîte noire apparaît indiquant que le système est hors de portée (Figure 2C). Une façon de tirer sur ce problème est de définir la hauteur piezo à une valeur inférieure, comme 2 ou 3 μm de sorte que la plupart de la gamme de 15 μm s’engage à cartographier la hauteur prévue de la cellule. Cette technique devrait, dans la plupart des expériences liées aux cellules ou aux bactéries, résoudre le problème associé à la gamme z.

Les expérimentateurs qui ont besoin d’une plage de z étendue pour les échantillons de grande hauteur dont la hauteur est supérieure à 10 à 15 μm peuvent avoir besoin de poursuivre un module supplémentaire sur l’AFM. Les fabricants d’AFM ont cette option disponible à des coûts supplémentaires pour la plupart des systèmes. En élargissant la plage z, l’expérimentaliste a la possibilité de scanner des échantillons qui sont considérés comme grands à la micro-échelle avec peu de problèmes pour les valeurs hors de portée ou la modification du moteur piezo AFM. Bien que ces modules coûtent plus cher, certains, selon le fabricant, peuvent offrir une hauteur supplémentaire, jusqu’à 100 μm dans la direction z. Confocal est encore possible avec des échantillons plus grands si l’utilisateur a une longue distance de travail, objectif de grossissement élevé ou est prêt à utiliser un objectif d’air, peut-être un 20x ou 40x. En abaissant le grossissement objectif du microscope, la distance de travail augmente, gagnant de la distance pour voir le sommet d’un échantillon plus grand. Cette modification à un objectif de grossissement inférieur sacrifiera la résolution. Dans la configuration Conpokal mentionnée dans ce manuscrit, l’objectif 60x TIRF (fluorescence totale de réflexion interne) a une distance de travail de près de 100 μm au-delà de la couverture du plat échantillonné à fond de verre.

En ce qui concerne le microscope confocal mentionné dans ce manuscrit, quelques dispositions importantes sont discutées. Le système confocal utilisé pour la production des figures dans ce manuscrit a mis en œuvre un objectif d’huile TIRF 60x avec une ouverture numérique de 1,49. Des lignes laser à 405 nm, 488 nm et 561 nm excitation longueurs d’onde ont été utilisées pour l’imagerie des échantillons de cellules vivantes, montré dans la figure 3 et la figure 4. La limite de diffraction du microscope confocal peut être déterminée à l’aide de l’équation abbe résolution, Abbe Resolution(x,y) = ν/2NA, où c’est la longueur d’onde excitation pour Alexa 488, à 488 nm, et NA est l’ouverture numérique pour le condenseur confocal, qui est de 0,3. Par conséquent, une résolution axiaale de 272 nm est déterminée. Pour l’imagerie par épifluorescence, deux cas sont considérés pour déterminer la résolution où le sténopé est réglé sur une unité aérosée (UA) et 0,5 UA. Dans ce dernier cas, le sténopé est fermé de telle sorte qu’une perte de lumière importante se produit, mais la résolution augmente. Le logiciel confocal calcule les résolutions indigènes latérales et axiale à 170 nm et 290 nm pour le sténopé à 0,5 UA, et 200 nm et 370 nm pour le sténopé à 1 UA, respectivement. Les aberrations sphériques introduites dans le système peuvent être expliquées par un processus de déconvolution visant à augmenter le contraste et la résolution dans les images au microscope. En raison des limitations de diffraction inhérentes aux microscopes confocaux, l’image confoccale de la colonie bactérienne de la figure 6 n’a pas la résolution correspondante pour le détail observé dans le balayage de bactéries de l’AFM à la figure 5. AFM donne accès à des caractéristiques et des détails à l’échelle nanométrique qui est difficile à capturer avec un microscope confocal. Toutefois, selon la résolution de fluorescence requise, la figure 5 et la figure 6 démontrent l’applicabilité de la technique Conpokal aux microbes en plus des cellules eucaryotes.

Un avantage de l’utilisation d’un microscope confocal permet à l’opérateur de recueillir des images 3D de régions spécifiques dans un échantillon avec des détails aiguisés. Ces images sont corrélées avec l’AFM en regardant la surface qui a été sondée via l’image AFM et un balayage confoccal de la même région. Comme le microscope est inversé, une image d’épifluorescence recueille des informations lumineuses de l’autre côté de l’échantillon qui a été sondé. Le sténopé dans le système confocal permet de limiter à un seul plan à partir d’une certaine distance tout en filtrant la lumière qui vient du reste de l’échantillon ou même de la pièce. Essentiellement, le sténopé aide à isoler la lumière qui revient du plan unique d’intérêt dans l’échantillon. En règle générale, ce plan d’intérêt doit contenir de solides marqueurs fluorophores parce que, pour les systèmes confocaux inversés, la détection d’une seule molécule serait limitée aux microscopes confocaux à résolution plus élevée. L’illumination de l’épifluorescence est moins souhaitable en raison du fait qu’en mode imagerie d’épifluorescence, toute lumière de l’échantillon qui est réfléchie dans l’objectif est recueillie et utilisée pour générer l’image, donc impossible d’isoler un seul plan. Les techniques confoccales fournissent une image plane unique plus isolée de la fonction d’échantillon en question en raison du sténopé^77. Si, par exemple, l’apex d’une cellule eucaryotique est sondé par afm, cette même surface peut être isolée avec les capacités confoccales de balayage laser du microscope, plutôt qu’avec le mode d’imagerie d’épifluorescence. Il est recommandé de surveiller la santé et la forme des cellules lors de l’acquisition de données par imagerie simultanément en mode de contraste d’interférence différentielle à l’aide du détecteur de lumière transmis et de la ligne laser de 488 nm. Lors de la capture d’une pile z de l’échantillon, pour la procédure détaillée ci-dessus, seul le gain du détecteur est ajusté. Tout changement morphologique dans les cellules pendant la mesure, qui n’est pas nécessairement visible dans les canaux fluorescents, indique que des artefacts sont introduits dans la mesure.

L’espacement idéal entre les plans peut être obtenu en suivant la recommandation logicielle pour la longueur d’onde la plus courte utilisée dans la technique d’imagerie. La résolution native et le rapport signal/bruit dans les volumes d’images peuvent être efficacement améliorés en utilisant des algorithmes de déconvolution disponibles dans le module de traitement d’image du logiciel d’acquisition. Toutefois, en effectuant une microscopie fluorescente, la sélection de taches et de colorants spécifiques est essentielle pour éviter le blanchiment précoce sur le plateau ou la tige croisée des spectres d’excitation et d’émission qui se chevauchent. À l’occasion, un utilisateur peut éprouver un dysfonctionnement dans la génération de lumière confoccale. Si un utilisateur éprouve un manque d’émission de lumière ou des lignes laser défectuantes, une façon de dépanner est de réinitialiser le système, généralement en redémarrer le logiciel d’exploitation. Si le problème persiste, le détecteur de lumière transmis peut ne pas s’être mis à sa place ou à l’extérieur dans la trajectoire optique du microscope à lumière. La réinitialisation de la position du détecteur d’émetteur peut aider à atténuer les problèmes de collecte de lumière ou d’imagerie laser.

L’objectif de l’instrument Conpokal est de fournir aux utilisateurs la possibilité de recueillir des informations optiques et basées sur la force sur les biomatériaux vivants dans un environnement liquide, simultanément et sur la même cellule ou fonctionnalité. Ce travail décrit explicitement comment effectuer ces expériences dans le liquide, une maison naturelle pour de nombreux biomatériaux, bien que, des expériences sèches peuvent encore être effectuées en utilisant l’instrumentation. Avec des échantillons préparés dans des boîtes de Pétri, la hauteur du plat est une limitation. En raison de la configuration du bloc de verre qui tient le porte-à-faux AFM, les parois latérales des plats doivent avoir moins de 10 mm de hauteur; si le plat est trop grand, l’instrument ne sera pas en mesure d’abaisser la pointe de l’AFM à la surface de l’échantillon ou du substrat.

Bien qu’il y ait une limite pour la taille de l’échantillon, il n’y a aucune limitation avec les capacités de l’instrument ou du logiciel en ce qui concerne un délai. Confocal simultané et AFM est possible avec les bons facteurs en place. La limitation qui contribue à sa capacité quasi simultanée se réfère au bruit qui est généré lors de l’exécution simultanée de certaines fonctions de microscopie confoccale et de microscopie de la force atomique. Les vibrations des moteurs qui déplacent l’objectif du microscope lors de la collecte d’une pile z seront ajoutées au signal de la pointe de la sonde AFM pendant son mouvement. Le bruit sera augmenté par un objectif d’huile, comme les moteurs se déplacent de haut en bas dans la direction z pour éclairer les plans séquentiels dans l’échantillon. Par conséquent, le protocole recommandé inclut la collecte séquentielle de scans AFM et d’images de pile de z confocal. Le CLSM simultané et l’AFM nécessiteraient une imagerie stationnaire avec le confoccal, cependant, avec la technique actuelle, le délai pour les deux instruments pourrait être aussi court que des dizaines de secondes. Le temps réel de passer de l’exploitation de l’AFM à l’imagerie confocale était d’environ 2 à 4 minutes pour les images recueillies à la figure 2A et à la figure 4B. Cette valeur a été déterminée en soustrayant les deux périodes de collecte d’images à partir du temps total de 33 minutes, ce qui inclut le temps de commencer et de terminer l’analyse AFM, de changer les modes d’instrument pour activer l’imagerie confocale, et de commencer et de compléter la pile d’image confocale z.

L’avenir de Conpokal vise à explorer de nouvelles relations structure-fonction en plus d’une connaissance approfondie des processus unicellaux. Par exemple, l’expérimentation de traitements médicamenteux in situ sur des échantillons cellulaires ou bactériens pour déterminer les effets de l’élasticité cellulaire serait une avancée dans les domaines des biomatériaux, de la biologie et de la biomécanique. La thérapie de traitement dans le plat d’échantillon tandis que l’imagerie et l’enquête fourniraient la connaissance de la façon dont l’échantillon répond à la thérapeutique dans un environnement vivant et soigneusement commandé, au fil du temps. L’intégration d’un nouveau médicament ou d’un nouveau défi environnemental permettrait d’élargir la compréhension de la façon dont l’emplacement du cytosquelette ou de l’organite influe sur la locomotion, la topologie, la raideur, etc. Une autre avancée potentielle de Conpokal est la capacité d’avoir un contrôle environnemental complet du système. Le Conpokal actuel mentionné dans ce protocole est logé à l’intérieur d’une enceinte acoustique conçue pour réduire le bruit de l’intérieur du laboratoire. L’avancement de ce logement permettrait peut-être de tester à l’intérieur d’un ou d’une combinaison de facteurs, qui ne se limiteraient pas à ceux comme un environnement stérile, contrôlé par la température ou même à gravité variable. Dans l’état actuel des choses, la méthode Conpokal offre une approche efficace et utile pour caractériser les biomatériaux vivants et liquides, mais l’avenir de la technique ne fera que faire progresser ces capacités.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous reconnaissons le financement des NIH COBRE sous le numéro P20GM130456. Nous remercions le noyau de microscopie légère du Royaume-Uni, qui est soutenu par le vice-président pour la recherche, pour son aide dans ce travail. Des souches de S. mutans et E. faecalis ont été fournies par la Dre Natalia Korotkova. La première mention du jeu de mots, Conpokal, pour décrire la combinaison de microscopie confocale et de microscopie de force atomique est attribuée au Dr Brad Berron, génie chimique et des matériaux, à l’Université du Kentucky, en discussion avec Martha Grady (auteur correspondant) en prévision de l’arrivée d’un conférencier de séminaire, le Dr Jonathan Pham, qui s’est joint à la faculté de génie chimique et des matériaux de l’Université du Kentucky à l’automne 2017.

Materials

Acoustic Enclosure	JPK-Bruker	Acoustic Enclosure	Chamber used to mitigate noise
BioTracker 488 Green Microtubule Cytoskeleton Dye	Millipore Sigma	SCT142	Used to label microtubules in mammalian cells
CP-qp-CONT-BSG AFM tips	NanoAndMore	CP-qp-CONT-BSG-B	Collodial AFM tips good for modulus measurements on biological samples
Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3)))	ThermoFischer Scientific	D282	Used to label plasma membrane of mammalian cells
Dulbecco's Modified Eagle Medium	VWR	VWRL0100-0500	Component of cell culture media
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	ThermoFisher Scientific	A1285601	Used to simulate biological environment
Fetal Bovine Serum	Fischer Scientific	45000-736	Component of cell culture media
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast Extract	Fischer Scientific	BP1422-500	Component of bacterial culture medium
FluoroDish Cell Culture Dish	World Precision Instruments (WPI)	FD35-100	Glass-bottomed dishes whose side walls are less than 10 mm, necessary for full function of Nanowizard 4a AFM
Hoechst 33342 nucleic acid stain	ThermoFischer Scientific	62249	Used to label nucleus of mammalian cells, a good nuclear marker for live cells
Human embryonic kidney 293 cells	ATCC Global Bioresource Center	CRL-1573	Mammalian cells used in protocol
Matrigel	VWR	47743-716	Coating in cell culture dish
Model: PFQNM-LC-A-CAL AFM tips	Bruker	PFQNM-LC-A-CAL	AFM tips that work well for samples that have large heights (such as eukaryotic cells)
NanoWizard 4a	JPK-Bruker	NanoWizard 4a	AFM
Nikon A1 Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon	A1 HD25	Microscope used for brightfield, epi-fluorescence, and confocal imaging
PENICILLIN/STREPTOMYCIN	VWR	16777-164	Component of cell culture media
PetriDishHeater	JPK-Bruker	PetriDishHeater	Maintains desired Petri dish sample temperature
qp-BioAC-Cl AFM tips	Nanosensors	qp-BioAC-Cl-10	Three different AFM cantilevers of varying stiffness
Replaceable Carbon Fiber Tip Tweezers	Ted Pella Inc.	5051	Used to carefully place and remove delicate AFM tips into the glass mounting block
Todd Hewitt Broth Bacto	BD DIFCO Bacterius Ltd	Bacto-249240	Component of bacterial culture medium
Vancomycin, BODIPY FL Conjugate	Thermo Fisher Scientific	V34850	Used to fluorescently label bacterial cell wall

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Sandin, J. N., Aryal, S. P., Wilkop, T., Richards, C. I., Grady, M. E. Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) on Live Cells. J. Vis. Exp. (162), e61433, doi:10.3791/61433 (2020).

À proximité de Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) on Live Cells

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