Анализ РНК-блотов для обнаружения и количественной оценки микроРНК растений
Summary
Этот метод демонстрирует использование метода северной гибридизации для обнаружения miRNAs от общего экстракта РНК.
Abstract
МикроРНК (miRNAs) являются классом эндогенно выраженных некодирующих, 21 nt малых РНК, участвующих в регуляции экспрессии генов как у растений, так и у животных. Большинство миРНК действуют как отрицательные переключатели экспрессии генов, нацеленные на ключевые гены. В растениях первичные миРНК (pri-miRNAs) транскрипты генерируются РНК-полимеразой II, и они образуют различную длину стабильных структур стволовых циклов, называемых премиРНА. Эндонуклеазы, Dicer-like1, обрабатывает премиРНК в дуплексы миРН-миРНАЗ. Одна из нитей из дуплекса miRNA-miRNA выбирается и загружается на белок Argonaute 1 или его омологи, чтобы остеклеть расщепление мРНК. Хотя миРНК являются ключевыми сигнальными молекулами, их обнаружение часто осуществляется менее оптимальными методами на основе ПЦР вместо чувствительного северного анализа помарки. Мы описываем простой, надежный и чрезвычайно чувствительный северный метод, который идеально подходит для количественной оценки уровней миРНК с очень высокой чувствительностью, буквально из любой ткани растений. Кроме того, этот метод может быть использован для подтверждения размера, стабильности и обилия miRNAs и их предшественников.
Introduction
Недавнее открытие небольших регуляторных РНК, микроРНК, привело исследования в понимании их и их роль в растениях и животных1. Длинные прекурсоры miRNAs обрабатываются в 21 до 24 nt зрелых miRNAs HYL1 и конкретных dicer-как белки2,3. 22 nt miRNA может инициировать каскадное заглушение, генерируя вторичные siRNAs4. Исследования показали роль miRNAs и вторичных siRNAs в развитии, судьба клеток и стресс ответы5,6.
Северная гибридизация является экспериментальным методом, обычно используемым для обнаружения конкретных молекул РНК. Этот метод настраивает его использование в обнаружении примерно 19 -24 nt длинных малых РНК из пула общего RNAs7. В этой демонстрации мы иллюстрируем использование этого метода для обнаружения и количественной оценки миРНК. Этот метод использует маркировку зондов с использованием радиоизотопов; таким образом, уровни миРНК в образце могут быть обнаружены с повышенной чувствительностью. В отличие от методов на основе ПЦР, этот метод обеспечивает количественную оценку экспрессии, а также определение размера miRNAs. В этом протоколе мы показываем важные шаги, которые улучшают обнаружение miRNA. Мы модифицировали шаги в blotting и гибридизации для получения высокого разрешения обнаружения сигнала miRNAs. Этот метод также может быть использован для обнаружения других эндогенных малых РНК, таких как siRNAs, tasi-вторичных РНК и snoRNAs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот метод может широко использоваться для обнаружения и количественной оценки малых РНК, включая менее обильные миРНК. Протокол в основном описывает шаги для денатурации общей РНК в погрузочном буфере, разделение размера гелевым электрофорезом, перенос РНК к мембране, перекрестная с…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают доступ к радиационной лаборатории, предоставленной принимающим институтом и BRIT для радиоизотопа. Лаборатория ПВС поддерживается Национальным центром биологических наук, Институтом фундаментальных исследований и грантов Тата (BT/PR12394/AGIII/103/891/2014; BT/IN/Swiss/47/JGK/2018-19; BT/PR25767/GET/119/151/2017) от Департамента биотехнологии, правительство Индии. Депутат признает DBT-исследования ассоциированных, DBT, правительство Индии.
Materials
| 40% Acrylamide-bisacrylamide solution | Sigma | A9926 | |
| Ammonium persulphate (APS) | BioRad | 1610700 | |
| Blotting paper | whatmann blotting paper I | 1001-125 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B5525-5G | |
| Capillary loading tips | BioRad | 2239915 | |
| Deionized formamide | Ambion | AM9342 | |
| Heating block | Eppendorff | 5350 | |
| Hybond N+nylon membrane | GE | RPN203B | |
| Hybridization bottle | Sigma | Z374792-1EA | |
| Hybridization Oven | Thermo Scientific | 1211V79 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T7024-25ml | |
| PhosphorImager | GE- Typhoon scanner | 29187194 | |
| PhosphorImager screen and cassette | GE healthcare | GE28-9564-75 | |
| Pipettes | Gilson, models: P20 and P10 | FA10002M, FA10003M | |
| Plastic pipette | Falcon | 357550 | |
| Polyacrylamide gel apparatus | BioRad | 1658003EDU | |
| Sephadex G-25 column | GE healthcare | 27532501 | |
| Speed Vac Concentrator | Thermo Scientific | 20-548-130 | |
| Spinwin | Tarsons | 1010 | |
| T4 Polynucleotide Kinase (PNK) | NEB | M0201S | |
| Transblot apparatus | BioRad | 1703946 | |
| ULTRAHyb hybridization buffer | Ambion | AM8670 | |
| Urea | Fischer Scientific | 15985 | |
| UV-crosslinker | UVP | CL-1000L | |
| Vortex | Tarsons | 3020 | |
| Water bath | NEOLAB | D-8810 | |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126-10G |
References
- Baulcombe, D. RNA silencing in plants. Nature. 431, 356-363 (2004).
- Anushree, N., Shivaprasad, P. V. Regulation of Plant miRNA Biogenesis. Proceedings of the Indian National Science Academy. 95, (2017).
- Narjala, A., Nair, A., Tirumalai, V., Hari Sundar, G. V., Shivaprasad, P. V. A conserved sequence signature is essential for robust plant miRNA biogenesis. Nucleic Acids Research. , (2020).
- Chen, H. M., et al. 22-Nucleotide RNAs trigger secondary siRNA biogenesis in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 15269-15274 (2010).
- Shivaprasad, P. V., et al. A microRNA superfamily regulates nucleotide binding site-leucine-rich repeats and other mRNAs. Plant Cell. 24, 859-874 (2012).
- Shivaprasad, P. V., Dunn, R. M., Santos, B. A., Bassett, A., Baulcombe, D. C. Extraordinary transgressive phenotypes of hybrid tomato are influenced by epigenetics and small silencing RNAs. The EMBO Journal. 31, 257-266 (2012).
- Akbergenov, R., et al. Molecular characterization of geminivirus-derived small RNAs in different plant species. Nucleic Acids Research. 34, 462-471 (2006).
- Tirumalai, V., Swetha, C., Nair, A., Pandit, A., Shivaprasad, P. V. miR828 and miR858 regulate VvMYB114 to promote anthocyanin and flavonol accumulation in grapes. Journal of Experimental Botany. , (2019).
- Li, C., Zamore, P. D. Analysis of Small RNAs by Northern Hybridization. Cold Spring Harbor Protocols. (8), (2018).
- Swetha, C., et al. Major domestication-related phenotypes in indica rice are due to loss of miRNA-mediated laccase silencing. The Plant Cell. , (2018).
