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유전학

Edición del genoma mediado por CRISPR-Cas9 en el Ascomicete Filamentoso Huntiella omanensis

Published: June 09, 2020
doi:
10.3791/61367
,
1Department of Biochemistry, Genetics & Microbiology,University of Pretoria, 2Forestry & Agricultural Biotechnology Institute (FABI),University of Pretoria

Summary

El sistema de edición del genoma CRISPR-Cas9 es un editor de genoma fácil de usar que se ha utilizado en especies modelo y no modelo. Aquí presentamos una versión basada en proteínas de este sistema que se utilizó para introducir un codón de parada prematura en un gen de apareamiento de un hongo ascomiceto filamentoso no modelo.

Abstract

El sistema de edición del genoma CRISPR-Cas9 es una herramienta molecular que se puede utilizar para introducir cambios precisos en los genomas de especies modelo y no modelo por igual. Esta tecnología se puede utilizar para una variedad de enfoques de edición del genoma, desde nocauts genéticos y knockins hasta cambios más específicos como la introducción de algunos nucleótidos en un lugar específico. La edición del genoma se puede utilizar para multitud de aplicaciones, incluyendo la caracterización funcional parcial de genes, la producción de organismos transgénicos y el desarrollo de herramientas de diagnóstico. En comparación con las estrategias de edición genética disponibles anteriormente, el sistema CRISPR-Cas9 ha demostrado ser fácil de establecer en nuevas especies y cuenta con una alta eficiencia y especificidad. La razón principal de esto es que la herramienta de edición utiliza una molécula de ARN para apuntar al gen o la secuencia de interés, haciendo que el diseño de moléculas diana sea sencillo, dado que las reglas de emparejamiento base estándar pueden ser explotadas. Al igual que otros sistemas de edición del genoma, los métodos basados en CRISPR-Cas9 también requieren protocolos de transformación eficientes y eficaces, así como acceso a datos de secuencias de buena calidad para el diseño del ARN objetivo y las moléculas de ADN. Desde la introducción de este sistema en 2013, se ha utilizado para diseñar genéticamente una variedad de especies modelo, incluyendo Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster y Mus musculus. Posteriormente, los investigadores que trabajan en especies no modelo han aprovechado el sistema y lo han utilizado para el estudio de genes implicados en procesos tan diversos como el metabolismo secundario en hongos, crecimiento de nematodos y resistencia a enfermedades en plantas, entre muchos otros. Este protocolo detallado a continuación describe el uso del protocolo de edición del genoma CRISPR-Cas9 para el truncamiento de un gen implicado en el ciclo sexual de Huntiella omanensis,un hongo ascomiceto filamentoso perteneciente a la familia Ceratocystidaceae.

Introduction

La creciente disponibilidad de genomas y transcriptomas de alta calidad, completamente ensamblados, ha mejorado considerablemente la capacidad de estudiar una amplia variedad de procesos biológicos en una serie de organismos1. Esto es cierto tanto para las especies modelo como para las no modelos, muchas de las cuales pueden ofrecer una comprensión más diversa de los procesos biológicos. Estos tipos de datos se pueden utilizar para el descubrimiento de genes, la identificación de redes de transcripción y comparaciones de genoma completo y transcriptoma, cada uno de los cuales viene con su propio conjunto de aplicaciones. Sin embargo, mientras que los genes están siendo predichos, anotados y putativamente vinculados a diferentes vías funcionales a un ritmo nunca antes visto, la caracterización funcional de estos genes permanece detrás, limitada por los kits de herramientas moleculares disponibles para muchas especies. Este es particularmente el caso de las especies no modelo, donde los datos genómicos son relativamente fáciles de generar, pero donde la caracterización molecular posterior ha sido casi imposible1,2.

La caracterización parcial de las funciones de genes específicos importantes para la biología de las especies fúngicas se puede lograr mediante experimentos de knockout o knockin seguidos de análisis fenotípicos de las cepas mutantes3. Estos dos sistemas se basan enteramente en la disponibilidad de protocolos de ingeniería genética, incluyendo, como mínimo, un sistema de transformación y un sistema de edición genética. Hay una serie de diferentes sistemas de transformación que se han desarrollado en una variedad de hongos filamentosos4. Sistemas físicos como los que se basan en la biolística y la electroporación se han desarrollado en Trichoderma harzianum5 y Aspergillus niger6, respectivamente. Los sistemas que utilizan sustancias químicas como el cloruro de calcio o el acetato de litio se han desarrollado en Neurospora crassa7. Por último, los sistemas biológicos que dependen del uso de Agrobacterium tumefaciens para la transformación se han utilizado con éxito en Ceratocystis albifundus8.

En contraste con la disponibilidad de diferentes protocolos de transformación, los sistemas de edición del genoma son menos abundantes. Muchos de los experimentos tradicionales de caracterización funcional realizados en hongos filamentosos utilizaron una construcción de nocaut de marcador dividido en forma de marcador seleccionable flanqueado por regiones de homología a la región o gen objetivo en el genoma3. El método se basa en la reparación del ADN dirigida por la homología (HR), que alberga la recombinación homóloga entre la construcción de knockout y la región de interés. Este evento de recombinación resulta en la sustitución del gen de interés por la secuencia del marcador seleccionable. Desafortunadamente, si bien esto tuvo éxito en muchas especies incluyendo Cercospora nicotianae10, Aspergillus fumigatus11 y Grosmannia clavigera12, las tasas de recombinación homóloga son muy variables en diferentes especies de hongos, lo que hace de este un protocolo ineficiente y a veces inutilizable en ciertas especies3.

Otros sistemas de edición del genoma, incluidos los que hacen uso de nucleasas de zinc-dedo (ZFN) y nucleasas efectores de tipo activador de transcripción (TALENs) representaron una gran mejora en los sistemas más antiguos, particularmente dadas sus capacidades para realizar cambios específicos y específicos13. Tanto las ZFN como las TALENs se componen de una proteína de nucleasa y una proteína que es capaz de reconocer secuencias específicas de nucleótidos13. Tras el reconocimiento, la nucleasa induce una rotura de ADN de doble cadena que puede facilitar la introducción de mutaciones específicas. Para lograr cambios en el genoma, la región de proteínas que reconoce la secuencia de nucleótidos debe diseñarse específicamente para cada experimento. Debido a esta dependencia de las interacciones proteína-ácido nucleico para guiar la edición, diseño y producción de las moléculas de orientación para cada experimento knockout o knockin es difícil y trabajo intensivo14,,15. Ilustrando estos desafíos, muy pocos hongos filamentosos han sido sometidos a la edición del genoma utilizando estos sistemas. Un ejemplo es el sistema basado en TALENs que se desarrolló en el hongo de la explosión de arroz, Magnaporthe oryzae16.

Podría decirse que la mayor revolución en el campo de la edición del genoma fue el descubrimiento y posterior desarrollo del sistema CRISPR-Cas9- un editor del genoma que permite la escisión dirigida de una secuencia de interés por una endonucleasa que es guiada por una molécula de ARN. Esto fue una gran mejora en los editores del genoma previamente desarrollados que se basaron en las interacciones entre proteínas y ácidos nucleicos, ya que la principal ventaja del sistema CRISPR-Cas9 es que se basa en una molécula de ARN para dirigirse a la región de interés. Esto significa que el sistema se basa en una interacción ARN-ADN y, por lo tanto, las reglas de emparejamiento base estándar se pueden explotar al diseñar cada experimento15.

El sistema CRISPR-Cas9, tal como se detalla aquí, se compone de tres componentes principales: un ARN guía único (sgRNA), la enzima Cas9 y un ADN de donante (dDNA)17. El sgRNA se compone de una región de 20 nucleótidos llamada protoespacialismo, así como una región más larga llamada andamio18. La región del protoespacial se utiliza para guiar el sistema de edición a la región de destino y, por lo tanto, se rediseña para cada experimento. El andamio es la región de ARN que se une físicamente a la enzima Cas9 para formar la ribonucleoproteína (RNP) y por lo tanto es idéntica independientemente de la región a la que se va a dirigir. La enzima Cas9 facilita físicamente el escote del ADN objetivo, utilizando el protoespacialista como guía para identificar esta región19. El último componente, el dDNA, es opcional y su uso depende del experimento20en particular. El dDNA alberga la secuencia que debe insertarse específicamente en la región que está cortando la enzima Cas9, y por lo tanto es ideal para experimentos de knockina genética en los que se está introduciendo un gen en el genoma o para experimentos de eliminación de genes en los que se introduce un gen de resistencia a los antibióticos u otro marcador seleccionable para reemplazar el gen de interés. El dDNA también se puede diseñar de tal manera que introduzca secuencias novedosas en el genoma. Por ejemplo, como se detalla a continuación, es posible introducir un codón de parada en el marco en una región determinada en el gen de interés cuando se requiere un truncamiento del gen21. Otras aplicaciones incluyen la mutación de regiones específicas del gen, como un dominio funcional22,o la introducción de una secuencia de etiquetado23.

Una de las principales ventajas de utilizar el sistema CRISPR-Cas9 es su versatilidad24. Un ejemplo de esta adaptabilidad es que la enzima Cas9 se puede introducir en la célula huésped en una de sus tres formas- ADN, ARN o proteína- dependiendo del sistema de transformación particular que se utilice. Cuando se introduce en forma de ADN, el gen cas9 se incluye a menudo en un plásmido junto con un marcador seleccionable, un casete para expresar el sgRNA y, si es necesario, un casete que codifica la secuenciadDNA 25. La principal ventaja de este sistema es que sólo una sola construcción necesita ser transformada en la célula y la transformación exitosa asegura que todos los componentes necesarios para la edición del genoma mediado por CRISRP-Cas9 están presentes. Sin embargo, este método se basa en la disponibilidad de un sistema de expresión para la especie anfitriona. Para que Cas9 induzca con éxito el daño del ADN, debe expresarse a niveles altos y, por lo tanto, se requiere un promotor adecuado y potencialmente específico. Para las especies no modelo en las que estos promotores aún no se han desarrollado, esto puede ser un factor detracción y, por lo tanto, la capacidad de introducir Cas9 en forma de ARN o proteína puede ser una opción más atractiva. La introducción del ARN en la célula trae sus propios desafíos, particularmente en que el ARN es inestable y puede no sobrevivir al proceso de transformación. Además, cuando se introduce en forma de ADN o ARN, la secuencia génica Cas9 puede necesitar estar optimizada para codón para su uso en el sistema host particular17. Por ejemplo, el gen cas9 de Streptococcus pyogenes puede no funcionar en una célula huésped de mamíferos y un gen cas9 optimizado para su uso en una célula de mamífero puede no funcionar en una célula vegetal. Todos estos desafíos se pueden superar utilizando la forma proteica de Cas9, que, junto con el sgRNA, se puede ensamblar en un RNP y transformarse en la célula huésped26,,27. Este sistema no se basa en ningún sistema de expresión endógeno ni en la optimización de codones y, por lo tanto, debería funcionar en la mayoría de las especies no modelo. La desventaja del sistema basado en proteínas es que no es compatible con sistemas de transformación basados en ADN como la transferencia mediada por Agrobacterium. Por lo tanto, para que el método basado en proteínas funcione, es necesario disponer de un protocolo de transformación como los que se basan en protoplastos o biolística. Este sistema basado en RNP se ha utilizado con éxito en los hongos filamentosos, Fusarium oxysporum26 y Mucor circinelloides27.

Huntiella omanensis, un miembro de la familia Ceratocystidaceae, es un hongo cosmopolita que a menudo se encuentra en plantas leñosas recién heridas28. Si bien hay datos de genoma y transcriptoma de alta calidad disponibles para esta especie28,,29,,30,no se han desarrollado protocolos de edición de transformación o genoma. Hasta la fecha, la investigación sobre H. omanensis se ha centrado en los componentes genéticos subyacentes de su ciclo sexual29,,31. Este hongo presenta un ciclo sexual heterotálico típico, con reproducción sexual que ocurre exclusivamente entre los aislados de los tipos de apareamiento MAT1-1 y MAT1-231. Por el contrario, los aislados MAT1-2 de la Huntiella moniliformis estrechamente relacionada son capaces de reproducirse sexualmente independientemente y completar un ciclo sexual en ausencia de una pareja MAT1-131. Esta diferencia en las capacidades sexuales se cree que es, al menos en parte, debido a una diferencia importante en el gen de apareamiento, MAT1-2-7, donde H. omanensis alberga una longitud completa y una copia intacta, mientras que el gen se trunca gravemente en H. moniliformis29,31. Para caracterizar aún más el papel de este gen en la reproducción sexual, el gen MAT1-2-7 de H. omanensis se truncó para imitar el truncamiento observado en H. moniliformis21.

El protocolo siguiente detalla la transformación de H. omanensis y el truncamiento del gen MAT1-2-7 utilizando una versión basada en proteínas del sistema de edición del genoma CRISPR-Cas9. Este protocolo se desarrolló después de que los enfoques de reemplazo genético basado en recombinación homóloga y la edición del genoma CRISPR-Cas9 basada en plásmidos no tuvieron éxito.

Protocol

1. Diseño y síntesis del sgRNA Para identificar posibles regiones protoespaciales que formarán parte del SGRNA, busque manualmente a través del gen de interés de los trillizos de 5′ NGG 3′, utilizando la función de búsqueda en el programa que se esté utilizando. Anote estos trillizos como secuencias PAM.NOTA: Hay varios programas de software disponibles que buscan y anotan las posibles secuencias de PAM y protoespacial. Seleccione la conexión en sentido ascendente de 20 bp de cada una de las secuencias PAM identificadas y anote estas secuencias como protoespaspacers potenciales. Para decidir un único protoespacial, realice los siguientes pasos de filtrado para descartar secuencias de baja calidad. Para comprobar la especificidad de los posibles protoespaciores, combine la secuencia PAM y el protoespeso en una sola secuencia y utilícelo como una consulta BLASTn con todo el genoma. Deseche cualquier protoespacial que muestre similitud con cualquier región del genoma que no sea la región de destino (Figura 1A). Para asegurarse de que la molécula de ARN se pliega en la estructura 3D correcta para unirse a la enzima Cas9, cree una secuencia combinada que incluya el protoespacializador y la secuencia de andamios específica de la enzima Cas9. Cargue cada una de las secuencias combinadas de protoespacial-scaffold en una herramienta de predicción de estructura secundaria de ARN (Tabla de materiales). Analice los resultados comparando la energía libre mínima y las estructuras secundarias centroides.NOTA: Los candidatos protoespaciales ideales tendrán estructuras secundarias y energía libre mínimas idénticas. Ambas estructuras secundarias deben estar compuestas por tres bucles de vástago, interrumpidos por cinco estructuras de anillo. Las estructuras también deben presentar altas probabilidades de unión (indicadas en rojo) en toda la estructura, excepto en la región que representa el protoespacial(Figura 1B). Los valores energéticos reales no son relevantes. Elija un candidato final entre los que pasaron los pasos de filtrado anteriores seleccionando el candidato más cercano a la región específica a la que se va a dirigir. Para sintetizar el sgRNA como una sola molécula de ARN, utilice un kit de síntesis de sgRNA(Tabla de materiales)compatible con la enzima Cas9 en particular que se utilizará (por ejemplo, Cas9 de Streptococcus pyogenes).NOTA: Los siguientes pasos pueden depender del kit de síntesis de sgRNA utilizado. En caso de que se utilice un kit diferente, siga las instrucciones del fabricante. Alternativamente, el sgRNA se puede pedir pre-sintetizado. Cuando trabaje con ARN, utilice reactivos y desechables libres de nucleasas. Si el protoespacialador de 20 bp elegido en el paso 1.3 anterior no alberga una G en el extremo 5′, agregue una G a esta región. Agregue la secuencia del promotor T7 al final de 5′ de la secuencia de destino. Esta secuencia es estándar y es de 5′ TTCTAATACGACTCACTATAG 3′. Agregue una secuencia de superposición de 14 nt al extremo de 3′ de la secuencia de destino. Esta secuencia es específica del kit y es de 5′ GTTTTAGAGCTAGA 3′ para el kit utilizado aquí. Ordene el fragmento resultante 5′ TTCTAATACACTCACTATAG(N)20 GTTTTAGAGCTAGA, con (N)20 que representa el protoespacial seleccionado presintesizado (Tabla de materiales). De acuerdo con el protocolo del fabricante(Tabla de materiales),combine los siguientes reactivos a temperatura ambiente: 2 l de agua, 10 ml de tampón de reacción, 5 l de secuencia de protoespacialización sintetizada, 1 l de 0,1 M TDT y 2 l de enzima transcriptasa. Incubar esta solución a 37oC durante 30 min y transferirla al hielo. Añadir 30 l de agua y 2 l de DNase I, mezclar e incubar a 37oC durante otros 15 min. Visualice el sgRNA resultante en un gel de agarosa del 2%. 2. Probar la habilidad de escisión in vitro del sgRNA NOTA: Este paso es opcional, pero se recomienda. Diseñar imprimaciones que amplificarán un fragmento que albergará la secuencia del sitio al que el sgRNA elegido se dirigirá y amplificará la región utilizando una polimerasa de ADN estándar.NOTA: Si es posible, diseñe las imprimaciones de tal manera que el escote en el sitio de destino produzca dos fragmentos de tamaños muy diferentes que se pueden distinguir fácilmente entre sí en un gel de agarosa estándar. Montar la ribonucleoproteína sgRNA-Cas9 combinada (RNP) incubando una solución compuesta de 30 nM de sgRNA como se ha sintetizado anteriormente, 30 nM de proteína Cas9, 10x tampón de reacción y 10 l de agua a 25 oC durante 10 min. Pruebe la capacidad de escisión del sgRNA añadiendo el producto PCR de la región objetivo a la solución RNP a una concentración final de 3 nM. Incubar la solución a 37oC durante 15 min. Añadir 3 g de proteinasa K y 2 g de RNase a la solución para detener la reacción de escote e incubar a temperatura ambiente durante 10 min. Visualice los fragmentos de ADN resultantes en un gel de agarosa del 2%. El sgRNA es adecuado para la experimentación in vivo si se observan dos bandas del tamaño esperado en el gel. 3. Diseño y síntesis del dDNA Diseñar el dDNA que se compone de tres regiones- 5′ y 3′ regiones con complementariedad con la región genómica a la que se está apuntando y una región media que alberga un marcador seleccionable (Tabla de materiales, Figura 2).NOTA: También se pueden agregar otras secuencias específicas a este marcador seleccionable. Para este experimento en particular, se añadió una secuencia de codon de parada (5′ TGA 3′) justo antes del marcador seleccionable, introduciendo así un codón de parada en el marco en el gen. El dDNA se puede pedir presintesizado. Alternativamente, el dDNA se puede amplificar y ensamblar utilizando un enfoque de PCR escalonado y superpuesta como se detalla a continuación. Diseñe imprimaciones para amplificar aproximadamente 800 bp de las regiones de flanqueo de 5′ y 3′. Agregue 20 nt de secuencia que sea complementaria a la secuencia del marcador seleccionable a la imprimación inversa de la región 5′ y la imprimación hacia delante de la región de 3′. Diseñe imprimaciones que amplifican el marcador seleccionable, asegurando que el producto amplificado alberga el gen de resistencia, así como un promotor conocido por trabajar en las especies de interés. Utilizando una polimerasa de ADN de alta fidelidad(Tabla de Materiales),amplificar las tres regiones de dDNA. Amplificar las regiones de 5′ y 3′ del gDNA del organismo que se está editando. Amplifique el marcador seleccionable de un origen relevante. En una sola reacción, combine la región amplificada de 5′ con el marcador seleccionable y, utilizando una polimerasa de ADN de largo alcance y alta fidelidad, amplificar toda la región. En una segunda reacción única, combine la región amplificada de 3′ con el marcador seleccionable y, utilizando una polimerasa de ADN de largo alcance y alta fidelidad, amplificar toda la región. Por último, combine los dos productos de PCR anteriores en una sola reacción y amplifique toda la secuencia de dDNA con una polimerasa de ADN de largo alcance y alta fidelidad. Visualiza el fragmento de ADN en un gel de agarosa al 1%. En el caso de que se produzcan dos o más fragmentos, purifique el fragmento del gel del tamaño correcto utilizando un kit de purificación de gel. 4. Extracción de protoplastos Para producir conidia, inocular 200 ml de caldo de extracto de malta fresco al 2% (MEB) en un matraz de 500 ml con un bloque de agar cubierto de micelio de 1 cm x 1 cm.NOTA: No todos los hongos son capaces de producir conidia. En ese caso, también se puede utilizar micelia. Esto normalmente requerirá mayores concentraciones de enzima de aclaración más adelante en el protocolo. Incubar el cultivo líquido en una incubadora de agitación a 25oC con agitación a 120 rpm durante 24 – 48 h.NOTA: Este tiempo de incubación y temperatura se ha optimizado para H. omanensis. Esto tendrá que ser optimizado para otras especies. Para cosechar la conidia; filtrar el cultivo líquido a través de una capa de paño de laboratorio estéril (por ejemplo, Miracloth), transferir la suspensión conidial a tubos de centrífuga de 50 ml y centrífuga a 3.220 x g a 4 oC durante 10 min. Deseche el sobrenadante. Resuspender la conidia en 5 ml de agua y pipeta 10 l de la solución de conidia en un portaobjetos del microscopio y cubrir con un cubreobjetos. Visualizar utilizando un microscopio compuesto bajo aumento de 40x para asegurarse de que sólo se han recuperado conidia(Figura 3A). En un matraz de 500 ml, inocular 200 ml de 1% MEB fresco con el volumen total de conidia resuspendada. Incubar el cultivo líquido en una incubadora de agitación a 25oC con temblor a 120 rpm durante un máximo de 12 h.NOTA: Este tiempo de incubación ha sido optimizado para H. omanensis. Esto tendrá que ser optimizado para otras especies. Para cosechar los germens, transfiera el cultivo líquido a tubos centrífugos de 50 ml y centrífuga a 3.220 x g a 4 oC durante 10 min. Deseche el sobrenadante. Resuspender los germens en hasta 10 ml de 1 M de sorbitol. Pipetear 10 l de la solución germinal en un portaobjetos del microscopio y cubrir con un cubreobjetos. Visualizar utilizando un microscopio compuesto bajo aumento de 40x para asegurarse de que sólo se han recuperado gérmenes(Figura 3B).NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Almacene los germens en 1 M de sorbitol a -80 oC. Para eliminar las paredes celulares de los gérmenes jóvenes y liberar los protoplastos, añadir 1 ml de la suspensión germinante a 9 ml de enzima lysing a diversas concentraciones en un matraz estéril de 50 mL.NOTA: Se utilizan diferentes concentraciones de enzimas y tiempos de incubación que se pueden encontrar en la Tabla 1. Las enzimas y concentraciones también son probables que varíen dependiendo del hongo y tendrán que ser optimizadas para cada especie. Incubar la solución enzimática de esporas en una incubadora de agitación a 25oC con agitación a 80 rpm durante 2 a 3 h. Filtrar la solución de protoplasto a través de una capa de tela de laboratorio estéril y recoger los protoplastos por centrifugación a 1.810 x g a 4 oC durante 10 min. Deseche el sobrenadante.NOTA: Los protoplastos son células sin paredes celulares y, por lo tanto, son muy sensibles a las interrupciones mecánicas. Asegúrese de manejarlos con cuidado, especialmente cuando pipetee. Resuspender cuidadosamente el pellet de protoplasto en 200 l de tampón STC(Tabla de materiales). Pipetear 10 l de la solución de protoplasto en una diapositiva del microscopio y cubrir con un cubreobjetos. Visualice utilizando un microscopio compuesto bajo aumento de 40x para asegurarse de que sólo se han recuperado protoplastos(Figura 3C). Usando un hemocicómetro, cuente y calcule el número de protoplastos generados en los pasos anteriores. Diluir la solución de protoplasto en alícuotas que contengan aproximadamente 5 x 106 protoplastos.NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Almacene los protoplastos en el tampón STC a -80 oC. 5. Transformación asistida por protoplast y PEG y recuperación transformadora Para comenzar la transformación, combine aproximadamente 5 x 106 protoplastos con un solo volumen de la solución RNP y aproximadamente 6 g del fragmento de dDNA.NOTA: Los protoplastos son muy sensibles a las interrupciones mecánicas. Asegúrese de manejarlos con cuidado, especialmente cuando pipetee. Con una pipeta, gotee lentamente 1 ml de una solución recién preparada de 30% de PTC sobre la solución de protoplasto e incubar la solución a temperatura ambiente durante 20 min.NOTA: Este paso es un paso sensible y muy importante. Asegúrese de utilizar la solución de PTC recién preparada y dejar caer la solución sobre las células de la forma más lenta y uniforme posible, creando una capa hidrófoba a través de la superficie celular. Añadir 5 ml de medio de control osmótico (OCM) a la solución de protoplasto y pipeta lenta y suavemente para asegurar que la solución se mezcle a fondo. Incubar la solución de protoplasto en una incubadora de agitación a 25oC con agitación a 80 rpm durante la noche. Para seleccionar los aislados transformados, divida la solución en 5 placas de cultivo vacías de 60 mm. Añadir 10 mL de agar OCM complementado con higromicina B de 30 g/ml a cada placa de cultivo y girar lentamente cada plato para mezclar a fondo. Permita que la primera capa de agar se ajuste antes de añadir 10 ml de agar medio de control osmótico complementado con higromicina B de 40 g/ml. Permita que la segunda capa de agar establezca e incubar los cultivos a 25 oC hasta que se puedan ver aislados individuales creciendo a través de ambas capas de agar. Para recuperar los aislados transformados con éxito, transfiera los aislados individuales capaces de crecer a través de la capa de agar complementada con 40 g/ml de higromicina B a placas de agar de extracto de malta fresca (MEA) complementadas con placas de higromicina B de 50 g/ml (MEA-50). Incubar los cultivos frescos a 25oC durante 5 días, comprobando diariamente el crecimiento. Las culturas capaces de un crecimiento sostenido en estos medios se han transformado con éxito y se pueden utilizar para un estudio posterior. 6. Confirmación de la integración y estabilidad del dDNA Para confirmar que el dDNA se ha integrado en el genoma de la región objetivo, diseñe imprimaciones que flanqueen los sitios de inserción previstos de 5′ y 3′(Figura 2). Realice dos PCR utilizando estos dos conjuntos de imprimación y una polimerasa de ADN de alta fidelidad. Si ambos ITP producen amplicons del tamaño y la secuencia esperados, el dDNA se integró correctamente en la región de destino. A continuación, evalúe la mancha mutante para la integración estable del dDNA. Con el fin de confirmar que el dDNA se ha integrado de forma estable en el genoma y se mantendrá durante el crecimiento vegetativo, realice una prueba de transferencia de medios. Transfiere un bloque de agar cubierto de micelial de un aislado mutante en crecimiento activo en medio MEA-50 a un medio MEA sin suplemento. Incubar a 25oC durante 3 días. Transfiera un bloque de agar cubierto de micelio del aislado que crece en el medio MEA al medio MEA-50. Incubar a 25oC durante 3 días. Repita este proceso, transfiriendo micelios en crecimiento activo de medios suplementados a no suplementados durante al menos cuatro rondas.NOTA: Si el aislado es capaz de un crecimiento sostenido en el medio MEA-50 después de muchas transferencias, el dDNA se ha integrado de forma estable en el genoma y se puede mantener a través del crecimiento vegetativo. La mancha mutante se puede evaluar para la presencia de una sola copia del dDNA integrado. Para confirmar que el dDNA se ha integrado en el genoma en un solo lugar, realice un análisis de manchas meridionales. Digerir un total de 30 g de gDNA de cada cepa mutante utilizando enzimas de restricción HindIII y EcoRI de acuerdo con los protocolos del fabricante.NOTA: Mientras que la elección de la enzima de restricción depende del investigador, asegúrese de que el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción no está presente en la secuencia de dDNA. Separe el gDNA digerido en un gel de agarosa del 0,75% y transfiera el ADN a una membrana de nylon utilizando los procedimientos estándar32. Somete la membrana a hibridación utilizando una sonda dirigida a la secuencia dDNA. Diseñe imprimaciones para amplificar una región corta (300 bp) del dDNA. Usando estos imprimadores, sintetice la sonda usando una mezcla de etiquetado PCR DIG. Utilice la sonda recién sintetizada para la hibridación de membranas, el tratamiento y la visualización utilizando los procedimientos estándar32. Si sólo se ve una sola banda en cada carril, el dDNA está presente en una sola ubicación en el genoma. La cepa mutante ahora se puede utilizar para más análisis fenotípicos y experimentos de caracterización funcional. 7. Análisis fenotípico de las cepas mutantes Llevar a cabo experimentos de apareamiento para determinar si la interrupción del gen MAT tuvo un efecto en las capacidades sexuales del hongo que se está estudiando.NOTA: Este paso depende del gen y las especies particulares que se están estudiando. En este caso, se cree que el gen que se está apuntando está involucrado en la reproducción sexual y, por lo tanto, se llevaron a cabo pruebas de apareamiento. Si se pensaba que el gen, por ejemplo, participaba en la reproducción asexual, entonces se podría medir algo como la producción conidial. Con el fin de probar las capacidades heterotálicas de la cepa mutante, co-inocular nuevo medio MEA con una cepa mutante, así como una cepa de tipo de apareamiento opuesto. En el caso de H. omanensis,mantener los párpados de las placas cerradas, pero no sellados e incubar a temperatura ambiente durante 7 días. Evaluar visualmente la producción de estructuras sexuales. Con el fin de probar las capacidades homotálicas de la cepa mutante, inocular nuevo medio MEA con una cepa mutante. En el caso de H. omanensis,mantener los párpados de las placas cerradas, pero no sellados e incubar a temperatura ambiente durante 7 días. Evaluar visualmente la producción de estructuras sexuales. Llevar a cabo experimentos de tasa de crecimiento para determinar si la interrupción del gen MAT tuvo un efecto en la tasa de crecimiento del hongo que se está estudiando. Crea tapones de agar cubiertos de micelias a partir del borde en crecimiento activo de los cultivos de las cepas mutantes y de tipo salvaje insertando la parte posterior de una punta de pipeta grande y estéril en el agar. Inocular el medio MEA fresco con estos tapones de agar. Asegúrese de que se realizan al menos tres réplicas por cada tipo de referencia cultural. Después de 3 días de crecimiento a 20oC, mida el crecimiento en dos diámetros perpendiculares. Compara los datos de las cepas wildtype y mutantes.

Representative Results

El protocolo descrito anteriormente facilitó la introducción de un codón de parada prematura en un gen de apareamiento del ascomiceto no modelo, H. omanensis. Este proceso utilizó una versión del sistema de edición del genoma CRISPR-Cas9 y como tal uno de los pasos más importantes en este protocolo es el diseño y la síntesis de un sgRNA de alta calidad. La Figura 1 muestra cómo esta molécula fue diseñada de tal manera que A) se dirige específicamente al gen de interés y muestra poca similitud con otras regiones del genoma y B) se pliega correctamente para unirse con la proteína Cas9. El sgRNA también debe ser capaz de cortar eficazmente la región de destino. La capacidad del sgRNA para apuntar y permitir el escote de la región objetivo se llevó a cabo in vitro,produciendo dos productos del tamaño esperado. Una vez que se ha llevado a cabo una transformación exitosa, es importante asegurarse de que el dDNA se ha integrado en el genoma una sola vez y en el lugar esperado. La Figura 2 ilustra el diseño de imprimaciones PCR que se dirigen a los sitios de inserción, que se pueden utilizar para examinar a los transformadores potenciales para el sitio de integración correcto. Al diseñar imprimaciones que flanquean los sitios de inserción de 5′ y 3′, la amplificación sólo es posible si el dDNA se inserta en la región correcta. La Figura 4 ilustra que el codón de parada prematura se introdujo en el gen MAT1-2-7 en el marco de lectura correcto, asegurando que el gen se truncaría de manera similar a la de H. moniliformis. Además, el análisis de Southern blot mostró que la construcción de dDNA sólo se integró en un solo sitio en el genoma. El éxito del protocolo se confirmó en el análisis fenotípico de las cepas mutantes. En el caso del experimento de interrupción MAT1-2-7, se desarrollaron dos cepas mutantes independientes. En ambos aislados, la tasa de crecimiento radial vegetativo se redujo significativamente, lo que sugiere un efecto pleiotrópico del nuevo gen de apareamiento (Figura 5). Además, los aislados mutantes eran incapaces de completar un ciclo sexual, produciendo sólo estructuras sexuales inmaduras que no producían esporas sexuales (Figura 5). Esto contrastaba con los aislados de tipo salvaje, que completaron todo el ciclo sexual a los pocos días de la incubación(Figura 5). Figura 1: Elegir un candidato adecuado de sgRNA.(A) Un sgRNA adecuado sólo tendrá similitud con la región objetivo del genoma (en este caso indicada por la secuencia de locus de mat). (B) Un sgRNA adecuado tendrá idénticas estructuras secundarias de energía libre mínima y centroide, con los tres bucles de vástago y cinco anillos en el bucle de paso primario. Además, la mayoría de la estructura tendrá altas probabilidades de unión (indicadas en naranja oscuro y rojo) mientras que las probabilidades de unión más bajas deben verse en la región del protoespacial (indicada por los triángulos negros). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Diseño, amplificación y montaje del dDNA.El primer y segundo par de imprimación (PP1 y PP2) se utilizan para amplificar aproximadamente 800 bp aguas arriba (5′) y 800 bp aguas abajo (3′) del gen de interés. La imprimación inversa de PP1 y la imprimación delantera de PP2 incluyen regiones de homología al casete de resistencia a la higromicina. El tercer par de imprimación amplifica todo el casete de resistencia a la higromicina. De manera escalonada, los diversos amplicons se ensamblan hasta que se monta todo el dDNA, compuesto por la región de 5′, el casete de resistencia a la higromicina y la región de 3′. Cuando se transforma en la célula, el dDNA debe recombinarse en la región donde la enzima Cas9 habrá sido dirigida a cortar, reemplazando así el gen de interés con el casete de resistencia a la higromicina. PP4 y PP5 se pueden utilizar para determinar si el dDNA se ha insertado correctamente en el genoma en el lugar adecuado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Los diferentes tipos de células importantes durante el protocolo de extracción de protoplastos.(A) Conidia se utilizan como material de partida para el protocolo. A estas conidias se les permite germinar y crecer hasta que sean(B)gérmenes jóvenes. La fase de crecimiento ideal de los gérmenes jóvenes se indica mediante las dos flechas negras. Otras hebras miceles observadas en (B) son demasiado maduras para la degradación y no deben utilizarse. El último paso del protocolo es la liberación de los protoplastos redondos (C),indicados por los círculos de puntos negros. Estas células ya no tienen paredes celulares y, por lo tanto, son muy sensibles a las interrupciones mecánicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: La integración exitosa del codón de parada TGA en el gen MAT1-2-7 de H. omanensis.(A) El gen de longitud completa H. omanensis MAT1-2-7, con el sitio objetivo sgRNA indicado por la flecha verde. (B) Un esquema magnificado del sitio objetivo de sgRNA dentro del gen H. omanensis MAT1-2-7. (C) Un esquema magnificado de una región del dDNA que muestra el codón de parada flanqueado por brazos homólogos al gen MAT1-2-7 de H. omanensis. (D) Cromatograma de secuencia Sanger que indica la integración exitosa del codón de parada en el gen MAT1-2-7. Modificado de Wilson et al. 202021. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5: Las diferencias fenotípicas entre (A) aislados de tipo salvaje y (B) aislados mutantes.Las tres primeras imágenes de cada panel muestran las diferencias en las capacidades sexuales de los dos tipos de aislados. Mientras que los aislados de tipo salvaje forman ascomata madura durante la reproducción sexual, completa con la exudación de esporas de las puntas de los cuellos ascomatarios, los aislados mutantes forman sólo estructuras sexuales inmaduras que no producen ninguna espora sexual. La cuarta imagen de cada panel muestra la diferencia en la tasa de crecimiento y morfología de los dos tipos de aislados. Mientras que el aislado de tipo salvaje crece mucho más rápido y con más micelia aérea, el mutante muestra más lento y se sumerge dentro del agar. Modificado de Wilson et al. 202021. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Reacción Concentración de enzimas Tiempo de degradación Un 1.250 mg/ml 180 min B 1.875 mg/ml 180 min C 2.500 mg/ml 150 min D 3.750 mg/ml 150 min E 4.375 mg/ml 120 min F 5.000 mg/ml 120 min Tabla 1: Degradación de la solución de germen/micelia con enzimas de coloración de Trichoderma harzianum. Las diferentes concentraciones de enzimas corresponden a diferentes períodos de incubación, con concentraciones más bajas que requieren incubaciones más largas.

Discussion

El protocolo para la transformación exitosa de H. omanensis y la edición del gen MAT1-2-7 se demostró mediante la introducción de un codón de parada prematura en el marco junto con un gen para la resistencia a la higromicina B21. Esto se logró utilizando una versión basada en proteínas del sistema de edición del genoma CRISPR-Cas9. El experimento implicó la transcripción in vitro del sgRNA, el ensamblaje basado en PCR del dDNA y la cointravención de estos dos ácidos nucleicos con una enzima Cas9 disponible comercialmente en protoplastos extraídos de H. omanensis

A diferencia de otros protocolos que dependen de la disponibilidad de muchas otras herramientas moleculares, el protocolo descrito anteriormente se puede utilizar con éxito en especies para las que la caja de herramientas molecular está todavía bastante limitada21. El protocolo se basa únicamente en un sistema de transformación establecido y en la disponibilidad de datos NGS, preferiblemente en la secuencia completa del genoma. Si bien un sistema de transformación eficaz puede tomar alguna optimización en una especie para la que esto no está disponible, hay muchos protocolos diferentes disponibles para una variedad de especies. Además, los datos del genoma están cada vez más disponibles incluso para las especies más oscuras y son cada vez más fáciles de generar de novo si aún no existen.

Dada la longitud del protocolo, hay muchos pasos en los que se pueden introducir modificaciones y donde puede ser necesario solucionar problemas. Esto es particularmente cierto en los pasos que se consideran específicos de las especies. Por ejemplo, hay muchos pasos de incubación en este protocolo que deben llevarse a cabo a temperaturas específicas y durante períodos de tiempo específicos con el fin de generar tipos de células importantes para el experimento. Por lo tanto, estos pasos requerirían una optimización específica de la especie. Siempre que sea posible, se han proporcionado micrografías de las células o fases de crecimiento particulares para ayudar a transferir este protocolo a una especie diferente(Fig. ure 1). El tipo y la concentración de enzimas utilizadas para degradar las paredes celulares de las células fúngicas con el fin de liberar los protoplastos también será específico de las especies de hongos que se están estudiando. En este protocolo, sólo se utiliza una fuente de enzimas de lansión, mientras que se requieren diferentes combinaciones de enzimas para la extracción de protoplastos en especies como Fusarium verticillioides33. Este paso depende enteramente de la marca química de la pared celular y por lo tanto tendrá que ser optimizado en una base de especie a especie.

Este método es particularmente significativo para aquellos que estudian especies no modelo, ya que no hay dependencia de un sistema de expresión. Un método popular para establecer el sistema de edición del genoma CRISPR-Cas9 es expresar la proteína Cas9, el sgRNA, así como el dDNA de uno o dos plásmidos que se transforman en las células de elección. En este caso, el Cas9 debe ser expresado por un promotor que sea capaz de altos niveles de expresión en el organismo en particular que se está estudiando. Los promotores generales han sido desarrollados para su uso en hongos filamentosos y aunque no son compatibles en todas las especies, permiten una expresión de bajo nivel y se pueden utilizar con éxito para expresar, por ejemplo, genes de resistencia a los antibióticos. Estos promotores, sin embargo, a menudo no permiten altos niveles de expresión y por lo tanto no se pueden utilizar para expresar la proteína Cas9. El uso de una versión basada en proteínas del sistema de edición del genoma CRISPR-Cas9 supera esta limitación y permite que el sgRNA y el dDNA se transformen conjuntamente en la célula con una enzima Cas9 ya producida.

El desarrollo de este sistema basado en proteínas para su uso en H. omanensis se produjo después de muchos intentos fallidos de edición del genoma utilizando tanto el enfoque clásico de marcador dividido como el sistema CRISPR-Cas9 basado en plásmidos. Si bien las eficiencias difieren de una especie a otra, el enfoque de marcador dividido se ha utilizado con éxito con una eficiencia del 100% en especies tan diversas como Alternaria alternata34,35y C. nicotianae36. Por el contrario, la eficiencia de este sistema en H. omanensis fue cero, a pesar de más de 80 eventos independientes de transformación e integración. Del mismo modo, el sistema CRISPR-Cas9 basado en plásmidos se ha utilizado con éxito con altas eficiencias en Trichoderma reesei (>93%)17 y Penicillium chrysogenum (hasta 100%)37. Esto es, de nuevo, en contraste con la utilidad de este sistema en H. omanensis. La expresión suficiente de la proteína Cas9 no fue alcanzable en H. omanensis a pesar de probar una serie de promotores potenciales, incluyendo dos promotores específicos de especies predichas a partir de genes de limpieza. Por lo tanto, este sistema no se pudo utilizar en absoluto. Sin embargo, el uso de la versión basada en proteínas del sistema CRISPR-Cas9 produjo muchos transformantes independientes, dos de los cuales albergaron el dDNA integrado en la ubicación correcta. Además, este experimento se intentó una sola vez y tuvo éxito, ilustrando aún más la facilidad con la que se puede utilizar este sistema.

Las aplicaciones futuras de este protocolo incluyen su optimización y uso en otras especies de las Ceratocistodídaceae. Ya hay una gran cantidad de datos NGS disponibles para estas especies30,,38,,39 y se han realizado estudios sobre su especificidad de huésped40,tasa de crecimiento y virulencia41. Estos estudios pueden ser reforzados por la caracterización funcional de los genes que se cree que están involucrados en estos procesos, investigación que ahora será posible debido a la disponibilidad de un protocolo de transformación y edición del genoma.

En conclusión, la investigación exhaustiva de los genes subyacentes a importantes procesos biológicos en especies no modelos es cada vez más accesible gracias a la disponibilidad de protocolos de edición del genoma fáciles de usar que no se basan en la existencia de amplios recursos biológicos y conjuntos de herramientas moleculares. El estudio de especies no modelos es cada vez más fácil y permitirá el descubrimiento de nuevas vías y desviaciones interesantes de los procesos biológicos estándar que han sido aclarados en especies modelo.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este proyecto contó con el apoyo de la Universidad de Pretoria, el Departamento de Ciencia y Tecnología (DST)/National Research Foundation (NRF) Centre of Excellence in Tree Health Biotechnology (CTHB). El proyecto fue también apoyado por la silla DST/NRF SARChI del prof. BD Wingfield en Genómica De los Hongos (número de concesión: 98353), así como por la beca de doctorado NRF del Dr. AM Wilson (108548). Los titulares de subvenciones reconocen que las opiniones, conclusiones y conclusiones o recomendaciones expresadas en este trabajo son las de los investigadores y que los organismos de financiación no aceptan responsabilidad alguna a este respecto.

Materials

EcoRI-HF New England Biolabs, Ipswich, USA R3101S
EnGen Spy Cas9 NLS protein New England Biolabs, Ipswich, USA M0646T Used to assemble the RNP
Eppendorf 5810 R centrifuge Eppendorf, Hamberg, Germany
FastStart Taq DNA Polymerase Sigma, St Louis, USA 12032902001 Standard DNA polyermase
GeneJET Gel Extraction Kit ThermoFisher Scientific, Waltham, USA K0691
HindIII-HF New England Biolabs, Ipswich, USA R3104S
HiScribeTM T7 Quick High Yield RNA synthesis kit New England Biolabs, Ipswich, USA E2050S
Hygromycin B from Streptomyces hygroscopicus Sigma, St Louis, USA 10843555001
Infors HT Ecotron Shaking Incubator Infors AG, Bottmingen, Switzerland
LongAmp Taq DNA Polymerase New England Biolabs, Ipswich, USA M0323S Long-range, high-fidelity DNA polymerase
Malt extract agar, 2% (MEA) 20 g ME and 20 g agar in 1 l ddH20
Malt extract Sigma, St Louis, USA 70167-500G
Agar Sigma, St Louis, USA A5306
Malt Extract broth, 1% (MEB) Sigma, St Louis, USA 70167-500G 2 g ME in 200 ml ddH20
Malt Extract broth, 2% (MEB) Sigma, St Louis, USA 70167-500G 4 g ME in 200 ml ddH20
Miracloth Merck Millipore, New Jersey, USA 475855
Nylon membrane (positively charged) Sigma, St Louis, USA 11209299001
Osmotic control medium (OCM) 0.3% yeast extract, 20% sucrose, 0.3% casein hydrolysate
Casein Hydrolysate Sigma, St Louis, USA 22090
Sucrose Sigma, St Louis, USA 84097
Yeast extract Sigma, St Louis, USA Y1625
Osmotic control medium (OCM) agar Osmotic control medium (OCM) + 1% agar
Agar Sigma, St Louis, USA A5306
PCR DIG Labeling Mix Sigma, St Louis, USA 11585550910
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase ThermoFisher Scientific, Waltham, USA F-530XL High fidelity DNA polymerase
Plasmid pcb1004 N/A N/A From: Carroll et al., 1994
Presynthesized sgRNA Inqaba Biotec, Pretoria, South Africa Ordered as an synthesized dsDNA with specified sequence
Proteinase K Sigma, St Louis, USA P2308
PTC Solution 30% polyethylene glycol 8000 in STC buffer from above
Polyethylene glycol 8000 Sigma, St Louis, USA 1546605
RNase A ThermoFisher Scientific, Waltham, USA 12091021
RNAfold Webserver Institute for Theoretical Chemistry, University of Vienna N/A http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi
RNAstructure Mathews Lab N/A https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/Predict1.html
Sorbitol, 1 M Sigma, St Louis, USA 1617000 182.17g sorbitol in 1 l ddH20
STC Buffer 20% sucrose, 50 mM Tris-HCl pH 8.00 and 50 mM CaCl2
Calcium chloride Sigma, St Louis, USA 429759
Tris-HCl pH 8.00 Sigma, St Louis, USA 10812846001
Sucrose Sigma, St Louis, USA 84097
Trichoderma harzianum lysing enzymes Sigma, St Louis, USA L1412
Zeiss Axioskop 2 Plus Ergonomic Trinocular Microscope Zeiss, Oberkochen, Germany
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Wilson, A. M., Wingfield, B. D. CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis. J. Vis. Exp. (160), e61367, doi:10.3791/61367 (2020).
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