クラミジア・トラコマティスにおける発生変異体の同定と分離に対する生細胞前方遺伝的アプローチ
Summary
このプロトコルは、クラ ミジア・トラコマティスの発生変異体を同定および単離するための指向的な前方遺伝的アプローチにおける蛍光プロモーター−レポーター、生細胞顕微鏡、および個々の包含抽出を利用する。
Abstract
細胞内細菌病原体 クラミジア・トラコマティス は、形態学的に離散的な2つの発達形態からなる発達周期を受ける。非複製性の初等体(EB)は宿主の感染を開始する。中に入ると、EBはレチク体(RB)に分化する。RBは、感染性のEBフォームに再び区別する前に、複製の複数のラウンドを受けます。このサイクルは、細胞タイプ間の切り替えの失敗が宿主の侵入または複製を妨げるため、クラミジア生存に不可欠である。
クラミジアの細胞内の性質に起因する遺伝的手法の限界は、細胞型の発達に関与する分子機構の同定を妨げている。我々は、生細胞顕微鏡と組み合わせて、リアルタイムで細胞型切替を可視化することを可能にする新しいデュアルプロモーターレポータープラスミドシステムを設計した。細胞型発達の調節に関与する遺伝子を同定するために、生細胞プロモーターレポーターシステムは、二重レポーター株の化学突然変異誘発、クラミジアのイメージングおよび追跡を突然変異体のクローン分離と組み合わせることで、前方遺伝的アプローチの開発に活用された。この前方遺伝的ワークフローは、幅広い遺伝的経路への指示された尋問のために変更することができる柔軟なツールです。
Introduction
クラミジア・トラコマティス (Ctr)は、その生存および増殖に不可欠な二ファシズム発達サイクルを経て進行する細胞内病原体である。このサイクルは、2つの発達形態、初等体(EB)とレチク体(RB)で構成されています。EBは、レプリケーション無能であるが、エフェクター誘発性エンドサイトーシス2を介して細胞の侵入を仲介する。ホストに入ると、EB は複製 RB に成熟します。RBは、感染の後続のラウンドを開始するために、EBに戻って変換する前に、複製の複数のラウンドを実行します。
遺伝的ツールの限られた配列は、生化学的研究または代理システムの使用にクラミジア研究のほとんどを制限しています。その結果、遺伝子調節の解明と発達周期の制御は困難であった3,4.4クラミジアの分野でより重要な課題の1つは、クラミジア発生周期の高分解能時間追跡とその調節に関与するタンパク質の同定である。クラミジア発育サイクル中の遺伝子発現は、従来、RNAEq、qPCR、および固定細胞顕微鏡55,66を含む破壊的な「終点」法によって行われてきた。これらの方法は貴重な情報を提供してきましたが、採用されている技術は面倒で、時間的解像度が低い5,66です。
過去10年の間に、Ctrの遺伝子操作は、プラスミド変換と変異生成77、8、98,の方法の導入と共に進んでいる。この研究では、感染の過程で個々のインクルージョンにおけるクラミジアの発達をリアルタイムで監視するプラスミドベースのシステムが開発された。RBとEB細胞型特異的プロモーターレポーターの両方を発現するクラミジア形転換体を作成した。RB特異的レポーターを、蛍光タンパク質クローバーの初期RB遺伝子ユーオ上流のプロモーターを融合させることにより構築した。EUOは、後期EB関連遺伝子10のサブセットを抑制する転写調節因子である。HCtBのプロモーターは、EBヌクレオイド縮合に関与するヒストン様タンパク質をコードし、mKate2(RFP)の上流に直接クローン化し、EB特異的レポーター11を作成した。hctBプロムmKate2/ユーオプロムクローバーのバックボーンはp2TK2SW27でした.hctBおよびeuoプロモーターを、Ctr-L2ゲノムDNAから増幅した。各プロモーター配列は、指定されたクラミジア遺伝子に対する予測転写開始部位の上流の約100塩基対と、各ORFの最初の30ヌクレオチド(10個のアミノ酸)から構成された。蛍光FP変異体を、Ctrコドン最適化遺伝子ブロックとして商業的に得られ、各クラミジア遺伝子およびプロモーターの最初の30ヌクレオチドを有するフレームでクローニングした。incDターミネーターはmKate2の直接下流にクローン化されました。第2プロモーターレポーターは、incDターミネーターの下流に挿入した。p2TK2SW2のアンピシリン耐性遺伝子(bla)をpBam4からaadA遺伝子(スペクチノマイシン耐性)に置換した。これにより、Ctr-L2 7 に変換された最終的な構築 p2TK2-hctBprom-mKate2/euoprom-クローバー (図 1A)が生まれました。このRB/EBレポーター株は、生細胞顕微鏡を用いた単一インクルージョン内の発達サイクルの観察を可能にした(図1B,C)。
化学変異誘発と組み合わせてプロモーターレポーター構築物を採用し、Ctr血清膜L2の変異原性集団から発達異常を示した個々のクローンを追跡および分離するためのプロトコルが考案されました。このプロトコルは、個々のクラミジアインクルージョンの直接モニタリング、時間の経過に関する遺伝子発現プロファイルの追跡、変化した発生遺伝子発現パターンを発現するクラミジアクローンの同定、およびクラミジアの個々のインクルージョンからの クラミジア のクローン分離を可能にする。
このプロトコルはクラミジアの発達に関与する遺伝子の同定のために特別に作成されたが、クラミジア遺伝的経路の任意の数を尋問するために容易に適応することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
クラミジア発達サイクルを制御するメカニズムを解剖することは、現在利用可能な遺伝的ツールの限界によって妨げられています。プロモーターレポーターのクラミジアを生細胞自動顕微鏡と組み合わせて、24時間にわたって個々のインクルージョンにおける細胞型の発達を監視できるシステムが構築されました。このシステムは、化学的変異誘発と直接包含分離との組み合わせによ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CIP-1無数のメディアを供給してくれたワシントン州立大学のアンダース・オムズランド博士に感謝します。この作業は、NIH助成金R01AI130072、R21AI135691およびR21AI113617によって支えられた。追加のサポートは、彼らのNIH助成金P20GM104420を通じてアイダホ大学とモデリング複雑な相互作用センターからのスタートアップ資金によって提供されました.
Materials
| 24-well polystyrene plates | Corning | 3524 | Cell culture growth for reinfection of isolates |
| 6-well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | Cell culture growth for imaging |
| 96-well glass bottom plates | Nunc | 165305 | Cell culture growth for imaging |
| Bold line CO2 Unit | OKO Labs | CO2 UNIT BL | Stage incubator CO2 control |
| Bold line T Unit | OKO Labs | H301-T-UNIT-BL-PLUS | Stage incubator temperature control |
| Borosilicate glass capillary tubes | Sutter Instrument | B1005010 | Capillary tubes |
| BrightLine bandpass emissions filter (514/30nm) | Semrock | FF01-514/30-25 | Fluoescent filter cube |
| BrightLine bandpass emissions filter (641/75nm) | Semrock | FF02-641/75-25 | Fluoescent filter cube |
| CellTram Vario | Eppendorf | 5196000030 | Microinjector |
| Chlamydia trachmatis serovar L2 | ATCC | VR-577 | Chlamydia trachomatis |
| CIP-1 media | In house | NA | Axenic media. IPB supplemented with 1% FBS, 25 μM amino acids, 0.5 mM G6P, 1.0 mM ATP, 0.5 mM DTT, and 50 μM GTP, UTP, and CTP. (Omsland, A. 2012) made in-house. |
| Cos-7 cells (ATCC) | ATCC | CRL-1651 | African green monkey kidney cell (host cells) |
| Cycloheximide | MP Biomedicals | 194527 | Host cell growth inhibitor |
| Ethyl methanesulfonate, 99% | Acros Organics | AC205260100 | Mutagen |
| Fetal Plex | Gemini Bio-Products | 100-602 | Supplement for base growth media |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/Fiji | NA | Open sourse Image analysis software. https://imagej.net/Fiji |
| Galaxy 170 S CO2 incubator | Eppendorf | CO1700100X | Cell culture incubation |
| gblocks (Fluorescent FP variants: Clover and mKate2) | Integrated DNA Technologies | NA | gblock ORFs of Ctr optimized FP varients for cloning into p2TK2SW2 |
| Gentamycin 10mg/ml | Gibco | 15710-064 | Antibiotic for growth media |
| HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) | Corning | 21-020-CM | Host cells rinse |
| Heparin sodium | Amersham Life Science | 16920 | inhibits and reverses the early electrostatic interactions between the host cell and EBs |
| HEPES 1M | GE Life Sciences | SH30237.01 | pH buffer for growth media |
| InjectMan | Eppendorf | 5179 000.018 | Micromanipulator |
| Jupyter Notebook | https://jupyter.org/ | NA | Visualization of inclusion traces. https://jupyter.org/ |
| Lambda 10-3 | Sutter Instrument | LB10-3 | Filter wheel controler |
| Oko Touch | OKO Labs | Oko Touch | Interface to control the Bold line T and CO2 Unit |
| Prior XY stage | Prior | H107 | Motorized XY microscope stage |
| PrismR Centrifuge | Labnet | C2500-R | Temperature controlled microcentrifuge |
| Problot Hybridization oven | Labnet | H1200A | Rocking Incubator for infection with Chlamydia |
| Proscan II | Prior | H30V4 | XYZ microscope stage controler |
| Purifier Class 2 Biosafety Cabinet | Labconco | 362804 | Cell culture work |
| RPMI-1640 (no phenol red) | Gibco | 11835-030 | Base growth media for imaging |
| RPMI-1640 (phenol red) | GE Life Sciences | SH30027.01 | Base growth media |
| scopeLED excitation LEDs (470nm,595nm) | scopeLED | F140 | Excitation light |
| Sonic Dismembrator Model 500 | Fisher Scientific | 15-338-550 | Sonicator, resuspending chlamydial pellet |
| Stage incubator | OKO Labs | H301-K-FRAME | Cluster well plate incubation chamber |
| sucrose-phosphate-glutamate buffer 1X (SPG) | In house | NA | Chlamydial storage buffer. (10 mM sodium phosphate [8 mM K 2HPO 4, 2 mM KH 2PO 4], 220 mM sucrose, 0.50 mM L-glutamic acid; pH 7.4) |
| T-75 Flasks | Thermo Scientific | 156499 | Cell culture growth |
| TE 300 inverted microscope | Nikon | 16724 | microscope |
| THOR LED | Thor Labs | LEDD1B | White light |
| Trypsin | Corning | 25-052-CI | Dislodges host cells from flask for seeding into plates |
| Zyla sCMOS | Andor | ZYLA-5.5-USB3 | imaging camera |
| µManager 2.0gamma | https://github.com/micro-manager/micro-manager | NA | Open sourse automated microscope control software package |
References
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