גישה גנטית חיה-תא קדימה לזהות ולבודד מוטנטים התפתחותיים ב trachomatis כלמידיה
Summary
פרוטוקול זה משתמש יזם פלורסנט-כתבים, מיקרוסקופית תא חי, וחילוץ הכללה בודדים בגישה גנטית קדימה מכוונת לזהות ולבודד מוטציות התפתחותיות של כלמידיה trachomatis.
Abstract
הפתוגן התוך תאי כלמידיה trachomatis עובר מחזור התפתחותי המורכב משתי צורות התפתחותיות מורפולוגית דיסקרטית. הגוף היסודי שאינו משוכפל (EB) יוזם זיהום של המחשב המארח. ברגע שנכנס, EB מבדיל לתוך הגוף reticulate (RB). לאחר מכן RB עובר סיבובים מרובים של שכפול, לפני ההבדיל בחזרה לטופס EB מדבק. מחזור זה חיוני להישרדות כלמידית ככישלון לעבור בין סוגי תאים מונע פלישה מארחת או שכפול.
מגבלות בטכניקות גנטיות בשל האופי התוך תאי המחייב של כלמידיה יש לעכב את הזיהוי של המנגנונים המולקולריים המעורבים בפיתוח סוג התא. עיצבנו מערכת פלסמיד מקדם-כתב-יזם-חדשני, שבילוב עם מיקרוסקופית תאים חיים, מאפשרת הדמיה של החלפת סוג תא בזמן אמת. כדי לזהות גנים המעורבים ברגולציה של פיתוח סוג תא, מערכת יחצ”ן-כתב תא חי היה ממונף לפיתוח גישה גנטית קדימה על ידי שילוב mutagenesis כימי של זן הכתב הכפול, הדמיה ומעקב של כלמידיה עם קינטיקה התפתחותית שונה, ואחריו בידוד clonal של מוטציות. זרימת עבודה גנטית זו קדימה היא כלי גמיש שניתן לשנות לחקירה מכוונת למגוון רחב של מסלולים גנטיים.
Introduction
כלמידיה trachomatis (Ctr) הוא פתוגן תאי חובה המתקדם דרך מחזור התפתחותי דו-פאזי חיוני להישרדותווהתפשטותו 1. מחזור זה מורכב משתי צורות התפתחותיות, הגוף היסודי (EB) והגוף reticulate (RB). EB הוא שכפול לא יושר אבל מתווכת פלישה לתא באמצעות אפקט המושרה אנדוציטוזיס2. פעם אחת במארח, EB מתבגר RB משוכפל. RB מבצע סיבובים מרובים של שכפול לפני המרה בחזרה EB על מנת ליזום סיבובים הבאים של זיהום.
המערך המוגבל של כלים גנטיים הגביל את רוב המחקר הכלמידלי למחקרים ביוכימיים או לשימוש במערכות חלופיות. כתוצאה מכך, ההבררה של ויסות גנים ושליטה במחזור ההתפתחותי היהקשה 3,4. אחד האתגרים החשובים יותר בתחום הכלמידיאלי הוא מעקב זמני ברזולוציה גבוהה של מחזור התפתחותי כלמידיאלי וזיהוי החלבונים המעורבים בוויסותו. ביטוי גנים במהלך מחזור התפתחותי כלמידי בוצע באופן מסורתי על ידי הרסני “נקודת קצה” שיטות כולל RNAseq, qPCR, מיקרוסקופית תאקבוע 5,6. למרות ששיטות אלה סיפקו מידע רב ערך, הטכניקות המועסקות הן מייגעות ויש להןרזולוציה זמנית נמוכה 5,6.
בעשור האחרון, מניפולציה גנטית של Ctr התקדמה עם המבוא של טרנספורמציה פלסמיד ושיטות mutagenesis7,,8,9. עבור מחקר זה, מערכת מבוססת פלסמיד פותחה כדי לפקח על התפתחות כלמידיאל בהכללות בודדות בזמן אמת במהלך זיהום. נוצר טרנספורמטציה כלמידית שהביעה הן RB והן EB סוג ספציפי יחצ”ן ספציפי-כתב. הכתב הספציפי RB נבנה על ידי היתוך היזם של הגן RB מוקדם euo במעלה הזרם של קלובר חלבון פלורסנט. EUO הוא רגולטור שעתוק המדכא תת קבוצה של גנים הקשורים EB מאוחר10. היזם של hctB, אשר מקודד חלבון דמוי היסטון מעורב עיסוק גרעין EB, שוכפל ישירות במעלה הזרם של mKate2 (RFP) כדי ליצור את הכתב הספציפי EB11. עמוד השדרה של hctBנשף-mKate2 /euoהנשף-תלתן היה p2TK2SW27. מקדמי HCTB ו-euo הוגדלו מהדנ”א הגנומי CTR-L2. כל רצף מקדם כלל ~ 100 זוגות בסיס במעלה הזרם של אתר ההתחלה שעתוק חזוי עבור הגן הכלמידיאלי שצוין בתוספת 30 נוקלאוטיד הראשון (10 חומצות אמינו) של ORF בהתאמה. גרסאות FP פלורסנט הושגו באופן מסחרי כמו Ctr קודון אופטימיזציה בלוקים גנים משוכפלים במסגרת עם 30 נוקלאוטיד הראשון של כל גן כלמידיאלי יחצ”ן. המחסל של ה-INCD שוכפל ישירות במורד הזרם של mKate2. האמרגן-כתב השני הוכנס במורד הזרם של המחסל של ה-INCD. גן התנגדות אאמפיצילין(bla)ב p2TK2SW2 הוחלף בגן aadA (התנגדות ספקטינומיצין) מ pBam4. התוצאה הייתה המבנה הסופי p2TK2-hctBנשף-mKate2/euoנשף-תלתן (איור 1A) שהפך Ctr-L27. זן זה RB / EB כתב מותר להתבוננות של מחזור התפתחותי בתוך הכללות יחיד באמצעות מיקרוסקופי תא חי(איור 1B,C).
העסקת היזם-כתב שלנו מבנה בשילוב עם mutagenesis כימי, פרוטוקול הומצא כדי לעקוב ולבודד שיבוטים בודדים שהפגינו חריגות התפתחותיות מאוכלוסיות mutagenized של Ctr serovar L2. פרוטוקול זה מאפשר ניטור ישיר של הכללות כלמידיות בודדות, מעקב אחר פרופילי ביטוי גנים לאורך זמן, זיהוי שיבוטים כלמידיים המבטאים דפוס ביטוי גנים התפתחותי שונה, ובידוד מוחלט של כלמידיה מהכללות בודדות.
למרות פרוטוקול זה נוצר במיוחד לזיהוי של גנים המעורבים בהתפתחות כלמידית, זה יכול להיות מותאם בקלות לחקור כל מספר של מסלולים גנטיים כלמידיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
ניתוח המנגנונים לשלוט מחזור התפתחותי כלמידיאלי כבר התעכב על ידי המגבלות של הכלים הגנטיים הזמינים כיום. העסקת היזם שלנו-כתב כלמידיה בשילוב עם מיקרוסקופ אוטומטי תא חי, מערכת נבנתה המאפשר ניטור של פיתוח סוג תא בהכללות בודדות על פני תקופה של 24 שעות. מערכת זו, בשילוב עם mutagenesis כימי ובידוד ה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד”ר אנדרס אומסלנד מאוניברסיטת וושינגטון על שסיפק את התקשורת הגרזן CIP-1. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH R01AI130072, R21AI135691 ו- R21AI113617. תמיכה נוספת סופקה על ידי קרנות סטארט-אפ מאוניברסיטת איידהו והמרכז לאינטראקציות מורכבות מידול באמצעות מענק NIH שלהם P20GM104420.
Materials
| 24-well polystyrene plates | Corning | 3524 | Cell culture growth for reinfection of isolates |
| 6-well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | Cell culture growth for imaging |
| 96-well glass bottom plates | Nunc | 165305 | Cell culture growth for imaging |
| Bold line CO2 Unit | OKO Labs | CO2 UNIT BL | Stage incubator CO2 control |
| Bold line T Unit | OKO Labs | H301-T-UNIT-BL-PLUS | Stage incubator temperature control |
| Borosilicate glass capillary tubes | Sutter Instrument | B1005010 | Capillary tubes |
| BrightLine bandpass emissions filter (514/30nm) | Semrock | FF01-514/30-25 | Fluoescent filter cube |
| BrightLine bandpass emissions filter (641/75nm) | Semrock | FF02-641/75-25 | Fluoescent filter cube |
| CellTram Vario | Eppendorf | 5196000030 | Microinjector |
| Chlamydia trachmatis serovar L2 | ATCC | VR-577 | Chlamydia trachomatis |
| CIP-1 media | In house | NA | Axenic media. IPB supplemented with 1% FBS, 25 μM amino acids, 0.5 mM G6P, 1.0 mM ATP, 0.5 mM DTT, and 50 μM GTP, UTP, and CTP. (Omsland, A. 2012) made in-house. |
| Cos-7 cells (ATCC) | ATCC | CRL-1651 | African green monkey kidney cell (host cells) |
| Cycloheximide | MP Biomedicals | 194527 | Host cell growth inhibitor |
| Ethyl methanesulfonate, 99% | Acros Organics | AC205260100 | Mutagen |
| Fetal Plex | Gemini Bio-Products | 100-602 | Supplement for base growth media |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/Fiji | NA | Open sourse Image analysis software. https://imagej.net/Fiji |
| Galaxy 170 S CO2 incubator | Eppendorf | CO1700100X | Cell culture incubation |
| gblocks (Fluorescent FP variants: Clover and mKate2) | Integrated DNA Technologies | NA | gblock ORFs of Ctr optimized FP varients for cloning into p2TK2SW2 |
| Gentamycin 10mg/ml | Gibco | 15710-064 | Antibiotic for growth media |
| HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) | Corning | 21-020-CM | Host cells rinse |
| Heparin sodium | Amersham Life Science | 16920 | inhibits and reverses the early electrostatic interactions between the host cell and EBs |
| HEPES 1M | GE Life Sciences | SH30237.01 | pH buffer for growth media |
| InjectMan | Eppendorf | 5179 000.018 | Micromanipulator |
| Jupyter Notebook | https://jupyter.org/ | NA | Visualization of inclusion traces. https://jupyter.org/ |
| Lambda 10-3 | Sutter Instrument | LB10-3 | Filter wheel controler |
| Oko Touch | OKO Labs | Oko Touch | Interface to control the Bold line T and CO2 Unit |
| Prior XY stage | Prior | H107 | Motorized XY microscope stage |
| PrismR Centrifuge | Labnet | C2500-R | Temperature controlled microcentrifuge |
| Problot Hybridization oven | Labnet | H1200A | Rocking Incubator for infection with Chlamydia |
| Proscan II | Prior | H30V4 | XYZ microscope stage controler |
| Purifier Class 2 Biosafety Cabinet | Labconco | 362804 | Cell culture work |
| RPMI-1640 (no phenol red) | Gibco | 11835-030 | Base growth media for imaging |
| RPMI-1640 (phenol red) | GE Life Sciences | SH30027.01 | Base growth media |
| scopeLED excitation LEDs (470nm,595nm) | scopeLED | F140 | Excitation light |
| Sonic Dismembrator Model 500 | Fisher Scientific | 15-338-550 | Sonicator, resuspending chlamydial pellet |
| Stage incubator | OKO Labs | H301-K-FRAME | Cluster well plate incubation chamber |
| sucrose-phosphate-glutamate buffer 1X (SPG) | In house | NA | Chlamydial storage buffer. (10 mM sodium phosphate [8 mM K 2HPO 4, 2 mM KH 2PO 4], 220 mM sucrose, 0.50 mM L-glutamic acid; pH 7.4) |
| T-75 Flasks | Thermo Scientific | 156499 | Cell culture growth |
| TE 300 inverted microscope | Nikon | 16724 | microscope |
| THOR LED | Thor Labs | LEDD1B | White light |
| Trypsin | Corning | 25-052-CI | Dislodges host cells from flask for seeding into plates |
| Zyla sCMOS | Andor | ZYLA-5.5-USB3 | imaging camera |
| µManager 2.0gamma | https://github.com/micro-manager/micro-manager | NA | Open sourse automated microscope control software package |
References
- AbdelRahman, Y., Belland, R. The chlamydial developmental cycle. FEMS Microbiology Reviews. 29 (5), 949-959 (2005).
- Clifton, D., et al. A chlamydial type III translocated protein is tyrosine-phosphorylated at the site of entry and associated with recruitment of actin. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 101 (27), 10166-10171 (2004).
- Yu, H. H. Y., Tan, M. σ28 RNA polymerase regulates hctB, a late developmental gene in Chlamydia. Molecular Microbiology. 50 (2), 577-584 (2003).
- Koo, I., Stephens, R. A Developmentally Regulated Two-component Signal Transduction System in Chlamydia. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 17314-17319 (2003).
- Grieshaber, S., et al. Impact of Active Metabolism on Elementary Body Transcript Profile and Infectivity. Journal of Bacteriology. 200 (14), 00065 (2018).
- Belland, R., et al. Genomic transcriptional profiling of the developmental cycle of. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 100 (14), 8478-8483 (2003).
- Wang, Y., et al. Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis: restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002258 (2011).
- Nguyen, B., Valdivia, R. Virulence determinants in the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis revealed by forward genetic approaches. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 109 (4), 1263-1268 (2012).
- Mueller, K., Wolf, K., Fields, K., Maurelli, A. Gene Deletion by Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis. MBio. 7 (1), 01817 (2016).
- Rosario, C. J., Tan, M. The early gene product EUO is a transcriptional repressor that selectively regulates promoters of Chlamydia late genes. Mol Microbiol. 84 (6), 1097-1107 (2012).
- Brickman, T., Barry, C., Hackstadt, T. Molecular cloning and expression of hctB encoding a strain-variant chlamydial histone-like protein with DNA-binding activity. Journal of Bacteriology. 175 (14), 4274-4281 (1993).
- Omsland, A., Sager, J., Nair, V., Sturdevant, D., Hackstadt, T. Developmental stage-specific metabolic and transcriptional activity of Chlamydia trachomatis in an axenic medium. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 109 (48), 19781-19785 (2012).
- Su, H., et al. A recombinant Chlamydia trachomatis major outer membrane protein binds to heparan sulfate receptors on epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 93 (20), 11143-11148 (1996).
- Edelstein, A., et al. Computer control of microscopes using µManager. Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Plotly Technologies Inc. . Collaborative data science. , (2015).
- Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nature Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
- Shcherbo, D., et al. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochemical Journal. 418 (3), 567-574 (2009).
- Sega, G. A review of the genetic effects of ethyl methanesulfonate. Mutation Research. 134 (2-3), 113-142 (1984).
- Ferguson, L., Denny, W. Frameshift mutagenesis by acridines and other reversibly binding DNA ligands. Mutagenesis. 5 (6), 529-540 (1990).
