위장암에서 DNA 메틸화의 게놈 전체 분석

그 에 따른 모든 절차는 기관의 인간 연구 윤리위원회의 윤리 기준에 따라 진행되었습니다. 이 연구는 준텐도 대학 시즈오카 병원의 기관 검토 위원회의 승인을 받았으며, 회고적 설계로 인해 서면 동의가 면제되었습니다. 1. 슬라이드 세척 스테인드 포머린 고정 파라핀 임베디드(FFPE) 섹션의 10 μm을 준비합니다. 슬라이드를 유리 슬라이드 홀더에 배치: 조직이 최소화되지 않는 한 약 3-5개의 가장 큰 단면 슬라이드를 사용하고 더 많은 슬라이드가 필요하지 않습니다. 슬라이드 홀더에 자일렌을 채우고 슬라이드의 모든 조직이 침수되었는지 확인합니다. 15분 동안 앉습니다. 15분 후, 슬라이드가 떨어지지 않도록 피펫 팁으로 슬라이드를 들고 자일렌을 부수십시오. 이전과 같은 수준으로 더 많은 자일렌을 붓습니다. 15분 동안 앉습니다. 15분 후, 다시 자일렌을 붓습니다. 슬라이드 홀더를 100% 에탄올(EtOH)으로 채우고 슬라이드의 모든 조직이 완전히 침수되었는지 확인합니다. 3 분 동안 앉도록 허용하십시오. 조심스럽게 슬라이드를 들고있는 동안 EtOH를 부어. EtOH를 더 많이 사용하여 동일한 수준으로 리필하십시오. 2 분 동안 앉습니다. EtOH를 다시 붓고 슬라이드를 제거합니다. 조심스럽게 깨끗한 종이 타월에 얼굴을 올려 놓고 건조시다. 10 분 동안 앉습니다. 2. 슬라이드 를 긁어 650mL의 디틸피로카보네이트(DEPC)-처리수, 에틸렌디아미네트라아세아제산 100mL(EDTA), 트리스 염산염 50ml(Tris-HCL) 2M pH 8.8, 200mL의 100mL(100mL)의 소화/용액 완충제를 준비한다. 소화/용해 버퍼 의 80 μL1.5 mL 일회용 폴리 프로필렌 튜브를 채웁니다 (재료의 표참조). 버퍼에 깨끗한 파이펫 팁을 넣습니다. 적절한 H&E 염색 섹션에 따라 거시 절제술에 가장 적합한 종양 영역의 암 조직을 식별합니다.참고: 거시절제술을 위한 종양 지역은 바람직하게는 2명의 자격을 갖춘 병리학자에 의해 확인되어야 합니다. 표시된 H&E 염색 단면을 기반으로 한 거시적 암 조직. 깨끗한 면도날을 가지고 부드럽게 슬라이드에서 암 조직을 긁어, 그것은 쉽게 작업 할 수 있도록 한 조각으로 유지하려고. 파이펫 팁을 버퍼를 함유한 일회용 폴리프로필렌 튜브에서 꺼내 폐기된 조직을 완충 유리병으로 옮기는 데 사용합니다(재료표참조).참고 : 젖은 팁은 조직을 유치해야하므로 전달이 더 쉬워집니다. 슬라이드의 나머지 부분과 함께 2.5 단계를 반복합니다. 모든 조직이 일회용 폴리 프로필렌 튜브에 있는 후에, 조직이 완전히 잠기고 관의 벽에 붙어 있지 않다는 것을 확인하기 위하여 팁을 이용하십시오. 바이알에 서브틸리신 관련 세린 프로테아제 20 μL을 넣고 부드럽게 섞어 주세요(재료표참조). 바이알을 55°C 의 열 블록에 적어도 4시간 또는 하룻밤 동안 놓습니다. 2 시간 후에 약간 소용돌이해야합니다. 3. 비설피테 트리트먼트 소화된 조직 용액의 45 μL을 샘플로 사용하십시오. 제조업체의 지침에 따라 양황피 변환 키트에서 시약을 사용하여 비설피트 처리를 수행하십시오(재료표참조). DNA 샘플에 희석 버퍼 5μL을 추가하고 37°C에서 15분 동안 배양합니다(재료 표참조). 시료가 배양하는 동안, DH2O의 750 μL 및 210 μL의 희석 버퍼를 CT 변환 시약의 한 튜브에 추가하여 양성환 변환 시약을 준비합니다(재료표참조). 10 분 동안 소용돌이에 의해 튜브를 혼합. 15분 인큐베이션 후, 준비된 CT 변환 시약의 100 μL을 각 샘플에 넣고 반전으로 섞는다. 12 ~16h동안 50°C에서 어둠 속에서 샘플을 배양한다. 인큐베이션 후 샘플을 제거하고 얼음 위에 10분 동안 놓습니다. 바인딩 버퍼400 μL을 추가하고 위아래로 파이프팅하여 각 샘플을 혼합합니다(재료 표참조). 각 샘플을 스핀 컬럼에 로드하고 컬럼을 2mL 수집 튜브에 넣습니다(재료 표참조). 원심분리기는 각 샘플을 최고 속도(10,000 x g)로1분 동안 제거하고 유동을 폐기합니다. 각 열에 200 μL의 워시 버퍼를 추가하고 최대 속도로 1분 동안 회전하여 유동을 버립니다(재료 표참조). 각 열에 200 μL의 절황 버퍼를 추가하고 기둥이 실온에서 15분 동안 서 있도록 합니다(재료 표참조). 인큐베이션 후, 1 분 동안 최고 속도로 열을 회전하고 흐름을 폐기합니다. 각 열에 200 μL의 워시 버퍼를 추가하고 1 분 동안 최고 속도로 회전합니다 (재료 표참조). 이 단계를 한 번 더 반복합니다. 각 컬럼에 dH2O의 46 μL을 추가하고 각 컬럼을 새로운 멸균 1.5mL 일회용 폴리프로필렌 튜브에 넣습니다(재료 표참조). 각 튜브를 2분 동안 회전하여 DNA를 엘로우시합니다. 일회용 폴리프로필렌 튜브에서 각 스핀 컬럼을 제거하고 폐기합니다(재료 표참조). DNA는 지금 분석을 위한 준비가 되었습니다. 4. 인간 게놈의 CpG 궤적에서 DNA 메틸화 평가를 위한 어레이 플랫폼 제조업체의 지침에 따라 후속 데이터 분석이 수행됨을 통해 실시간 PCR 증폭 및 검출 기기에서 FFPE QC 분석을 사용하여 DNA(품질 검사: QC)의 품질을 평가합니다(재료 표참조).참고: 권장 5.0보다 ∆Cq 값이 적은 샘플은14로추가 처리됩니다. DNA 메틸화의 복잡한 평가를 위한 어레이 플랫폼으로 샘플을 분석하여 게놈내의 >450,000 CpG 부위의 메틸화 상태를 평가합니다(재료표참조). 어레이 플랫폼용 제품 정보 시트, 데이터 시트 및 제품 파일은15를사용할 수 있습니다.참고 : 분석은 FFPE 재료(14)에대한 제조업체의 지침에 따라 수행됩니다. 배열 플랫폼에 대한 데이터 분석 도구에서 높고 낮은 메틸화를 각각 0에서 1까지의 범위로 β 값으로 계산합니다(재료 표참조). 시판되는 소프트웨어(재료 표참조)를 사용하여 β 값을 계산합니다. R 소프트웨어 환경(R v.2.15.1)으로 DNA 메틸화 플랫폼의 복잡한 평가를 위해 어레이 플랫폼에서 생성된 데이터를 가져오고 메틸화어레이(16,17)를분석하기 위한 도구를 사용하여 처리한다.참고: 데이터 분석 도구를 사용하여 생성된 히트맵에서 열은 감독되지 않은 클러스터링에 의해 정렬되는 반면 행 순서는 위에서 아래로 차분 메틸화에 대한 t 통계의 중요성을 감소시키는 것입니다. 히트맵을 감독되지 않은 클러스터링의 첫 번째 분화기로 높고 낮은 메틸화 그룹으로 나눕니다.참고: 정량메틸화 특이PCR(qMSP)을 사용하여 유효성 검사를 위해, 프로모터 지역의 CpG 제도와 관련하여 더 큰 β 가치에 기초하여 유전자를 선택하고 qMSP에 대한 프라이머 및 프로브 설계에 대한 적합성으로 인해 유전자를 선택합니다. 5. 정량적 메틸화-특정 PCR(qMSP) 각 유전자 분석에서 프로모터 영역의 메틸화를 평가하기 위해 qMSP에서 형광 계 실시간 PCR을 위한 템플릿으로서 3.3 단계에서 비설피테 변형 DNA를 사용한다. 96웰 의 실시간 PCR 계측기를 사용하여 qMSP를 수행하십시오(재료 표참조). 200nM 포워드 프라이머, 200nM 역프라이머 및 80nM 프로브를 사용하여 양성환 변형 DNA에 대한 표적 유전자의 프로모터 메틸화 상태를 확인한다. 마스터 믹스는 16.6 mM (NH4)2SO4,67 mM Tris pH 8.8, 10 mM β-메르카토에탄올, 10 nM 플루오레세인, 0.166 mM각 데옥시뉴타이드 트리포산염, 및 0.04 U/μl의 중합체 DNA(표 참조)로 마스터 믹스를 준비한다. 모든 에세이에 대한 각 음의 최종 반응 부피는 25 μL입니다. qMSP의 사이클링을 5분 동안 95°C, 15초 동안 95°C, 1분 동안 60°C, 72°C로 1분 동안 실시합니다.참고: 표적 유전자는 더 큰 베타 값을 갖는 기준에 따라 선택되어야 하며, 프로모터 지역의 CpG 섬과 관련이 있으며, qMSP를 위한 프라이머 및 프로브 설계에 적합해야 합니다. CpG 메틸라제(M.SssI)로 처리된 인간 게놈을 양성 메틸화 제어로 사용합니다(재료표참조).참고: 메틸화의 최종 정량화는 상대 메틸화 값(RMV)으로 정의되고, 각 메틸화 검출 복제에 대해2-ΔΔCt로 계산되며, β-Actin(ACTB)18에대한 평균 Ct에 비해 복제된다. 프라이머 및 프로브 시퀀스는 표 1에표시됩니다. 100의 Ct는 탐지되지 않은 복제에 사용되며, 값은 2-ΔΔCt의 값을 0에 가깝게 제공합니다. 다음 수식은 사용됩니다: 평균 2-ΔΔCt (RMV) = =(2–ΔΔ Ct_replicate_1 + 2-ΔΔ Ct_replicate_2 + 2–ΔΔ Ct_replicate_3)/318.