胃肠癌DNA甲基化基因组全谱分析

所遵循的所有程序都符合各机构的人类研究伦理委员会的道德标准。这项研究得到了日本大学静冈医院的机构审查委员会的批准，由于回顾性设计，放弃了书面知情同意。 1. 清洗幻灯片 准备 10 μm 未沾污的固定石蜡嵌入 （FFPE） 部分。 将幻灯片放在玻璃幻灯片架中：使用大约 3~5 个最大的横截面滑梯，除非组织最小，并且需要更多的幻灯片。 用二甲苯填充滑轨架，并确保幻灯片上的所有组织都被淹没。允许坐15分钟。 15 分钟后，用带移液器尖端的滑轨将二甲苯倒出，这样幻灯片不会脱落。 将更多的二甲苯倒入与之前相同的水平。允许再坐15分钟。 15分钟后，再次倒出二甲苯。 用 100% 乙醇 （EtOH） 填充滑轨支架，并确保幻灯片上的所有组织全部浸没。允许坐 3 分钟。 小心地握住幻灯片，然后倒掉 EtOH。使用更多 EtOH 重新填充到同一级别。允许坐2分钟。 再次向下倒 EtOH 并拆下幻灯片。小心地把它们放在干净的纸巾上晾干。允许坐10分钟。 2. 刮擦幻灯片 用 650 mL 二乙酰碳酸酯 （DEPC） 处理水、100 mL 乙酰胺乙酸 （EDTA）、50 ml 三氧化三酸 （Tris-HCL） 2 M pH 8.8 和 200 mL 10% 多基硫酸钠 （SDS）（参见材料表） 来准备消化/裂解 缓冲液。 用 80 μL 消化/解氧缓冲液填充 1.5 mL 一用聚丙烯管（ 参见材料表）。 将干净的移液器尖端放入缓冲器中。 根据适当的H&E染色部分，确定最适合大切除的肿瘤区域的癌症组织。注：大手术的肿瘤区域最好由两名合格的病理学家确定。 基于标记的 H&E 染色部分的宏观肿瘤组织。 拿一把干净的剃须刀刀片，轻轻地刮掉幻灯片上癌组织，尽量把它留在一块，以便更容易使用。 将移液器尖端从一用聚丙烯管中拿出，并用它来将废组织转移到缓冲瓶中（ 参见材料表）。注：湿尖端应吸引组织，这使得转移更容易。 对幻灯片的其余部分重复步骤 2.5。 所有组织都在一用聚丙烯管中后，使用尖端确保组织完全浸没，不会粘在管壁上。 将20μL的亚蒂林相关丝氨酸蛋白酶添加到小瓶中，轻轻轻拂混合（ 参见材料表）。 将小瓶放在 55 °C 热块中至少 4 小时或过夜。确保2小时后稍微涡旋。 3. 双硫化治疗 使用消化组织溶液的45μL作为样品。 根据制造商的说明，使用双硫酸盐转化套件中的试剂进行双硫酸盐处理（ 参见材料表）。 将 5 μL 稀释缓冲液加入 DNA 样品，在 37 °C 下孵育 15 分钟（ 参见材料表）。 当样品孵育时，通过将750μL的dH2O和210μL的稀释缓冲液添加到CT转化试剂的一管中（参见材料表）来制备双硫基转化 试剂。通过涡旋混合管10分钟。 孵育15分钟后，将100μL的制备CT转化试剂加入到每个样品中，然后通过反转混合。 在黑暗中孵育样品在50°C下12至16小时。 孵育后，取出样品，放在冰上10分钟。 添加 400 μL 的装订缓冲液，通过上下移液混合每个样品（ 参见材料表）。将每个样品装入旋转柱，然后将柱放入 2 mL 收集管中（ 参见材料表）。 全速（10，000 x g）将每个样品离心1分钟，然后丢弃流经。 将 200 μL 的洗涤缓冲液添加到每列中，以全速旋转 1 分钟，丢弃流式处理（ 参见材料表）。 向每列添加 200 μL 脱硫缓冲液，使柱在室温下站立 15 分钟（ 参见材料表）。孵育后，全速旋转柱 1 分钟，然后丢弃流经。 将 200 μL 的洗涤缓冲液添加到每列中，以全速旋转 1 分钟（ 参见材料表）。 重复此步骤一次。 将 46 μL 的 dH2O 添加到每根柱中，并将每根柱放在新的无菌 1.5 mL 一用聚丙烯管 中（参见材料表）。旋转每个管2分钟，以脱氧核糖核酸。 从一用聚丙烯管中取下每个旋转柱并丢弃（ 参见材料表）。DNA现在已准备好进行分析。 4. 人类基因组中CPG位点DNA甲基化评估阵列平台 使用实时 PCR 扩增和检测仪器的 FFPE QC 检测评估 DNA 质量（质量检查：QC），然后根据制造商的说明进行后续数据分析（ 参见材料表）。注：如果∆Cq值小于建议的5.0，将进一步处理14。 使用阵列平台分析样品，以对DNA甲基化进行复杂评估，以评估基因组中+gt;450，000CpG位点的甲基化状态（ 参见材料表）。阵列平台的产品信息表、数据表和产品文件有 15。注：测定是按照制造商对FFPE材料14的说明进行的。 在阵列平台的数据分析工具中计算高位和低位甲基化β值，范围分别从 0 到 1（ 参见材料表）。使用市售软件 （参见材料表）计算β值。 将阵列平台上生成的数据导入R软件环境（R v.2.15.1），并使用分析甲基化阵列16、17的工具进行处理。注：在使用数据分析工具生成的热图上，列按无监督聚类排序，而行的顺序则基于从上到下差分甲基化 t 统计的递减显著性。 使用无人监督聚类中的第一个分集器将热图分为高和低甲基化组。注：对于定量甲基化特异性PCR（qMSP）的验证，选择基于启动子区域中CPG岛较大的β值的基因，并由于其适合qMSP的底注和探针设计。 5. 定量甲基化特异性PCR（qMSP） 使用步骤3.3中的双硫化物修饰DNA作为qMSP中基于荧光的实时PCR的模板，以评估每个基因分析中启动子区域的甲基化。 使用 96 井实时 PCR 仪器执行 qMSP（ 参见材料表）。 使用200 nM正向底向、200 nM反向底土和80 nM探针检查双硫化基因修饰DNA上靶子基因的启动子甲基化状态。使用 16.6 mM （NH4）2SO4 、67mM Tris pH 8.8， 准备主混合， 10 mM β-甲醇，10 nM 荧光素，每脱氧核苷酸三磷酸 0.166 mM，DNA聚合酶 0.04 U/μl（参见材料表）。所有测定的每个井的最终反应量为25μL。 执行 qMSP 的循环时间如下：95 °C 5 分钟，然后 55 个循环 95 °C 15 s，60°C 循环 1 分钟，72°C 循环 1 分钟。注：目标基因应基于具有较大β值、与启动子区域中的CpG岛屿相关以及适合qMSP的底注和探针设计的标准进行选择。 使用用CpG甲基酶（M.SSSI）处理的人类基因组作为正甲基化控制（ 参见材料表）。注：甲基化的最终定量定义为相对甲基化值（RMV），并计算为每个甲基化检测复制的2μCt，与β-Actin（ACTB）18的均数Ct相比。底图和探针序列显示在表1 中。Ct 为 100 用于未检测到的复制，该复制的值为 2μCt，接近于零。使用以下公式：均值 2[Ct] （RMV） = （2 =Ct_replicate_1 = 2====Ct_replicate_2============Ct_replicate_3=========================================================================================================================================