그노토바이오틱 아메리칸 바퀴벌레설립 및 유지보수(페리플라나 아메리카나)

1. 재료 의 준비 재고 바퀴벌레 문화의 유지 보수참고 : 이러한 강력한 곤충을 양육하는 방법은 여러 가지가 있습니다. 대피소와 물을 제공하는 세부 사항은 접근 가능한 재료 (즉, 골판지 튜브 대신 계란 상자)에 따라 다를 수 있습니다. 다음 멸균 프로토콜은 모든 스톡 탱크 설정에 대해 작동합니다. 37.85 L (10 갤런) 어조에 충분한 우드 칩 침구를 펼쳐 약 1 인치의 침구로 탱크의 바닥을 덮습니다. 조각에 x 4에 2로 (플랫) 골판지를 절단하여 하우징을 준비합니다. 골판지 튜브(예: 화장지 튜브)에 골판지 조각을 삽입하고 탱크의 한쪽 끝에 튜브를 쌓습니다(도1). 곤충 탈출을 방지하기 위해 탱크 내부의 상단 2 인치에 석유 젤리의 얇은 층을 얼룩.참고: 탱크 모서리 안쪽을 제대로 코팅하십시오. 이전 스톡 탱크에서 골판지 튜브를 옮기고 주민을 풀어주며 바퀴벌레를 넣습니다. 각 전송에 대해, 이동 100-200 혼합 연령, 혼합 섹스 바퀴벌레. 개 사료 (20-30 개)를 추가하고 탱크에서 개 사료의 양을 모니터링하고 낮을 때 리필하십시오. 물 접시를 설정합니다. 작은 플라스틱 재사용 가능한 식품 용기를 이중 증류수(ddH2O)로 채웁니다. 셀룰로오스 스폰지와 식품 용기 뚜껑의 구멍을 거의 동일한 크기로 자른다.참고: 셀룰로오스 스폰지는 바퀴벌레가 물 접시에 익사하는 것을 방지합니다. 뚜껑의 구멍에 스폰지를 삽입하고 채워진 용기에 뚜껑을 놓습니다. 용기를 탱크에 넣고 낮을 때 리필합니다. 면 천으로 탱크를 덮고 탄성 밴드로 제자리에 고정하십시오. 탱크가 과도한 양의 frass와 곤충 시체를 축적하기 시작하면 새로운 탱크를 설치하고 바퀴벌레를 옮기게됩니다.참고: 탱크는 일반적으로 6개월마다 전송됩니다. 폐기된 스톡 탱크에 남아 있는 모든 바퀴벌레/계란은 -20°C에서 1h로 동결하여 안락사되고, 스톡 탱크의 내용물들은 폐기 전에 오토클레이브 백과 오토클레이브(1h, 중력 주기)로 옮겨져 있습니다. 스톡 탱크는 사용 사이에 2 %의 표백제로 살균됩니다. 보조 컨테이너를 소독합니다.참고: 이 컨테이너에는 필터가 포함되어 있지 않지만 대신 무료 공기 교환을 허용합니다. 뚜껑과 바닥 의 안쪽을 2 % 표백제로 스프레이하고 10 분 동안 담가 두십시오. 깨끗한 종이 타월로 표백제닦아냅니다. 뚜껑 안쪽과 바닥에 70%에탄올을 뿌린 후 깨끗한 종이 타월로 닦아냅니다. 사용이 될 때까지 뚜껑을 교체하십시오. 계란과 주택 님프를 배양BHI 경사와 플라스크를 확인합니다. 패키지 지침에 따라 BHI를 준비하여 2%의 한천을 추가합니다. BHI-agar 용액을 명확히 할 때까지 끓입니다. 경사의 경우 5mL 알리코를 18mm x 150mm 유리 테스트 튜브 및 캡으로 옮기습니다. 오토클레이브를 통해 살균(멸균 시간 = 20분, 액체 사이클). 자동 식튜브를 45° 각도로 배치하여 경사로 식힙니다. 일단 고화되면, 건조를 방지하기 위해 사용할 때까지 냉장. 플라스크의 경우 삶은 BHI-agar 용액10mL 알리쿼트를 250mL 에렌마이어 플라스크로 전송하여 플라스크 바닥을 완전히 덮습니다. 플라스크를 호일로 덮고 오토클레이브(20분, 액체 주기)를 통해 살균합니다. 자동 플라스크가 건조를 방지하기 위해 사용할 때까지 냉각하고 냉장 보관할 수 있도록 합니다.참고: 이 설정에는 공기 필터가 필요하지 않습니다. 호일 커버는 오염이 대기 흐름에서 발생하는 것을 방지하면서 가스 교환을 허용하기에 충분합니다. 오토클레이브를 통해 살균: 호일 덮인 비커(살균 시간 = 1h, 중력 주기)에서 반크기(~1/2인치 조각)로 부서진 자동 암쥐 차우, 뚜껑에 담긴 ddH2O(멸균 시간 = 20분, 액체 사이클), 포일 덮인 비커(살균 시간 = 20분, 액체 주기), 포일 덮인 비커(살균 시간 = 20분, 액체 주기) 및 포일 덮인 비커(살균 시간 = 20분, 비커)의 포셉(멸균 시간 = 20분)참고 : 쥐 차우 비커를 과도하게 채우지 마십시오. 펠릿은 오토클레이브에서 팽창할 것입니다. “출산 병동” 탱크를 설치합니다.참고 :이 탱크는 스톡 탱크 (골판지 튜브, 스폰지, 개 사료, 우드 칩 침구가있는 물 접시, 그림 1참조)와 동일한 재료를 포함하고 있으며 oothecae 컬렉션으로 전송되지 않는 한 바퀴벌레가 비어 있어야합니다 (섹션 2 참조). 과포화 나트륨 염화나트륨(NaCl) 용액으로 가득 찬 비커를 준비하여 인큐베이터를 가습합니다. ddH2O의 100mL당 37g의 NaCl을 추가하고 용해 될 때까지 저어서이 솔루션을 준비하십시오.참고: 일반적으로 포화 염용액 500mL는 일반적으로 챔버 치수 51cm x 46cm x 46cm(H x W x D)로 인큐베이터를 가습한 후 약 한 달 동안 더 많은 물을 첨가해야 합니다. 2. 오테카에 컬렉션 스모크 탱크에서 “출산 병동”으로 오테카(그림2)를운반하는 여성을 이송하여 중력여성을 포함하는 골판지 튜브를 이동시합니다. 카보드 튜브에 중력 여성 이외에 여러 곤충이 포함되어 있는 경우 먼저 튜브를 석유 젤리로 고리로 울리는 추가 플라스틱 용기에 넣고 대상 곤충이 골판지 튜브로 다시 올라가도록 장려합니다. 암컷을 스톡 탱크로 옮기면 오테카에 떨어뜨리면 다시 스톡 탱크로 옮깁니다. 집게로 탱크의 쓰레기에서 오테카를 검색합니다.참고 : 오테카에는 종종 전송되는 여성의 24 시간 이내에 삭제됩니다. 3. 오테카에 청소 도데딜 황산나트륨(SDS)의 3mL를 함유한 5mL 원심분리기 튜브에 oothecae를 추가합니다. 10 초 용 소용돌이. 신선한 SDS가 들어있는 원심분리기 튜브로 두 번째 세척 단계를 반복하십시오.참고: SDS 3mL당 최대 5개의 오테카에사용할 수 있습니다. 섬세한 작업 닦아, 부드럽게 파편을 제거하기 위해 각 ootheca의 표면을 문질러. 철저한 청소를 돕기 위해 더 많은 SDS가 추가될 수 있습니다. 세척된 오스테카를 계량 보트에 놓고 멸균이 준비될 때까지 청소하십시오.참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지될 수 있지만, 습도가 낮은 환경에서 장시간(며칠에서 몇 주) 동안 오테카를 방치하면 탈수되고 생존력을 잃게 됩니다. 4. 옴테카의 살균 및 인큐베이션 살균 후 헹구기 위한 알리쿼트 멸균 물. 모든 ootheca를 살균하려면 멸균 수의 1mL로 두 개의 1.5mL 원심분리기 튜브를 채웁니다. 농축 된 10 μL 추가 (32%) 멸혈산 재고 용액은 5mL 원심분리기 튜브에서 ddH 2 O의3.2mL로 용액하여 멸균을 위한 0.1% 용액을 생성한다. 뚜껑을 두어 여러 번 반전하여 혼합합니다.주의: 과자산은 피부 나 폐와 접촉하는 데 유해합니다. 연기 후드에 희석.참고: 이 작업은 살균과 같은 날 수행해야 합니다. 사전에 희석되면 용액이 신속하게 분해되어 제대로 살균되지 않습니다. 5개의 세척된 oothecae는 희석산의 3.2mL에서 살균될 수 있다. 5 분 동안 0.1 % peracetic 산 용액에 코테카 (최대 5)를 청소하십시오. 튜브를 60s마다 여러 번 반전시면 됩니다. 라미나르 플로우 후드에서 멸균 포셉을 사용하여 각 ootheca를 알리인용 멸균 헹구기 물(4.1단계)으로 자체 원심분리기 튜브로 이송합니다. 혼합하려면 여러 번 반전하십시오. 두 번째 헹구기를 반복한 다음 헹구는 각 ootheca를 멸균 집게를 사용하여 자체 BHI 경사로 옮깁니다. 멸균 된 보조 용기에 경사를 놓습니다. 부화 될 때까지 4-5 주 동안 30 °C에서 가습 된 인큐베이터로 용기를 이동합니다.참고: 경사는 작은 시험관 랙 또는 중간/소형 비커에 의해 똑바로 유지될 수 있습니다. 정기적으로 경사를 확인하십시오 (주당 1-2 배). 곰팡이 또는 세균성 식민지 성장이 한천에 나타나면 오염 된 경사를 제거하십시오. 4주 간의 타임포인트가 다가오면 매일 경사를 확인합니다.참고 : 일단 부화되면, 님프는 BHI혼자에서 최대 몇 주 동안 살아남을 수 있지만 최적으로 성장하지 는 않습니다. 5. 그노토바이오틱 님프의 유지 보수 라미나르 플로우 후드에서 멸균 된 쥐 차우의 펠릿을 멸균 집게로 준비 된 BHI 플라스크 (1.3.3 단계에서)로 무균적으로 전달합니다. 멸균 검사로서 플라스크를 24시간 동안 30°C 인큐베이터에 넣고, 성장이 나타나면 사용하지 않는다. 멸균 식품 펠릿으로 BHI 플라스크에 님프를 추가합니다. BHI 경사에서 그들을 흔들어 그들이 라미나르 흐름 후드에 플라스크에 빠지게.참고 : 님프는 테스트 튜브의 유리 벽에 견인이 없습니다. 튜브를 흔들어 경사에서 그들을 노크 한 다음 플라스크에 유리아래로 밀어 수 있도록 튜브를 팁 효과가 있습니다. 님프는 집게를 사용하여 옮길 수 있지만 치명적인 부상의 위험이 높습니다. 플라스크의 BHI 바닥에 직접 파이프를 하여 라미나르 흐름 후드에서 일주일에 한 번 300 μL의 멸균 수를 가진 물 님프. nymph 대변이 BHI 바닥을 커버하기 시작하면 새로운 BHI 플라스크로 옮기고, 5.1 단계에서와 같이 살균 된 쥐 차우 24 h를 사전에 추가합니다 (멸균을 확인하기 위해). 6. 멸균의 품질 관리 제한 단편 길이 다형성(RFLP)을 통해 gnotobiotic 상태의 배양 독립적 품질 관리 검사를 위해 BHI 플라스크에서 하나의 nymph를 제거합니다. 이렇게하려면, 멸균 원심분리기 튜브에 님프를 부어 (단계 에서 님프 전달과 유사 5.1) 플라스크에 멸균 나무 어플리케이터를 배치하고 님프가 등반을 시작하기를 기다린 다음 원심분리튜브로 전송합니다. 원심분리기 튜브의 님프에 1x 인산염 완충식식염식염수(PBS)의 0.5mL를 추가하고 모든 큰 조각이 파손될 때까지 멸균 마이크로페일로 균질화합니다. 소용돌이 잘. 세균 DNA 추출키트(재료표)를이용하여 님프 균질화로부터 DNA를 추출합니다. 원심분리기는 5,000 x g에서 10분 동안 균질화된 님프를 원심분리하고 상체를 제거합니다. 열 셰이커를 37°C로 예열합니다. 1x Tris-EDTA의 100 μL을 추가하고 소용돌이를 추가하여 펠릿을 완전히 다시 보펜합니다. 리소지메10μL을 넣고 섞은 다음, 예열된 37°C 열 셰이커에서 30분(흔들림 없음) 인큐베이션을 넣습니다. 25 mg의 유리 구슬을 샘플에 넣고 최대 속도로 5분 동안 소용돌이를 추가합니다. 열 셰이커를 55°C로 예열합니다. 비드가 100μL의 단백질제 K 버퍼와 20 μL의 단백질제 K. 소용돌이가 완전히 섞인 새로운 1.5mL 원심분리기 튜브로 체전하기 전에 정착하도록 허용하십시오. 600 rpm에서 흔들리는 인큐베이션은 60 분 동안 55 °C 열 셰이커로 흔들어줍니다. 원심분리기는 10,000 x g에서 2분 동안, 새로운 1.5mL 원심분리기 튜브로 상류체를 전송합니다. 열 셰이커를 65°C로 예열합니다. 65°C 혼성화 오븐에서 용출 버퍼를 예열하기 시작합니다. 100% 에탄올의 220 μL을 추가합니다. 20 초 최대 속도로 소용돌이. 10배 위아래로 피펫팅하여 눈에 보이는 침전을 분해합니다. DNA 컬럼을 2mL 수집 튜브에 삽입하고, 형성되었을 수 있는 침전을 포함하여 샘플을 컬럼으로 옮기다. 원심분리기는 1분 동안 10,000 x g의 원심분리기를 1분 동안, 수집 튜브에서 여과물을 버리고 수집 튜브를 교체합니다. 열에 바인딩 버퍼 500 μL을 추가하고 원심분리기를 1분 동안 10,000 x g로 추가합니다. 수집 튜브에서 여과물을 버리고 수집 튜브를 교체합니다. DNA 세척 버퍼 700μL을 컬럼에 넣고 원심분리기를 1분 동안 10,000 x g에 추가합니다. 수집 튜브에서 여과물을 버리고 수집 튜브를 교체합니다. 두 번째 세척 단계를 위해 반복합니다. 원심분리기 빈 기둥은 2분 동안 빈 열을 건조하고, 그 후 새로운 1.5mL 원심분리기 튜브로 컬럼을 전송합니다. DNA 컬럼 매트릭스에 직접 예열된 용출 버퍼 50 μL을 추가하고 65°C에서 5분 동안 배양합니다. 원심분리기 10,000 x g에서 1분 동안 엘ute. 분광광법 또는 불소법을 통해 여과에서 추출된 DNA를 정량화한다. 전체 16S 유전자를 증폭하고 소화합니다. 젤 전기 전광을 사용하여 조각을 시각화합니다. 2배 마스터 믹스의 12.5 μL, 각 프라이머 1492R의 0.5 μL(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT) 및 27F(5′-AGAGTGATCCTGGCTCAGG), DNA 5ng 및 분자등급 물을 사용하여 총 반응부 25μL을 사용하십시오. 다음 열순환기 프로그램 실행: 60s에 대한 94°C; 30s용 94°C의 35사이클, 45s용 50°C, 90s용 68°C; 그 다음에는 68°C가 5분 동안. DNA 정제키트(재료표)를사용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR) 제품을 정화합니다. PCR 제품 및 소용돌이에 120 μL의 정화 버퍼를 추가하여 혼합합니다. 뚜껑 안쪽에 물방울을 모으기 위해 간략하게 원심분리기. DNA 컬럼을 2mL 수집 튜브에 삽입하고, 1분 동안 ≥13,000 x g에서 준비된 컬럼및 원심분리기로 액체를 전달한다. 여과를 버리고 수집 튜브를 교체합니다. DNA 세척 버퍼 와 원심분리기 700 μL을 ≥13,000 x g에서 1분 간 추가합니다. 여과를 버리고 수집 튜브를 교체합니다. 두 번째 세척 단계를 위해 반복합니다. 빈 열을 2분 동안 원심분리하여 컬럼을 건조시키고 새로운 1.5mL 원심분리기 튜브로 옮김합니다. DNA 컬럼 매트릭스에 직접 예열된 용출 버퍼 50 μL을 추가하고 실온에서 2분 동안 배양합니다. 원심분리기 10,000 x g에서 1분 동안 엘ute. 분광광법 또는 불소법을 통해 필로테산에서 추출된 DNA를 정량화한다. 소화 완충제 5μL, 10단위 RsaI, 분자등급 물에 1μg을 추가하여 총 반응량 50 μL. 혼합하여 37°C에서 37°C로 배양하고 60분 동안 배양한다. 2% 아가로즈 젤에 소화된 DNA의 20 μL을 실행하여 젤 전기전경을 통해 소화된 제품을 분리합니다. 젤을 시각화하여 유노바이오틱 상태를 확인합니다.참고: 노토바이오틱 곤충은 내시빅비엔트, 블랫타박테리움의16S rDNA 서열을 기준으로 402bp, 201bp, 163~148bp의 대역만 발생한다. 젤에서 볼 수있는 여분의 밴드는 미생물 종을 오염시키는 것을 나타냅니다. 7. 님팔 성장의 무균 추적 플라스크의 반투명 BHI 바닥을 통해 곤충을 측정하여 몸의 성장을 추적하기 위해 몸 길이를 기록합니다.참고: 님프는 움직임을 느리게 하기 위해 15분 동안 4°C에 배치되어 측정하기가 더 쉬워집니다.