해마의 생체 내 해부학 및 기능적 추적
Summary
현재 프로토콜은 해마에 복부 테진 영역 (VTA) 글루타민트 프로젝션을 추적하기위한 간단한 방법을 보여줍니다. VTA 글루타민트 뉴런의 사진 자극은 VTA 글루타민단 단자가 생체 내에서 CA1 퍼티티 피라미드 발사 속도를 조절하는 방법을 보여주기 위해 CA1 레코딩과 결합되었습니다.
Abstract
두뇌에 있는 신경 하위 인구의 Optogenetic 변조는 연구원이 생체 내및 ex vivo에 있는 신경 회로를 해부하는 것을 허용했습니다. 이것은 신경 회로 내의 신경 모형의 역할 및 학습에 상대적인 정보 인코딩에 있는 그들의 중요성을 결정하기 위한 전제를 제공합니다. 마찬가지로, 이 방법은 깨어 있는 동물및 마취동물에서 두 개 이상의 연결된 뇌 영역의 생리적 중요성을 테스트하는 데 사용될 수 있다. 현재 연구는 VTA 글루타민트 뉴런이 마취 된 마우스의 CA1 (해마)에서 푸티피라미드 뉴런의 발사 속도를 조절하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 해마층의 VTA 전시냅스 글루타메이트 단자 추적을 위해 VTA 글루타민트 뉴런의 아데노 관련 바이러스(AAV)의존 라벨을 사용합니다. VTA 글루타민트 말미제 말단의 전방 추적을 허용한 AAV 벡터에 의해 수용된 광 제어 옵신(channelrhodopsin; hChR2) 및 형광 단백질(eYFP)의 발현( VTA 글루타메이트 뉴런 세포 체체)의 사진 자극(VTA에서). 고임피던스 급성 실리콘 전극은 생체 내에서 VTA 사진 자극에 대한 다중 장치 및 단일 단위 응답을 검출하기 위해 CA1에 배치되었다. 이 연구의 결과는 해마 (CA1, CA3 및 DG)에 있는 전시냅스 VTA 글루타민단 단자의 층 의존분포를 보여줍니다. 또한, VTA 글루타민트 뉴런의 사진 자극은 생체 내에서 PUTative CA1 피라미드 단위의 발사 및 버스트 속도를 증가시켰습니다.
Introduction
지난 10년 동안, 뉴런형 변조의 특이성을 높이기 위해 다양한 유전도구가 개발되었으며, 복잡한 신경망1의매핑. 특히, 신경 세포에서 감염 하 고 복제 하는 고유 한 능력을 가진 신경 tropic 바이러스 는 표현 하거나 뉴런 하위 유형에 특정 단백질을 ablate 배포 되었습니다. 형광 단백질 또는 유전적으로 인코딩된 시냅스 활동 지표를 수용할 때, 전감염된 AAV 벡터 라벨및 뇌 영역2,3을통해 신경망을 묘사한다. AAV 구조에서 프로모터의 선택은 어느 정도의특이성(프로모터 의존식)을 가진 뉴런 유형에서 벡터의 발현을 지시한다. 그러나, Cre-lox 재조합을 통해, AAV 구문은 뉴런 라벨링4,5,6,7에대한 더 큰 특이성을 가지고 배포된다. 참고로, AAV 벡터에 포장된 광활성화 미생물 opsinsins 및 형광 단백질은 다양한 뉴런 아형8으로발현될 수 있으며, 이미징, 뉴런 형 회로 추적 및 광변조9,10에이상적입니다.
AAV는 뇌 영역(또는 핵)에 스테레오전술적으로 주입되어 소마, 원점 및 축축단 단자에서 리포터 단백질의 발현을 구동한다. AAV의 신경발현은 기자 유전자(eYFP)를 수용하는 것으로 다른 뇌 영역을 온팎으로 신경세포체및 해부학적 추적의 라벨링을 용이하게 한다11,12,13,14. AAV-eYFP는 빛 제어 옵신(예를 들어 hChR2)을 운반하는 구조물을 영상6,15 및 자극 기반의 생리학적 추적을 위한 도구로 전개하여 생체 내 뇌 영역을 표적으로 삼을 수 있다. AAV 혈청형에 따라, 뉴런 라벨링의 방향은11,12의역행 또는 역행일 수 있다. 이전 연구는 AAV5 뉴런에서 선행 여행 것을설립했다 12. 따라서, hChR2를 발현하는 세포 체의 사진 자극은 뇌의 다른 곳에서 미리 생성효과를 생성(표적)17.
여기서, CaMKIIα 프로모터를 사용한 AAV(혈청형 5)는 VTA 글루타민트 뉴런 및 축삭 프로젝션에서 eYFP(리포터) 및 hChR2(opsin)를 발현하는 데 사용되었다. 이 연구의 결과는 CA1, CA3 및 DG 해마 지역에서 VTA 글루타민제 전시냅스 말단의 층 의존 분포를 보여줍니다. 또한 VTA 글루타민트 뉴런의 사진 자극은 기준값과 비교할 때 생체 내에서 CA1 다중 유닛 및 단일 단위 발사 속도를 증가시켰습니다. 이 프로토콜은 신경 회로 추적 실험에서 얻은 데이터의 품질을 높일 수있는 저렴한 도구와 시판되는 소프트웨어를 사용합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
지난 10년 동안 AAV 구조의 설계가 크게 발전했습니다. 이와 같이, 더 많은 뉴런 특이성 프로모터는 향상된 형질 전환특이성(14)을위한 AAV 혈청형배열에 편입되었다. 형광 단백질, 수송기, 수용체 및 이온 채널을 위한 유전자를 결합함으로써, AAV의 도서관은 지금 화상 진찰, 신경 변조 및 시냅스 활동 검출을 위해 존재합니다. 시판되는 AAV-constructs에서, 유전적으로 인코딩된 형광소 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 OOM에 수여 CBS 브리징 그랜트에 의해 지원됩니다. OOM, PAA 및 AS는 연구를 설계하고 실험을 수행했습니다. AS와 PAA는 결과를 분석했습니다. OOM과 PAA는 원고를 준비했습니다. 우리는 우리의 사용에 대 한 AAV를 사용할 수 있도록 칼 디세로스 박사 (스탠포드 대학) 감사.
Materials
| 3% Hydrogen peroxide | Fisher chemical | H312 | |
| AAV-CaMKIIα-ChR2-eGYP | Addgene | Plasmid #26969 | |
| BNC cable | Amazon | ||
| BNC Splitter | Amazon | ||
| Ceramic Split Mating Sleeve for Ø1.25mm Ferrules. | Thorlabs | ADAL1-5 | |
| Drill | Dremel | LR 39098 | |
| Gelatin coated slides | Fisher scientific | OBSLD01CS | |
| Hamilton's syringe (Neuros) | WPI Inc. | 06H | |
| Head stage adapter | Neuronexus | Adpt-Q4-OM32 | |
| High impedance silicon probe | Neuronexus | Q1x1-tet-5mm-121-CQ4 | |
| INTAN 512ch Recording Controller | INTAN | RHD2000 | |
| Iodine solution | Dynarex | 1425 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| Ketamine | Spectrum | K1068 | |
| LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | |
| LED light source (470 nm)-blue light | Thorlabs | M470F3 | |
| Micromanipulator | Narishige | M0-203 | |
| Optic fiber | Thorlabs | CFMLC14L05 | |
| Pan head philips screw (M0.6 X 2mm) | Amazon | M0.6 X 2mm | |
| Pre-amplifier headstage (32 Channel) | INTAN | C3314 | |
| Stereotaxic frame | Kopf | 1530 | |
| TTL pulser | Prizmatix | 4031 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Xylazine | Alfa Aesar | J61430 | |
| Software | Company | Version | |
| Graphpad Prism | |||
| Intan Recording Controller | |||
| Neuroexplorer | |||
| Plexon Offline Spike Sorter | |||
| ACSF Composition: | |||
| oxygenated ACSF with 95% Oxygen/5%CO2 constantly being bubbled through the ACSF (ACSF; in mM 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1.25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2 and 25 Glucose). |
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