Échantillonnage et extraction sur place de tumeurs cérébrales pour l’analyse de la métabolomique et de la lipidomique
Summary
Le manuscrit présente l’échantillonnage sur place des tumeurs cérébrales humaines avec microextraction de phase solide suivie de leur profilage biochimique vers la découverte de biomarqueurs.
Abstract
Malgré la variété des outils disponibles pour le diagnostic et la classification du cancer, les méthodes qui permettent une caractérisation rapide et simple des tumeurs sont toujours dans le besoin. Ces dernières années, la spectrométrie de masse est devenue une méthode de choix pour le profilage non ciblé des composés discriminatoires en tant que biomarqueurs potentiels d’une maladie. Les biofluides sont généralement considérés comme des matrices préférables étant donné leur accessibilité et leur traitement plus facile de l’échantillon, tandis que le profilage direct des tissus fournit des renseignements plus sélectifs sur un cancer donné. La préparation des tissus pour l’analyse par des méthodes traditionnelles est beaucoup plus complexe et prend beaucoup de temps, et, par conséquent, ne convient pas à une analyse rapide sur place. Les travaux actuels présentent un protocole combinant la préparation d’échantillons et l’extraction de petites molécules sur place, immédiatement après la résection tumorale. Le dispositif d’échantillonnage, qui est de la taille d’une aiguille d’acupuncture, peut être inséré directement dans le tissu, puis transporté au laboratoire voisin pour analyse instrumentale. Les résultats des analyses métabolomiques et lipidomiques démontrent la capacité de l’approche pour l’établissement des phénotypes des tumeurs liées à l’origine histologique de la tumeur, de la malignité, et des mutations génétiques, aussi bien que pour la sélection des composés discriminants ou des biomarqueurs potentiels. La nature non destructive de la technique permet l’exécution ultérieure de tests couramment utilisés, par exemple des tests histologiques, sur les mêmes échantillons utilisés pour l’analyse SPME, permettant ainsi la réalisation d’informations plus complètes à l’appui de diagnostics personnalisés.
Introduction
L’imagerie par résonance magnétique (IRM) et la tomographie calculée (Tomodensitométrie) sont les principales méthodes utilisées pour l’analyse en temps réel des lésions cérébrales. La différenciation de tumeur de cerveau est généralement basée sur l’histopathologie avec la coloration additionneuse et les techniques immunohistochemical avancées. Selon les directives actualisées sur les tumeurs cérébrales nerveuses centrales publiées par l’Organisation mondiale de la Santé (OMS) en 2016, les tests génétiques sont cruciaux pour la différenciation et la classification de ces tumeurs1. La différenciation et la classification des tumeurs permettent aux médecins de choisir le traitement le plus efficace pour un type donné de tumeur augmentant ainsi l’espérance de vie du patient. Malheureusement, malgré la disponibilité de ces méthodes avancées pour aider les médecins à choisir une thérapie optimale pour leurs patients, l’espérance de vie des patients diagnostiqués avec le glioblastome (gliome de catégorie IV) est seulement d’environ 15-16 mois2. Même avec la sophistication et la précision accrue de la dite imagerie et les méthodes histologiques comme outils de diagnostic, il ya encore un grand besoin de nouvelles techniques capables d’offrir des informations complémentaires pour aider les médecins dans les décisions concernant le cours du traitement. Au cours des dernières années, plusieurs nouvelles approches basées sur la spectrométrie de masse ont été proposées pour l’analyse peropératoire du cancer3,4. Le potentiel de microextraction de phase solide (SPME), la méthode présentée ci-après, comme un outil rapide d’analyse sur place, a déjà été démontré dans une variété d’études5. Le manuscrit actuel montre l’une des applications cliniques de la méthode, métabolomique non ciblé et lipidomics des tumeurs cérébrales humaines. Les enquêtes non menées présentent un point de départ important dans la découverte de biomarqueurs potentiels. Une fois établis, ces biomarqueurs peuvent ensuite être utilisés comme références diagnostiques pour différencier entre les tumeurs en utilisant la même technologie couplée à l’instrumentation sur place.
SPME est une technique de préparation d’échantillons basée sur l’équilibre qui extrait de petites molécules de matrices d’échantillons avec l’utilisation de petites quantités de phase d’extraction. Dans la configuration la plus traditionnelle de l’appareil (sonde) du SPME, une fibre est recouverte d’une phase d’extraction appropriée et immobilisée sur un support solide, c’est-à-dire un filmétallique 5,6. Les revêtements et dispositifs biocompatibles (sondes) permettent l’extraction directement à partir de matrices biologiques complexes sans prétraitement d’échantillons, par exemple l’homogénéisation et la filtration. Par le processus d’extraction, les analytes sont divisés entre la phase d’extraction et la matrice de l’échantillon en proportion de leurs concentrations initiales. Si l’extraction est effectuée assez longtemps, alors l’équilibre est atteint. Bien que l’extraction à l’équilibre offre la sensibilité et la reproductibilité les plus élevées possibles, l’extraction pré-équilibre est également possible et même préférable dans certains cas, c’est-à-dire l’échantillonnage in vivo, où les restrictions de temps associées à l’échantillonnage sur place (p. ex., salles d’opération ou d’urgence) nécessitent des extractions rapides. Le profil de temps d’extraction d’un analyte donné est généralement influencé par les propriétés physicochimiques de l’analyte, la matrice échantillonnée, le type de sorbent utilisé et plusieurs autres conditions d’extraction. La pléthore de facteurs régissant leur cinétique d’extraction rend pratiquement impossible d’assurer l’extraction d’équilibre de tous les composés lorsque des analyses non ciblécombres telles que la métabolomique ou la lipidomique sont effectuées. Pour les raisons susmentionnées, le temps d’extraction du protocole actuel a été fixé arbitrairement afin d’assurer une sensibilité et une couverture satisfaisantes des métabolites d’une part, et la praticité de l’utilisation sur place d’autre part.
Il convient de souligner que la très petite taille des sondes utilisées pour l’extraction de l’échantillon à partir de tissus ne cause qu’un minimum de lésions tissulaires alors que la procédure d’échantillonnage elle-même ne consomme aucun tissu mais de très petites quantités de petites molécules de la zone échantillonnée; par conséquent, le même échantillon peut être utilisé pour des tests de routine, c’est-à-dire histologiques ou génétiques, permettant la réalisation d’informations essentielles et complémentaires à partir d’un même échantillon. De telles données complémentaires et complètes permettraient une meilleure compréhension de la biologie tumorale, ce qui, espérons-le, faciliterait la découverte de nouvelles cibles de traitement. L’exploitation de cette méthode augmente encore la possibilité de diagnostics peropératoires sur place lors de la détermination des biomarqueurs cibles.
Ci-dessous nous présentons des protocoles pour l’échantillonnage des tumeurs cérébrales sur place pour les analyses métabolomiques et lipidomiques et le traitement des données.
Protocol
Representative Results
Discussion
La métabolomique et la lipidomique non ciblées sont couramment utilisées dans des études axées sur l’identification des biomarqueurs tumorals. Cependant, dans la plupart des cas, les chercheurs recherchent des composés qui peuvent être utilisés pour le dépistage de la maladie. Par conséquent, les échantillons biologiques préférés sont le sang ou l’urine en raison de leur accès relativement facile. L’analyse du tissu tumoral est principalement effectuée pour comprendre les mécanismes derrière la maladie, caractériser différents types de tumeurs, etc. L’analyse sur place des biomarqueurs de tumeur est rarement exécutée, car de telles applications exigent la préparation étendue d’échantillon. Alternativement, les stratégies basées sur l’analyse en temps réel des profils tissulaires sans présélection de biomarqueurs spécifiques gagnent l’attention de la communautémédicale 3,4. La solution présentée ci-après offre une autre perspective sur le traitement des tissus sur place en dévoilant le type d’information qui peut être obtenue par de telles méthodes.
La combinaison de l’échantillonnage, de la préparation de l’échantillon et de l’extraction fait du SPME un outil très utile pour l’analyse sur place. De plus, le manque de consommation de tissus pendant l’échantillonnage permet d’utiliser davantage les mêmes échantillons pour l’analyse des biomarqueurs et les tests de routine (génotypage, analyse histologique), ce qui ajoute de nouvelles informations aux résultats des tests standard. Le dispositif d’échantillonnage a une conception très simple, son fonctionnement est très facile, et aucune formation spéciale n’est nécessaire pour effectuer l’extraction elle-même. Toutefois, pour obtenir des résultats fiables, il faut bien plus qu’une bonne manipulation des appareils. Pour bien exécuter l’expérience, il faut comprendre le processus d’extraction, la nature de l’échantillon et être conscient des erreurs potentielles qui peuvent influencer les données.
Il est important de tenir compte de l’hétérogénéité des tissus cancéreux10; les tumeurs échantillonnées peuvent contenir des parties subissant la nécrose, la calcification, et l’hypoxie, et chacun de ces processus sera reflété dans le métabolome et le lipidome atteints, influençant ainsi des résultats. Par conséquent, il est recommandé que l’échantillonnage de résolution spatiale soit effectué par insertion de plusieurs fibres dans différentes parties du tissu cancéreux, ou alternativement, qu’un revêtement plus long soit employé pour pénétrer l’ensemble de la tumeur de manière à obtenir l’information moyenne sur la tumeur. Si la méthode d’échantillonnage de résolution spatiale est effectuée, les fibres peuvent toutes être désorbées en un seul solvant de désorption; ceci permettrait non seulement l’accomplissement de l’information globale sur la tumeur, mais augmenterait également la sensibilité de l’analyse. Alternativement, la désorption des fibres individuelles dans les flacons séparés permettrait aux investigations de comprendre la diversité interne de la tumeur de cerveau, qui se compose du noyau construit des cellules cancéreuses, et de la zone extérieure, qui est la frontière du tissu sain. Des parties plus profondes de la tumeur sont habituellement plus endommagées par les processus liés au cancer11. Toutefois, les chercheurs doivent garder à l’esprit que cette option compromet la sensibilité de la méthode et le nombre global de composés détectables. Dans les travaux actuels, un revêtement de 7 mm a été utilisé; cette longueur a été considérée optimale pour diverses tailles des tumeurs incluses dans l’étude. Les revêtements ont pénétré les tumeurs, et ont ainsi fourni la résolution non-spéciale, mais les données moyennes dans l’échantillon. Quel que soit le protocole choisi, il est important que le même protocole soit suivi pendant toute l’étude, y compris le nombre de fibres utilisées pour l’échantillonnage individuel, la longueur du revêtement, le temps d’extraction et tous les autres facteurs délimités dans ce travail.
Il est important de contrôler la qualité de l’analyse. Le QC mis en commun (voir les étapes 4.7 et 7.7 du protocole) doit être préparé et utilisé pour surveiller la stabilité des instruments pendant l’utilisation de l’ensemble du lot de l’échantillon. Les commandes vierges (voir l’étape 2.8) peuvent ensuite être utilisées pour préparer une « liste d’exclusion » afin d’éliminer les signaux de contaminants provenant de solvants ou de fibres. Lors d’occasions spéciales, comme un risque de contamination, il est nécessaire d’effectuer des prélèvements à partir de gants, de tables, d’appareils ou de toute autre surface qui pourrait poser un risque de contamination. Dans de tels cas, la préparation des fibres, le temps d’extraction et les protocoles de désorption sont les mêmes que pour les échantillons.
Les analyses métabolomiques et lipidomiques sont entièrement axées sur de petites molécules (moins de 1 500 Da) apparaissant dans un organisme ou des composants spécifiques de l’organisme, tels que des organes spécifiques, des tissus, des fluides, des cellules, etc. Métabolomique et lipidomique offrent un instantané des changements biochimiques se produisant dans le corps, et dans le cas du cancer, ils intègrent l’information liée au génome, l’histologie, et la malignité de la tumeur. Ces sciences de l’omique créent un lien entre la physiologie et le phénotype, car les métabolites sont plus élevés dans l’échelle biochimique que les protéines ou lesgènes 12. En comprenant le métabolome et le lipidome des tumeurs cancéreuses, nous nous rapprochons de la découverte du phénotype parmi toutes les sciences -omics que ces branches d’étude offrent une connaissance plus approfondie des changements dynamiques des molécules comme une réponse des organismes vivants à divers stimuli. Telles que présentées dans ce travail, les données obtenues dans un échantillonnage correspondent à l’histologie du cancer, à son degré de malignité et aux changements qui se produisent au niveau du génome. Dans les gliomes, comme le type de cancer d’intérêt dans cette étude, l’information cachée dans le génome est particulièrement important, comme un traitement personnalisé est développé sur la base des résultats des tests génétiques. Les mutations particulières sont des marqueurs pronostiques des résultats de la chimio- ou de la radiothérapie. Comme nous l’avons démontré ici, la sélection de biomarqueurs reflétant une mutation donnée est possible avec la stratégie proposée. Les marqueurs de mutation, aussi bien que les types additionnels de descripteurs tels que ceux qui indiquent le degré de malignité de la tumeur peuvent également être utilisés pour soutenir des méthodes diagnostiques courantes.
Biopsie chimique ex vivo avec l’utilisation de fibres de microextraction de phase solide est la première étape dans l’application de la méthode aux diagnostics peropératoires. La méthode peut être facilement adoptée pour l’échantillonnage in vivo en attendant l’autorisation des conseils d’éthique appropriés. Dans de tels cas, la stérilisation des dispositifs SPME doit être effectuée selon les procédures de stérilisation acceptées de l’hôpital où l’échantillonnage doit être effectué, c’est-à-dire l’autoclaving ou la stérilisation par oxyde d’éthylène. Les fibres précon conditionnées et stérilisées doivent être conservées dans des emballages scellés étiquetés avec une date d’expiration de stérilisation. Il est important de noter que les fibres ne doivent pas être nettoyées à l’aide de surfactants. Une telle procédure peut provoquer des changements non spécifiques dans la composition sorbente, ce qui a un impact sur l’extraction des analytes. Dans les études décrites ci-après, une période d’extraction de 30 minutes a été utilisée, mais d’autres rapports valident que des temps plus courts peuvent donner des résultats satisfaisants dans les études in vivo 13. Huq et coll. ont montré que le temps d’équilibre analyte est atteint plus rapidement dans les tissus, comme matrice complexe, que dans les matricessimples 14. Cependant, la reproductibilité des résultats obtenus peut être compromise dans des périodes d’extraction plus courtes car plus d’analytes seront extraits dans des conditions de pré-équilibre; par conséquent, un contrôle précis du temps doit être mis en œuvre.
Les deux sciences de l’omique exploitées dans le cadre de ces travaux ont un excellent potentiel en tant qu’outils de découverte de biomarqueurs. Une fois que les biomarqueurs sont sélectionnés ou qu’un modèle chimiométrique est établi, des diagnostics médicaux fondés sur la détermination des métabolites cibles au moyen de méthodes applicables aux enquêtes sur place, comme l’approche SPME décrite dans ce travail, peuvent être élaborés et mis en œuvre dans le cadre de diagnostics de routine.
Le protocole proposé dans le présent manuscrit décrit comment effectuer des analyses métabolomiques et lipidomiques non recibrées du tissu cancéreux à l’aide de microextraction en phase solide pour le dépistage des biomarqueurs potentiels. Il est conçu pour permettre l’extraction de composés représentatifs, la différenciation des tumeurs et l’identification de composés discriminatoires caractérisant un cancer donné, c’est-à-dire des biomarqueurs potentiels. Les analyses non ciblées avec SPME décrites dans cet article représentent un point de départ dans le développement de diagnostics peropératoires rapides, où un panel sélectionné de composés peut être déterminé sans la nécessité de criblage de tous les composés présents dans l’échantillon. Dans l’intérêt de résultats diagnostiques rapides, les sondes SPME utilisées pour l’extraction sur place pourraient être directement couplées à l’instrumentation analytique située dans l’établissement hospitalier. Des extractions simples effectuées avec une préparation minimale de l’échantillon suivie d’une analyse sans chromatographie raccourciraient considérablement le temps global d’heures à quelques minutes, comme déjà décrit pour la surveillancedes médicaments 15.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L’étude a été soutenue par la subvention Harmonia 2015/18/M/ST4/00059 du Centre national des sciences. Les auteurs aimeraient remercier MilliporeSigma, une entreprise de Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne, d’avoir fourni les dispositifs SPME utilisés dans ce travail. L’entreprise de sciences de la vie de Merck fonctionne sous le nom de MilliporeSigma aux États-Unis et au Canada. En outre, les auteurs tiens à remercier Thermo Fisher Scientific pour l’accès au spectromètre de masse orbitrap Q-Exactive Focus.
Contributions des auteurs : JB : optimisation de la préparation des échantillons et des paramètres LC-MS, performance des expériences SPME-LC-MS, analyse des données, analyse statistique et interprétation des données et préparation manuscrite liée à la partie lipidomique; PZG : coordination et performance de la majorité des échantillonnages à l’hôpital, optimisation des paramètres d’échantillonnage et de préparation des échantillons, performance des expériences SPME-LC-MS, analyse des données, analyse statistique et interprétation des données, préparation manuscrite liée à la partie métabolomique; MG – aide à l’optimisation de la préparation de l’échantillon, de la méthode LC-MS et de l’analyse des données liées à la partie lipidomique; KG : co-exécution des échantillonnages spme et optimisation de l’échantillonnage et de la préparation des échantillons, analyse SPME-LC-MS liée à la partie métabolomique; KC : rendement de plusieurs échantillonnages de SPME à l’hôpital, aide à l’optimisation de l’échantillonnage, préparation d’échantillons et analyse de données liées à la partie métabolomique; KJ : exécution de plusieurs échantillonnages de SPME à l’hôpital, assistance dans l’analyse de lipidomics ; DP : exécution des procédures chirurgicales, recrutement des patients ; JF : exécution des procédures chirurgicales, recrutement des patients ; MH : exécution des procédures chirurgicales, coordination de la partie clinique de la recherche ; BB : concept, supervision de coordination du projet et préparation des manuscrits, exécution de plusieurs échantillonnages
Materials
| acetic acid | Honeywell | 49199 | Mobile phase additive, LCMS grade |
| acetonitrile | Honeywell | 34967 | HPLC solvent, LCMS grade |
| ammonium acetate | Honeywell | 14267 | Mobile phase additive, LCMS grade |
| BenchMixer MultiTube Vortexer | Benchmark Scientific | BV1010* | Vortex mixer |
| caps | Agilent | 5183-2076 | Blue scrw tp,pre-slit PTFE/Si septa |
| Compound Discoverer 2.1 | Thermo Scientific | software for data processing | |
| Discovery HS F5 Supelguar Cartridge 2 cm × 2.1 mm, 3 μm | Supelco | 567571-U | Guard Column |
| Discovery HS F5, 2.1 mm x 100 mm, 3 μm | Merck | 567502-U | HPLC Column |
| formic acid | Honeywell | 56302 | Mobile phase additive, LCMS grade |
| glass vial inserts 250ul , deactivated | Agilent | 5181-8872 | |
| glass vial inserts 350ul | Agilent | 5188-5321 | |
| glass vials 1.5ml | Agilent | 5183-2030 | |
| glass vials, 2 mL (amber, deactivated) | Agilent | 5183-2072 | |
| glass vials, 2mL | Agilent | 5182-0715 | |
| HILIC Luna 3 μm, 200A, 100 x 2.0 mm | Shim-Pol | PHX-00D-4449-B0 | HPLC Column |
| isopropanol | Honeywell | 34965 | HPLC solvent, LCMS grade |
| LipidSearch 4.1 | Thermo Scientific | software for data processing | |
| Metaboanalyst | Xia Lab @ McGill | online software for statistical analysis (Chong, J., Wishart, D.S. and Xia, J. (2019) Using MetaboAnalyst 4.0 for Comprehensive and Integrative Metabolomics Data Analysis. Current Protocols in Bioinformatics 68, e86 ) | |
| methanol | Honeywell | 34966 | HPLC solvent, LCMS grade |
| Pierce LTQ Velos ESI Positive Ion Calibration Solution | Thermo Scientific | 88323 | |
| Pierce Negative Ion Calibration Solution | Thermo Scientific | 88324 | |
| Q Exactive Focus hybrid quadrupole-Orbitrap MS | Thermo Scientific | 726049 | Mass Spectrometer |
| SecurityGuard cartridge for HILIC, 4 mm × 2.0 mm | Phenomenex | KJ0-4282 | Guard Column |
| SeQuant ZIC-cHILIC 3µm,100Å 100 x 2.1 mm | Merck | 1506570001 | HPLC Column |
| SeQuant ZIC-HILIC Guard Kit 20 x 2.1 mm | Supelco | 1504360001 | Guard column |
| SPME LC fiber probes, C18 | Supelco | custom order | comercial probes: 57281-U; probes used in the experiment were not needle assembled and were precut to the length described in the protocol |
| SPME LC fiber probes, mixed Mode | Supelco | custom order | |
| UltiMate 3000 HPLC systems | Thermo Scientific | 5200.0345 | HPLC system |
| water | Merck | 1153331000 | HPLC solvent, LCMS grade |
| XSelect CSH C18 3.5μm 2.1x75mm | Waters | 186005644 | HPLC Column |
| XSelect CSH C18 VanGuard Cartridge, 3.5 µm, 3.9×5 mm | Waters | 186007813 | Column cartidge |
References
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