세포칼슘 측정 및 칼슘 이미징 연구를 위한 뇌 모세관 과구 배양
Summary
뇌 모세관 pericytes는 혈액-뇌 장벽 속성 및 혈류의 조절에 필수적인 선수. 이 프로토콜은 뇌 모세관 pericytes가 세포 유형에 대하여 특징지어지고 형광 프로브를 가진 세포내 칼슘 신호의 조사를 위해 적용되는 방법을 설명합니다.
Abstract
Pericytes는 신경 혈관 단위 (NVU)로 알려져 있는 구조물에 있는 내피 세포 및 성상체 끝피트와 연관됩니다. 뇌 모세관 회낭 기능은 완전히 알려져 있지 않다. Pericytes는 모세관 발달, 내피 장벽 압박감 및 trancytosis 활동의 규제, 모세관 톤의 조절 및 특정 뇌 병리에 중요한 역할을 하는 경우에 관여하기 위하여 건의되었습니다.
Pericytes는 뇌 빈맥의 과정을 시각화하는 데 어려움뿐만 아니라 NVU의 다른 세포와 가까운 근접성으로 인해 손상되지 않은 뇌에서 조사하기가 어렵습니다. 본 프로토콜은 1 차적인 소 두뇌 모세관 pericytes의 격리 그리고 문화를 위한 방법 및 두뇌 신호 및 병리학에 관련되었던 작용제의 효력이 조사될 수 있는 칼슘 화상 진찰 연구 결과에 있는 그들의 다음 사용을 기술합니다. 피질 모세관 단편은 배양 플라스크의 바닥에 부착할 수 있으며, 6일 후에 내피 세포와 회낭이 모세관 단편에서 자생하였다. 내피 세포는 부드러운 트립시화에 의해 제거되고 pericytes는 통과하기 전에 5 추가 일 동안 배양됩니다.
분리된 pericytes는 96웰 배양 판에서 씨를 뿌리고 칼슘 표시기 염료(Fura-2 아세톡시메틸(AM)로 적재되어 플레이트 판독기 설정에서 세포내 칼슘 수치를 측정할 수 있습니다. 또는, pericytes는 커버립에 시드되고 세포 챔버에 장착됩니다. 칼슘 표시기 (Cal-520 AM)로 적재 한 후, 칼슘 라이브 이미징은 488 nm의 내분 파장 및 510-520 nm의 방출 파장에서 공초점 현미경 검사를 사용하여 수행 할 수 있습니다.
여기에 설명된 방법은 1차 뇌 모세관 pericytes로부터 최초의 세포내 칼슘 측정을 얻기 위해 사용되어 왔으며, 이는 pericytes가 ATP를 통해 자극되고 체외에서 수축할 수 있음을 보여줍니다.
Introduction
뇌 모세관 과다구는 내피 세포 및 성상 세포와 함께 NVU1,2,3을구성한다. 모세 혈관의 구조적 기초를 형성하는 내피 세포는 직경 5-8 μm의 긴 원통형 튜브를 형성합니다. 내피 세포는 산발적으로 pericytes로 덮여 있으며 성상세포에서 돌출로 둘러싸여 있습니다. 성상 세포 끝피트.
뇌 모세 혈관에 위치한 혈액 뇌 장벽 (BBB)은 뇌와 혈액 사이의 영양소, 가스 및 폐기물의 교환을위한 주요 사이트입니다. BBB는 또한 내인성 및 외인성 신경 독소로부터 두뇌를 보호하고 많은 수의 약물 화합물의 납품을 위한 장벽 역할을 합니다. 장벽 기능은 중추 신경계 (CNS) 의약품을 개발하는 제약 회사를위한 초점 영역뿐만 아니라 장애물입니다. 이것은 문화4에서NVU의 세포를 조사하는 데 큰 관심을 불러 일으켰습니다. 뇌 성상세포와 내피 세포는 여러 연구에서 배양되고 특징지어지지만, 백혈구 배양을 위한 연구와 프로토콜은 희소합니다.
이전에 발표된 프로토콜은 면역파닝5,고혈당 및 저혈당 미디어6,형광 활성화 세포 분류7,밀도 그라데이션 원심 분리8등과 같은 다양한 접근법을 사용하여 어느 정도 뇌 모세관 백혈구 배양의 생성을 기술했다. 이러한 방법은 pericytes의 배양을 얻기에 충분해 보이지만, 일부는 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들고 얻은 pericytes는 pericytes9를구별할 수 있는 문화 구절의 수로 인해 이상적이지 않을 수 있습니다. 더욱이, 체외 신호 연구에서 배양 pericytes의 잠재력은 지금까지 상당히 미개척 되었습니다.
본 연구는 고립된 소 뇌 모세혈관으로부터의 회낭 배양 의 생성과 중요한 세포내 두 번째 메신저인 세포내 칼슘의 변화에 대한 측정 및 이미징 연구를 위한 후속 설정에 초점을 맞추고 있습니다. 우리는 피질 회색 물질에서 모세 혈관의 격리 (세부 사항은 Helms외. 10참조) 및 내피 또는 신경교 세포에 오염없이 순수한 단일 문화에서 pericytes의 격리 및 문화를 간단히 설명합니다. 그런 다음 96웰 플레이트에서 회낭을 파종하고 칼슘 프로브 Fura-2 AM에 대한 적재 프로토콜을 제공합니다. 마지막으로, 우리는 pericytes가 현미경 배양 챔버에 있는 실시간 공초점 화상 진찰에서 어떻게 이용될 수 있는지 보여주고 이것을 위한 프로토콜을 기술합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구에서는, 우리는 소 두뇌에서 1 차적인 pericytes를 격리하는 방법을 제시했습니다. 설명된 프로토콜은 그렇지 않으면 접근할 수 없는 세포 유형의 배양을 허용합니다. 이후에 얻은 세포 배양은 세포 형태학 및 단백질발현(12)에기초한 내피 세포 및 신경교 세포를 가진 거의 또는 전혀 오염없이 거의 또는 전혀 오염되지 않은 pericytes의 거의 균질한 집단이었다. 또한, 우리는 의…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 뇌 장벽과 약물 전달에 룬드벡 재단 연구 이니셔티브에서 자금을 인정하고자 (RIBBDD) 사이먼 Hougners 가족 재단.
Materials
| ATP | Tocris | 3245 | |
| Cal-520 AM | AAT Bioquest | 21130 | |
| Cell incubator | Thermo Fisher | ||
| Centrifuge | Thermo Fisher | Heraeus Multifuge 3SR+ | Standard large volume centrifuge for spinning down cells |
| Collagen IV | Sigma Aldrich | C5533 | |
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | Zeiss LSM 510 | Inverted microscope |
| Counting chamber | FastRead | 102 | |
| Coverslip cell chamber | Airekacells | SC15022 | |
| Cremophor EL | Sigma Aldrich | C5135 | Formerly known as Kolliphor EL |
| DMSO | Sigma Aldrich | 471267 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium | Sigma Aldrich | D0819 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAA/GE Healthcare | A15-101 | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fisher | F1201 | |
| Glass coverslips 22×22 mm | VWR International | 631-0123 | |
| HBSS | Gibco | 14065-049 | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149 | |
| HEPES | AppliChem Panreac | A1069 | |
| Light microscope | Olympus | Olympus CK2 | Upright light microscope with phase contrast |
| MEM nonessential amino acids | Sigma Aldrich | M7145 | |
| Microplate Reader | BMG LabTech | NOVOstar | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | Phosphate-buffered saline |
| penicillin G sodium/streptomycin sulfate | Sigma Aldrich | P0781 | |
| Pluronic F127 | Sigma Aldrich | P2443 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4299 | |
| T-75 flask | Sigma Aldrich | CLS3972 | |
| 96-well plate | Corning incorporated | 3603 |
References
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