Vaskuläres Gießen von Erwachsenen und frühpostnatalen Mauslungen für Micro-CT Imaging
Summary
Das Ziel dieser Technik ist die ex vivo Visualisierung von pulmonalen arteriellen Netzwerken von frühpostnatalen und erwachsenen Mäusen durch Lungeninflation und Injektion einer radio-opaque polymerbasierten Verbindung über die Lungenarterie. Mögliche Anwendungen für gegossenes Gewebe werden ebenfalls diskutiert.
Abstract
Blutgefäße bilden komplizierte Netzwerke im dreidimensionalen Raum. Daher ist es schwierig, visuell zu schätzen, wie vaskuläre Netzwerke interagieren und sich verhalten, indem sie die Oberfläche eines Gewebes beobachten. Diese Methode bietet eine Möglichkeit, die komplexe dreidimensionale Gefäßarchitektur der Lunge zu visualisieren.
Um dies zu erreichen, wird ein Katheter in die Lungenarterie eingeführt und die Vaskulatur wird gleichzeitig von Blut gespült und chemisch erweitert, um den Widerstand zu begrenzen. Die Lunge wird dann bei einem Standarddruck durch die Luftröhre aufgeblasen und die Polymerverbindung wird bei einer Standarddurchflussrate in das Gefäßbett infundiert. Sobald das gesamte arterielle Netzwerk gefüllt ist und geheilt werden kann, kann die Lungenvaskulatur direkt visualisiert oder auf einem Mikro-CT-Scanner abgebildet werden.
Wenn erfolgreich durchgeführt, kann man das lungenarteriende Netzwerk bei Mäusen vom frühen postnatalen Alter bis zu Erwachsenen zu schätzen wissen. Darüber hinaus kann diese Methode, während sie im pulmonalen Arterienbett demonstriert wird, auf jedes Gefäßbett mit optimierter Katheterplatzierung und Endpunkten angewendet werden.
Introduction
Der Schwerpunkt dieser Technik liegt auf der Visualisierung der pulmonalen arteriellen Architektur mit einer polymerbasierten Verbindung bei Mäusen. Während umfangreiche Arbeiten an systemischen Gefäßbetten wie Gehirn, Herz und Niere1,2,3,4,5durchgeführt wurden, stehen weniger Informationen über die Vorbereitung und Füllung des lungenarterienartigen Netzwerks zur Verfügung. Das Ziel dieser Studie ist es daher, auf frühere Arbeiten6,7,8 zu erweitern und eine detaillierte schriftliche und visuelle Referenz zu liefern, die die Forscher leicht folgen können, um hochauflösende Bilder des Lungenarterienbaums zu erzeugen.
Während es zahlreiche Methoden zur Kennzeichnung und bildgebenden Lungenvaskulatur gibt, wie Magnetresonanztomographie, Echokardiographie oder CT-Angiographie9,10, können viele dieser Modalitäten die kleinen Gefäße nicht ausreichend füllen und/oder erfassen, was den Umfang dessen, was untersucht werden kann, begrenzt. Methoden wie serielle Schnitte und Rekonstruktionen bieten eine hohe Auflösung, sind aber zeit-/arbeitsintensiv11,12,13. Die umgebende Weichteilintegrität wird in traditionellen Korrosionsguss10,13,14,15,16kompromittiert. Auch Tieralter und -größe werden zu Faktoren, wenn man versucht, einen Katheter einzuführen, oder die Auflösung fehlt. Die Polymerinjektionstechnik hingegen füllt die Arterien auf kapillarer Ebene und ermöglicht in Kombination mit dem CT eine unvergleichliche Auflösung5. Proben aus der Mauslunge, die noch jung sind, wurden bis zum 14. Tag erfolgreichgegossen und innerhalb weniger Stunden verarbeitet. Diese können auf unbestimmte Zeit erneut gescannt oder sogar zur histologischen Präparat-/Elektronenmikroskopie (EM) geschickt werden, ohne das vorhandene Weichgewebe17zu beeinträchtigen. Die Haupteinschränkungen dieser Methode sind die Vorabkosten von CT-Geräten/-software, Herausforderungen bei der genauen Überwachung des intravaskulären Drucks und die Unfähigkeit, Daten längs im selben Tier zu erfassen.
Dieses Papier baut auf bestehenden Arbeiten auf, um die Pulmonale-Arterieninjektionstechnik weiter zu optimieren und alters-/größenbezogene Grenzen auf den postnatalen Tag 1 (P1) zu verschieben, um markante Ergebnisse zu erzielen. Es ist am nützlichsten für Teams, die arterielle Gefäßnetzwerke studieren möchten. Dementsprechend bieten wir neue Anleitungen für die Katheterplatzierung/-stabilisierung, eine erhöhte Kontrolle über Füllrate/Volumen und weisen auf bemerkenswerte Fallstricke für einen erhöhten Gusserfolg hin. Die resultierenden Gussteile können dann für zukünftige Charakterisierungen und morphologische Analysen verwendet werden. Vielleicht noch wichtiger ist, dass dies die erste visuelle Demonstration ist, nach unserem Wissen, die den Benutzer durch dieses komplizierte Verfahren führt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Methode, die richtig ausgeführt wird, liefert eindrucksvolle Bilder von pulmonalen arteriellen Netzwerken, die Vergleich und Experimente in Nagetiermodellen ermöglichen. Mehrere kritische Schritte auf dem Weg sorgen für den Erfolg. Zunächst müssen die Ermittler das Tier in der Vorbereitungsphase heparinisieren, um zu verhindern, dass sich Blutgerinnsel in der Lungenvaskulatur und den Kammern des Herzens bilden. Dies ermöglicht den vollständigen arteriellen Transit von Polymerverbindungen. Zweitens, wenn Sie …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde teilweise durch das NHLBI Intramural Research Program (DIR HL-006247) unterstützt. Wir danken der NIH Mouse Imaging Facility für die Anleitung bei der Bildaufnahme und -analyse.
Materials
| 1cc syringe | Becton Dickinson | 309659 | |
| 20ml Glass Scintillation Vials | Fisher | 03-340-25P | |
| 30G Needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| 50mL conical tubes | Cornin | 352098 | For sample Storage and scanning |
| 60cc syringe | Becton Dickinson | 309653 | |
| 7-0 silk suture | Teleflex | 103-S | |
| Analyze 12.0 Software | AnalyzeDirect Inc. | N/A | Primary Software |
| Amira 6.7 Software | Thermo Scientific | N/A | Alternative Sofware |
| CeramaCut Scissors 9cm | Fine Science tools | 14958-09 | |
| Ceramic Coated Curved Forceps | Fine Science tools | 11272-50 | |
| CO2 Tank | Robert's Oxygen Co. | n/a | |
| Dual syringe pump | Cole Parmer | EW-74900-10 | |
| Dumont Mini-Forceps | Fine Science tools | 11200-14 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Formalin | Sigma – Life Sciences | HT501128 | |
| Gauze | Covidien | 441215 | |
| Hemostat | Fine Science tools | 13013-14 | |
| Heparin (1000USP Units/ml) | Hospira | NDC 0409-2720-01 | |
| Horos Software | Horos Project | N/A | Alternative Sofware |
| induction chamber | n/a | n/a | |
| Kimwipe | Fisher | 06-666 | fiber optic cleaning wipe |
| Labelling Tape | Fisher | 15966 | |
| Magnetic Base | Kanetec | N/A | |
| Micro-CT system | SkyScan | 1172 | |
| Microfil (Polymer Compound) | Flowech Inc. | Kit B – MV-122 | 8 oz. of MV compound; 8 oz. of diluent; MV-Curing Agent |
| Micromanipulator | Stoelting | 56131 | |
| Monoject 1/2 ml Insulin Syringe | Covidien | 1188528012 | |
| Octagon Forceps Straight Teeth | Fine Science tools | 11042-08 | |
| Parafilm | Bemis company, Inc. | #PM999 | |
| PE-10 tubing | Instech | BTPE-10 | |
| Phospahte buffered Saline | BioRad | #161-0780 | |
| Ring Stand | Fisher | S13747 | Height 24in. |
| Sodium Nitroprusside | sigma | 71778-25G | |
| Steel Plate | N/A | N/A | 16 x 16 in. area, 1/16 in thick |
| Straight Spring Scissors | Fine Science tools | 15000-08 | |
| SURFLO 24G Teflon I.V. Catheter | Santa Cruz Biotechnology | 360103 | |
| Surgical Board | Fisher | 12-587-20 | This is a converted slide holder |
| Universal 3-prong clamp | Fisher | S24280 | |
| Winged Inf. Set 25X3/4, 12" Tubing | Nipro | PR25G19 | |
| Zeiss Stemi-508 Dissection Scope | Zeiss | n/a |
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