Bewertung der globalen Augenstruktur nach der Raumfahrt mit einer mikroberechneten Tomographie (Micro-CT) Imaging-Methode
Summary
Wir präsentieren ein Protokoll mit hochauflösender Mikro-Computertomographie-Bildgebung, um festzustellen, ob die Raumfahrt Schäden an Augenstrukturen verursacht hat. Das Protokoll zeigt die mikro-CT-abgeleitete Messung von ex vivo Nagetier-Augenstrukturen. Wir zeigen die Fähigkeit, okuläre morphologische Veränderungen nach der Raumfahrt mit einer zerstörungsfreien dreidimensionalen Technik zur Bewertung von Augenschäden zu bewerten.
Abstract
Berichte zeigen, dass eine längere Exposition gegenüber einer Raumflugumgebung morphologische und funktionelle ophthalmologische Veränderungen bei Astronauten während und nach einer Mission der Internationalen Raumstation (ISS) verursacht. Die zugrunde liegenden Mechanismen dieser durch die Raumfahrt induzierten Veränderungen sind jedoch derzeit unbekannt. Ziel der vorliegenden Studie war es, den Einfluss der Raumflugumgebung auf die Augenstrukturen zu bestimmen, indem die Dicke der Mausnetzhaut, des retinalen Pigmentepithels (RPE), der Aderhaut und der Skleraschicht mittels Mikro-CT-Bildgebung bewertet wurde. Zehn Wochen alte C57BL/6 männliche Mäuse wurden an Bord der ISS für eine 35-tägige Mission untergebracht und kehrten dann lebend zur Gewebeanalyse zur Erde zurück. Zum Vergleich: Bodenkontrollmäuse (GC) auf der Erde wurden unter identischen Umgebungsbedingungen und Hardware gehalten. Augengewebeproben wurden für Mikro-CT-Analysen innerhalb von 38(±4) Stunden nach dem Splashdown gesammelt. Die Bilder des Querschnitts der Netzhaut, des RPE, der Aderhaut und der Skleraschicht des fixierten Auges wurden in einer axialen und sagittalen Ansicht mit einem Mikro-CT-Bildaufnahmeverfahren aufgezeichnet. Die Mikro-CT-Analyse zeigte, dass die Querschnittsbereiche der Netzhaut, RPE und Der Aderhautschichtdicke in Raumflugproben im Vergleich zu GC verändert wurden, wobei Raumflugproben im Vergleich zu Kontrollen deutlich dünnere Querschnitte und Schichten zeigten. Die Ergebnisse dieser Studie deuten darauf hin, dass die Mikro-CT-Evaluierung eine empfindliche und zuverlässige Methode zur Charakterisierung von Veränderungen der Augenstruktur ist. Diese Ergebnisse sollen das Verständnis der Auswirkungen von Umweltbelastungen auf globale Augenstrukturen verbessern.
Introduction
In der Mikrogravitationsumgebung der Raumfahrt kann ein erhöhter intrakranieller Druck (ICP), der durch Flüssigkeitsverschiebung verursacht wird, zum Raumflug-assoziierten neurookulären Syndrom (SANS)1,2,3,4,5beigetragen haben. Tatsächlich haben über 40% der Astronauten SANS während und nach einer Mission der Internationalen Raumstation (ISS)6erlebt, einschließlich des Raumflugthemas der NASA-Zwillingsstudie7. Die aktuelle Pathophysiologie von SANS umfasst physiologische Veränderungen wie optische Sscheibenödeme, Globe-Flattening, Aderoid- und Netzhautfalten, hyperopic refraktive Fehlerverschiebungen und Nervenfaserschichtinfarkte (d.h. Watteflecken) und sind gut dokumentiert5,8. Die zugrunde liegenden Mechanismen der Veränderungen und Faktoren, die zur Entwicklung von Schäden beitragen, sind jedoch unklar. Um SANS besser verstehen zu können, stehen Tiermodelle zur Verfügung, um die raumfliegenassoziierten Veränderungen in der Netzhautstruktur und -funktion zu charakterisieren.
In einer früheren Untersuchung an denselben Tieren berichteten wir über die Auswirkungen von 35 Tagen Raumfahrt auf die Netzhaut der Maus. Die Ergebnisse erklären, dass die Raumfahrt erhebliche Schäden in der Netzhaut und Netzhautvaskulatur induziert, und einige Proteine/Wege, die mit Zelltod, Entzündungen und metabolischem Stress verbunden sind, wurden nach der Raumfahrt signifikant verändert9.
Derzeit gibt es eine Vielzahl von nichtinvasiven bildgebenden Verfahren zur Überwachung der Krankheitsentwicklung und -progression sowie physiologische Reaktionen auf verschiedene Umweltstressoren, die auch in kleinen Nagetiermodellen weit verbreitet sind. Eine dieser Techniken ist micro-CT, die anatomische Strukturen und pathologische Prozesse bewertet und erfolgreich auf Organismen so klein wie Mäuse10eingesetzt wurde.
Micro-CT kann eine Mikro-Auflösung erreichen, und es kann einen hohen Kontrast für die volumetrische Analyse von Weichteilen mit der Zugabe des geeignetenKontrastmittels 10,11,12,13,14bieten. Die Mikro-CT-Technologie ist im Vergleich zu herkömmlichen Methoden wie Grobanatomie, Lichtmikroskopie und Histologie-Untersuchung von Vorteil, da sie physikalische Schäden am geometrischen Profil der Proben minimiert und das räumliche Verhältnis zwischen Denstrukturen nicht verändert. Darüber hinaus können dreidimensionale (3D) Strukturen aus Mikro-CT-Bildern12,14rekonstruiert werden. Trotz der Hinweise auf Sehbehinderungen nach expositionsunfähiger Weltraumumgebung stehen bisher nur wenige Daten in Tiermodellen zur Verfügung, um die mit der Raumfahrt verbundenen Veränderungen in der Netzhautstruktur und -funktion besser zu verstehen. In der aktuellen Studie wurden Mäuse auf einer 35-tägigen Mission an Bord der ISS geflogen, um die Auswirkungen der Raumflugumgebung auf die Augengewebestrukturen zu bestimmen, indem die Mikrostruktur der Netzhaut, des RPE und der Aderhautschichten mit Mikro-CT quantifiziert wurden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass es strukturelle Veränderungen im Raumflug-Mausauge mit der Mikro-CT-Technik im Vergleich zu GC-Gruppen, insbesondere der Netzhaut, der RPE und den Aderhautschichten des Auges gab, wie ihre verminderte Dicke zeigt. Micro-CT bietet eine effiziente und zerstörungsfreie Technik, um die Veränderungen ohne Manipulation zu charakterisieren. Die Verwendung von PMA-Färbung verbesserte die Qualität der Mikro-CT-Bilder, um nach der Rekonstruktion erfolgreich klare 3D-Tomographiebilder zu erhalten, ohne dass die Struktur der Probe physisch verändert werden musste. Ein zusätzlicher Vorteil dieser Bilder besteht darin, dass sie die gesamte Interessenregion digital anzeigen und damit die Zugänglichkeit sowie die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse erhöhen. Durch die mikro-CT-Bilder, die während dieser Studie produziert wurden, zeigte die Zielprobe eine Differenzierung der multiplen Strukturen wie Netzhaut, RPE, Aderhaut und Sklera-Schicht zur Bestimmung der Dicke jeder Schicht.
Ein kritischer Schritt innerhalb des Protokolls ist die Manipulation der Samples aufgrund ihrer Größe und Textur. Die Handhabung der Probe muss sorgfältig erfolgen, ohne die Probe während der Vorbereitung unter Druck zu setzen. Der Micro-CT hat einige Einschränkungen: Auflösung und das Fehlen standardisierter Werte für die Parameter. Während des Scannens können die verschiedenen Mikro-CT-Scanner unterschiedliche Bildverarbeitungsalgorithmen haben; dennoch könnte die Kalibrierung für eine Graustufen-Skala fortgesetzt werden, um jedes Problem zu überwinden. Nach dem Scannen sollte die Rekonstruktion der Bilder auf dem Gewebe und der Analyse basieren, die durchgeführt wird. Es kann kritisch sein, da die Bildqualität vom tomographischen System, den Einstellungen, der Probengröße sowie den Aufbereitungsmethoden16,17abhängt.
Aufgrund seiner erfolgreichen Anwendung bei der Untersuchung verschiedener Arten von normalen und pathologischen Geweben sollten Mikro-CT-Bildgebungsfunktionen in der zukünftigen Forschung verwendet werden, um volumetrische Daten für andere Analysen zu kompilieren. Auf der Grundlage des Zwecks der vorliegenden Studie war es daher akzeptabel, zweidimensionale Messungen zu verwenden, aber die Segmentierung der brutto 3D-Struktur kann auch vorteilhaft sein, um eine genaue Umrisslinie der gesamten Probe zu liefern. Selbst bei allen Vorteilen einer zerstörungsfreien Technik wird micro-CT andere Methoden wie die Immunhistochemie nicht ersetzen, sondern nachfolgende Histologieanalysen ergänzen und auf Wunsch ermöglichen.
Ein längerer Raumflugzustand führt zu einer Reihe struktureller und funktioneller Augenveränderungen bei den Astronauten während und nach der Weltraummission, die als SANS definiert ist. Die Ergebnisse umfassen hyperopic Verschiebungen, Globus-Abflachung, Aderhaut-/Retinafalten und Watteflecken19. Im Gegensatz zur optischen Kohärenztomographie (OCT) der Astronauten wurde in dieser tierischen Mikro-CT-Studie die Erkenntnis der Verdickung der retinalen Nervenfaserschicht, der Ausdünnung der Netzhaut und der Aderhautschicht dokumentiert. Diese Ergebnisse waren unerwartet. Diese Diskrepanz kann auf verwirrende Faktoren zurückzuführen sein. Mäuse haben eine begrenzte Cephalad-Flüssigkeitsverschiebung im Vergleich zum Menschen. Dieser Mangel an Flüssigkeitsverschiebung kann unterschiedliche Reaktionen auf Gravitationsveränderungen heraufbeschworen haben. Zweitens wurden Mäuse innerhalb von 38 Stunden nach dem Splashdown seziert, und eine akute Reaktion auf eine Reanpassung kann auch zu morphologischen Veränderungen in der Netzhaut und Aderhaut beitragen. Die Bestätigung dieser Möglichkeit erfordert weitere Messungen während der Raumfahrt und langfristig nach der Mission.
Die Ergebnisse dieser Studie deuten darauf hin, dass die Bedingungen der Raumfahrt, insbesondere Gravitationsveränderungen, eine akute und kurzfristige Reaktion im Auge hervorrufen können. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um die Folgen der akuten Veränderungen auf die Netzhautfunktion und den Mechanismus der raumfliegeninduzierten Strukturveränderungen zu bestimmen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde unterstützt durch das NASA Space Biology-Stipendium NNX15AB41G und das LLU Department of Basic Sciences. Sungshin Choi, Dennis Leveson und Rebecca Klotz haben maßgeblich zum Erfolg unserer Raumflugstudie beigetragen und wir schätzen ihre Unterstützung sehr. Die Autoren danken auch der gesamten NASA Biospecimen Sharing Program Gruppe für ihre großartige Unterstützung.
Die Autoren danken auch dem Center for Dental Research for Micro-CT Service.
Materials
| 10 wt. % phosphomolybdic | Sigma | 12026-57-2 | |
| Ethanol absolute by Baker Analyzed | VWR | 80252500 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | L1825 | |
| X-ray micro-CT system SkyScan 1272 scanner | Bruker |
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