성인용 마우스 심장에서 심방 심근 세포, 심실 심근 세포 및 비근구의 동시 격리 및 문화

이 논문에 보고된 마우스에 대한 모든 연구는 SDSU 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 검토되고 승인되었으며 국가 연구 위원회가 발표 한 실험실 동물의 치료 및 사용에 대한 가이드를 준수합니다. 1. 고립 및 문화 미디어 및 도금 준비 Joklik 수정 최소 필수 매체 (MMEM)를 멸균 수의 1 L에 추가하여 사용하기 전에 심장 관류 미디어 1 L을 준비하십시오. pH를 10N NaOH로 7.36으로 조정한 다음 0.2 μm 필터를 통과한 다음 최대 2주 동안 4°C에 저장합니다.참고: Joklik MMEM은 112mM NaCl, 5.4mM KCl, 1mM MgCl2,9m MM NaH2PO4,및 11.1 mM D-포도당으로 구성되어 있습니다. 이는 10mM HEPES(2.38g/L), 30mM 타우린(3.75g/L), 2m D-l-카르니틴(0.4 g/L), 2mM 크레아틴, 10m 부탄디온 모노시메(1.01 g/L)로 보충된다. 관류 직전에 소화 완충제를 준비하십시오: 100mM CaCl2의 6.25 μL을 함유한 심장 관류 매체 50mL(단계 1.3 참조) 및 콜라게나아제 형 2(효소 활동 ~310-320 U/mg dw)를 보충한다.참고: 희생 하기 전에 동물을 무게. 소화 완충제로 보충된 콜라게나아제 형 2형의 양은 동물의 무게에 의해 결정된다(체중 1g당 콜라게나아제 타입 2.25 mg). 100 mM CaCl2를준비하려면, 분자 생물학 학년 수의 CaCl2 ~ 100 mL의 1.47 g를 추가합니다. 용해 될 때까지 저은 다음 0.2 μm 필터를 통과하고 실온에서 최대 2 개월 동안 보관하십시오. 심구체 정지 버퍼 1을 10mL의 심혈구 버퍼를 10mL의 태아 소 혈청(FBS)과 100mM CaCl2의125 μL로 보충하여 준비한다. 0.2 μm 필터를 통과하고 최대 2 주 동안 4 °C에서 저장합니다. 심구체 정지 버퍼 2를 6mL의 FBS와 10mM CaCl2의150 μL로 심혼 관류 버퍼 114mL을 보충하여 준비한다. 0.2 μm 필터를 통과하고 최대 2 주 동안 4 °C에서 저장합니다. 4mL의 FBS, 100x 펜/스트렙글루타민 1mL, 인슐린-트랜스퍼린 셀레늄 1mL, 10μm dexam.m. 0.2 μm 필터를 통과하고 도금될 때까지 37°C에 보관하십시오. FBS 4mL, 100x 펜/스트렙 글루타민 1mL, 1M HEPES 용액 10mL, 인슐린-트랜스퍼린 셀레늄 1mL, 0.1g의 최소 필수 매체(MEM)를 보충하여 심실 심사이클도금 배지를 준비합니다. 0.2 μm 필터를 통과하고 최대 2 주 동안 4 °C에서 저장합니다. 100x 인슐린-트랜스퍼린 셀레늄, 0.1 mg/mL 소 세럼 알부민(BSA), M HEPES 용액 10mL, 100x 펜/스트렙-글루타민 1mL로 MEM 99mL을 보충하여 심실 심사이클을 유지관리하여 배지를 유지합니다. 0.2 μm 필터를 통과하고 최대 2 주 동안 4 °C에서 저장합니다. 라미닌 코팅 실험 플레이트 및 슬라이드를 준비하려면 마우스 라미닌 스톡 솔루션(1.19 mg/mL)을 해동하십시오. DMEM의 1mL에 라미닌 스톡 용액 10μL을 넣고 섞습니다. 실험용 플레이트와 슬라이드를 균등하게 코팅하고 37°C, 5% CO2 인큐베이터에 구비하여 회형을 허용하기 전에 적어도 1시간 동안 보관합니다.참고: 코팅된 실험판과 슬라이드는 최대 2일 동안 4°C로 저장할 수 있습니다. 2. 격리 장치 각 격리전에는 버블 트랩을 상단에 메우고 상단 스톱콕을 열어 70%의 세 가지 완전한 세척으로 튜브 및 기타 구성 요소를 청소하십시오. 버블 트랩을 상단에 메우고 전체 시스템 3x를 멸균 H2O로 헹구십시오(하단 스톱콕을 닫고 상단 스톱콕을 열어 두십시오). 심장 관류 버퍼로 전체 시스템을 헹구고 거품 트랩을 중간쯤에 미디어로 채웁니다. 순환 하는 수조를 37°C로 설정합니다. 37°C로 미디어에 수조를 설정합니다. 연동 펌프 튜브의 기포를 제거합니다. 연동 펌프의 유량을 3mL/분으로 조정합니다. 3. 외과 적 수술 (생존 금지) 수술 기구를 70% EtOH에 5분 이상 담가 십시오. 심장 관류 매체, 심근 세포 정지 버퍼 및 소화 완충액을 37 °C 수조에 놓습니다. 심방 심근세포 도금 매체, 심실 심낭 도금 매체 및 심실 심근세포는 37°C, 5% CO2 인큐베이터 1h에 배지를 유지하여 균형을 허용하도록 캡을 느슨하게 한다. 10주 된 남성 또는 여성 C57b6/j 마우스를 헤파린의 0.35 mL로 인산염 완충식염수(PBS)에서 100 IU/mL로 희석하여 인산염 완충식식염수체(PBS)를 주입한다. 약 10 분 동안 약물을 적용 할 수 있습니다.참고: 두 개의 하트가 이 격리 절차를 거치려면 두 번째 마우스를 마취하고 첫 번째 절차에서 이 시점에서 헤파린을 투여할 수 있습니다. 동물에 대한 스트레스를 최소화하기 위해, 가벼운 마취는 밀폐 유도 챔버에서 2 % 이소플루란 / 산소 혼합물을 사용하여 투여 할 수 있습니다. 동물을 2% 이소플루란/산소 혼합물로 마취시키고 펜토바르비탈(10 mg/mL 스톡에서 0.3mL)으로 i.p.p.를 주입한 다음, 70%의 EtOH로 헤빙하여 가슴을 준비합니다. 혼정을 관류 캐뉼라에 리로게이트할 수 있도록 5-0 실크 봉합사를 준비합니다. 수술 현미경 바로 옆에 캐뉼라 산. 먼저 중간 복부에서 턱에 이르기까지 중간 선 피부 절개를 한 다음 큰 가위로 복막에 들어가 무딘 해부로 다이어프램을 치우기으로써 가슴을 빠르게 엽니다. 그런 다음 양쪽의 측면 측면에 있는 흉벽을 잘라낸 가위를 사용하여 흉곽을 잘라냅니다. 심장과 가슴 벽 사이의 섬유성 연결을 잘라내세요 (흉선 포함). 그런 다음, 모두 함께 늑골 케이지를 잘라. 작은 집게와 가위를 사용하여 정점에 의해 심장을 부드럽게 들어 올리고 심장의 후방 측면을 노출시십시오. 오름차순 대동맥에 있는 지명 동맥에 즉시 열등하게 해부하여 심장을 절제하고 즉시 얼음 차가운 PBS 또는 차가운 심장 관류 매체에 심혼을 놓습니다. 그 후, 얼음 차가운 심장 관류 매체에 심어진 심장에서 남은 조직을 신속하게 해부하여 상승하는 대어를 노출시합니다.참고: 해부학적 랜드마크로 사용하기 위해 흉선과 함께 심을 수 있습니다. 마이크로 해부 집게와 가위를 사용하여 과잉 조직의 대어를 둘러싼 영역을 청소하십시오. 대어를 미세 한 포셉을 사용하여 캐뉼라에 배치하고 5-0 실크 봉합사로 고정하십시오.참고: 가장 좋은 배치는 일반적으로 대어타가 캐뉼라에서 약 2mm까지 연장하는 데 발생합니다. 4 분 동안 3 mL / 분의 유속으로 심장 관류 매체로 캔누클 된 심장을 퍼퓨즈하십시오. 그런 다음 심장 관류 매체에서 15.0-17.5 분 동안 소화 완충으로 미디어를 전환합니다(그림 1A).참고: 관상 동맥 유량은 효과적인 조직 소화(즉, 창백하고 부은 심장)를 나타내는 증가가능성이 높습니다. 5.4 단계에서 나중에 사용할 수 있는 관류의 마지막 분 동안 8mL의 소화 버퍼 흐름을 수집합니다. 캐뉼라에서 심장을 제거하고 60mm 플라스틱 배양 접시에 놓습니다. 과도한 조직(즉, 대어타, 정맥)을 제거하고 기계적 분리를 위해 2.5mL의 소화 완충제에 심장을 침수한다.참고: 이 시점에서, 아트리아는 해부되고, 한 실험자는 심방 세포 격리 프로토콜을 수행해야 하며, 두 번째 실험자는 심실 세포 격리를 수행해야 합니다. 4. 심방 세포 격리 및 배양 심장에서 멀리 아리아를 해부하고 30mm 플라스틱 문화 접시에 넣습니다. 기계적 분리를 위해 소화 버퍼의 0.75 mL에 침수. 심실을 60mm 접시(3.12단계)에 보관하고 별도의 절연 방법을 동시에 수행합니다(5절, 도 1B).참고: 이 시점에서, 심실은 왼쪽 과 오른쪽 세포를 격리할 필요가 있는 경우 추가 분리를 겪을 수 있습니다. 처음에는 미세 팁 수술 가위로 아티아를 잘라내고 애타게 하기 시작하고 추가 다진 미세한 집게를 선택합니다. 조직을 동요하지 말고 근육 섬유를 빠르게 분해하지 마십시오. 멸균 이송 파이펫 팁을 사용하여 조직을 15분 동안 부드럽게 혼합하고 분리합니다. 매 5 분, 10 배 객관적인 밝은 필드 현미경에서 조직에서 심방 심근 세포 분리를 관찰. 조직이 더 소화됨에 따라 멸균 이송 파이펫 팁을 사용하여 조직을 부드럽게 혼합하고 해리하여 더 작은 모공 크기로 계속 혼합하고 해리합니다. 세포 현탁액을 2mL 멸균 마이크로 원심분리기 튜브로 이송합니다. 37°C 심근세포 정지 버퍼 1의 0.75 mL로 30mm 플레이트를 헹구고 셀 서스펜션(단부 = 1.5mL)과 결합한다. 심방 근세포가 실온에서 10 분 동안 중력에 의해 퇴적물을 허용하십시오. 세포 현탁액을 부드럽게 교반하여 심낭이 원문 관의 바닥에 퇴적물을 허용하여 눈에 보이는 펠릿을 형성합니다. 20 x g에서5 분 동안 세포 현탁액을 원심 분리합니다. 심근세포가 들어 있는 상체를 조심스럽게 제거하고, 심방 근세포의 펠릿을 방해하지 않고 멸균 파이펫 팁을 사용하여 15mL 폴리프로필렌 원내 튜브로 이송한다. 원심 분리는 20,000 x g에서5 분 동안 비 근구 분획을 합니다. 10% 태아 종아리 혈청(FCS)으로 보충된 DMEM의 10mL에서 초퍼를 흡인하고 비근구체 펠릿을 재연한다. 혈류계 또는 다른 방법을 사용하여 비근구를 계산한 다음 실험적 필요에 따라 플레이트를 플레이트하거나 형광 활성화 세포분류(도 1C)를통해 개별 특정 세포 집단으로 더 격리한다. 심방 심근 세포 도금 매체의 1 mL에서 4.6 단계에서 격리 된 심방 근세포의 펠릿을 다시 중단하고 이 현탁액의 10 μL을 혈종계에 적용합니다. 필드당 막대 모양의 심근세포의 셀 카운트를 수행합니다. 미리 코팅된 실험 판/슬라이드에서 흡인 라미닌과 25 μM blebbistatin으로 보충된 심방 심근세포 도금 매체의 적절한 부피에서 격리된 심방 근세포들을 재중단한다. 실험적 요구당 원하는 밀도로플레이트(도 1C).참고: 여기에 기재된 장기 배양에 대한 전형적인 도금 밀도는 4챔버(1.7cm2)유리 슬라이드상에 5 x 105 세포/챔버이다. 5. 심실 세포 격리 및 배양 심실 조직을 잘라내고 애타게 하기 시작하고, 먼저 미세 팁 수술 가위로, 그리고 추가 다진 을 위한 미세한 집게(그림1B)를넣습니다. 근육 섬유를 빠르게 떼어내어 조직을 교반하지 마십시오. 셀 서스펜션을 15mL 폴리프로필렌 원내 튜브로 이송한다. 플레이트를 37°C 심사이클 정지 버퍼 1의 2.5mL로 헹구고 셀 서스펜션(말부 = 5mL)과 결합한다. 멸균 전달 파이펫 팁을 사용하여 조직을 4 분 동안 부드럽게 혼합하고 해리합니다. 이 셀 서스펜션의 10 μL을 슬라이드에 적용하고 막대 모양의 심근세포의 존재를 시각화하여 절연의 품질을 보장합니다. 100 μm 멸균 나일론 필터를 통해 셀 서스펜션을 50mL 폴리프로필렌 원내 튜브에 전달합니다. 3.12 단계에서 수집된 2mL의 소화 버퍼를 사용하여 멸균 나일론 필터에서 남은 세포를 씻어낸다. 실온에서 6 분 동안 중력에 의해 퇴적심 심근 세포가 퇴적할 수 있도록하십시오. 여과된 셀 현탁액을 부드럽게 교반하여 심낭이 원식 의 바닥에 퇴적물을 허용하여 눈에 보이는 펠릿을 형성합니다. 심실 심낭의 펠릿을 방해하지 않고, 상체(비근구)를 조심스럽게 제거하고 멸균 파이펫 팁을 사용하여 50mL 폴리프로필렌 원내튜브로 이송한다. 원심 분리는 20,000 x g에서5 분 동안 비 근구 분획을 합니다. 10% FCS로 보충된 DMEM의 10mL에서 초퍼를 흡인하고 비근구펠릿을 재연한다. 혈종계를 사용하여 비근구를 계산하고 10% FCS로 보충된 적절한 양의 DMEM으로 재보종합니다. 이어서, 실험적 필요에 따라 플레이트, 또는 형광 활성화 세포분류(도 1C)를통해 개별 특정 세포 집단으로 더 격리한다. 심근 세포 정지 버퍼 2의 2mL에서 격리된 심실 심근세포를 다시 중단하고 10 μL의 세포 현탁액을 혈중계에 적용한다. 필드당 막대 모양의 심근세포의 셀 카운트를 수행합니다. 단계적 패러다임을 사용하여 Ca2+ 재도입참고: 칼슘 재도입 단계는 심실 근세포에 특정하며, 세포 사멸을 초래할 것이기 때문에 심방 근구를 위해 수행되어서는 안됩니다. 심실 심근세포 현탁액에 10mM CaCl2의 50 μL을 추가합니다. 잘 섞어서 실온에서 4분 동안 인큐베이션하십시오. 심실 심근세포 현탁액에 10mM CaCl2의 50 μL을 추가합니다. 잘 섞어서 실온에서 4분 동안 인큐베이션하십시오. 심실 심근세포 현탁액에 10mM CaCl2의 100 μL을 추가합니다. 잘 섞어서 실온에서 4분 동안 인큐베이션하십시오. 심실 심근세포 현탁액에 100mM CaCl2의 80 μL을 추가합니다. 잘 섞어서 실온에서 4분 동안 인큐베이션하십시오. 플레이트 또는 슬라이드에서 라미닌 코팅을 제거하고 실험적요구(도 1C)에따라 심실 심사이클도금 배지의 적절한 부피에서 격리된 심실 근세포체를 재연한다.참고: 여기에 기재된 장기 배양에 대한 전형적인 도금 밀도는 4챔버(1.7cm2)유리 슬라이드상에 5 x 105 세포/챔버이다. 세포 과밀도가 세포 응집력을 촉진하므로 75% 이상의 응력의 밀도로 도금을 피하여 플레이트에 부착을 억제합니다. 또한, 많은 수의 세포가 첫 번째 중간 변화 중에 손실됩니다. 세포외 Ca2+가 실행 가능한 근세포의 과수축 및 손실을 촉진함에 따라 격리 후 신속하게 플레이트 셀이 있습니다. 심실 심근세포가 정착하여 적어도 1h를 붙이도록 합니다. 이어서 25 μM blebbistatin으로 보충된 매체를 유지 관리하는 심실 심근세포로 미디어를 변경합니다.참고: 심실 심근세포는 μM blebbistatin에서 도금 후 최대 96h까지 배양될 수 있습니다. 실험은 블비스타틴이 없는 경우 배지를 유지하는 심실 심근세포에서 수행되어야 한다.