心房筋細胞、心室筋細胞、および非筋細胞の同時分離と培養

本論文で報告されたマウスに関して行われたすべての研究は、SDSU制度動物のケアと使用委員会によって審査され、承認されており、国立研究評議会が発表した実験動物のケアと使用のためのガイドに準拠しています。 1. 分離・培養メディアの作成とめっき ヨクリクの変更最小必須培地(MMEM)を1Lの滅菌水に添加して、使用前に1Lの心臓灌流培地を調製します。10 N NaOHでpHを7.36に調整し、0.2 μmフィルターを通してフィルターし、4°Cで最大2週間保存します。注:ジョクリクMMEMは112 mM NaCl、5.4 mM KCl、1 mM MgCl2、9mM NaH2PO4、および11.1 mM D-グルコースで構成されています。これは10 mM HEPES(2.38 g/L)、30 mMタウリン(3.75 g/L)、2 mM D-l-カルニチン(0.4 g/L)、2 mMクレアチン、および10 mMブタンジオンモノキシム(1.01 g/L)を補充する。 灌流直前に消化バッファーを準備します: 100 mM CaCl2 の6.25 μL(ステップ1.3を参照)とコラゲラーゼタイプ2(酵素活性〜310〜310〜320 U/mg dw)で心臓灌流培地50 mLを補います。注:犠牲の前に動物の重量を量る。消化バッファーに補うコラゲザーゼ2型の量は、動物の体重(体重1g当たり2型コラゲナーゼ2mg)によって決定される。 100 mM CaCl2を準備するには、1.47 g の CaCl2 ~ 100 mL の分子生物学グレードの水を加えます。溶解するまで撹拌し、0.2 μmのフィルターを通過し、室温で最大2ヶ月間保存します。 筋細胞停止バッファー 1 を、胎児ウシ血清 (FBS) の 10 mL と 100 mM CaCl2の 125 μL で 90 mL の心臓灌流バッファーを補って準備する。0.2 μmフィルターを通過し、4 °Cで最大2週間保管します。 6 mLのFBSと10 mM CaCl2の150 μLで114mLの心臓灌流バッファーを補って、ミオサイト停止バッファー2を調製する。0.2 μmフィルターを通過し、4 °Cで最大2週間保管します。 95 mLのDulbeccoの改変イーグル培地(DMEM)を4 mLのFBS、100xペン/ストレップグルタミン1mL、100xインスリントランスフェリンセレン1mL、10μMデキサキサメゾン1mLで補充し、灌流直前に心房筋細胞メッキ培地を調製します。0.2 μmフィルターを通過し、めっきするまで37°Cで保管します。 FBSの4 mL、100xペン/ストレパプタミンの1mL、1M HEPES溶液の10mL、100xインスリントランスフェリンセレンの1mL、ブタネジョンモノメの0.1 gで最低必須培地(MEM)の95 mLを補うことによって心室筋細胞めっき培地を準備する。0.2 μmフィルターを通過し、4 °Cで最大2週間保管します。 100xインスリントランスフェリンセレン、0.1 mg/mLウシ血清アルブミン(BSA)、1M HEPES溶液10mの10mLおよび100xペン/ストレップグルタミンの1mLでMEMの99 mLを補うことによって、心室筋細胞維持培地を準備する。0.2 μmフィルターを通過し、4 °Cで最大2週間保管します。 ラミニンコーティング実験プレートおよびスライドを調製するために、マウスラミニンストック溶液(1.19mg/mL)を解凍します。DMEMの1 mLごとに10μLのラミニンストック溶液を加え、混合します。実験プレートとスライドを均等にコーティングし、37°C、5%CO2インキュベーターに少なくとも1時間、灌流前に保存して平衡を可能にします。注:コーティングされた実験プレートとスライドは、最大2日間4°Cで保存することができます。 2. 絶縁装置 各分離の前に、バブルトラップを上部に充填して70%EtOHの3回の完全な洗浄でシステムのチューブやその他のコンポーネントを清掃します(下のストップコックを閉じて、トップストップコックを開いたままにします)。 バブルトラップを上部に充填して、完全なシステム3xを滅菌H2Oでリンスします(底栓を閉じて、トップストップコックを開いたままにします)。 心臓灌流バッファーで完全なシステムをすすい出し、媒体で途中でバブルトラップを埋めます。 循環水浴を37°Cに設定します。 37°Cにメディア用の水浴を設定します。 蠕動ポンプチューブ内の気泡を取り除く。 蠕動ポンプの流量を3 mL/minに調整します。 3. 外科手術(非生存) 手術器具を少なくとも5分間、70%のEtOHに浸す。 心臓灌流媒体、筋細胞停止バッファー、及び消化バッファーを37°Cの水浴に入れる。 心房筋細胞メッキ媒体、心室筋細胞めっき媒体、心室筋細胞メッキ培地、心室筋細胞維持培地を37°Cに入れ、5%CO2インキュベーターを使用する1時間前にカプセルを緩め、均衡を可能にしてキャップを緩める。 10週齢の雄または雌のC57b6/jマウスを腹腔内(i.p.)に0.35mLのヘパリンで注入し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で100 IU/mLに希釈する。約10分間効果を出します。注:2つの心臓がこの分離手順を受ける場合、第2のマウスは、最初の手順のこの時点で麻酔および投与ヘパリンすることができる。動物のストレスを最小限に抑えるために、気密シール誘導室で2%イオフルラン/酸素混合物を使用して軽麻酔を投与することができる。 2%のイオフルラン/酸素混合物で動物を麻酔し、ペントバルビタール(10 mg/mLストックから0.3 mL)でi.p.を注入し、70%のEtOHでスワッピングして胸を準備します。 結ばれた5-0シルク縫合糸を準備して、心臓を輸血カニューレに合う準備をします。外科顕微鏡のすぐ隣にカニューレを取り付ける。 最初に中腹部から顎まで中腹部を切開し、大きなはさみで腹膜に入り、鈍い解剖によって横隔膜を取り除くことによって、すぐに胸を開く。その後、両側の側面の胸壁を切り取って、はさみを使用してリブケージを切り取ります。 心臓と胸壁(胸腺を含む)の間の線維性の接続を切り取る。その後、リブケージをすべて一緒に切り取ります。小さな鉗子とはさみを使用して、心を頂点でそっと持ち上げ、心臓の後部側面を露出させる。 上流大動脈の分母にすぐ劣った動脈を解剖することによって心臓を外に出し、すぐに氷冷PBSまたは冷たい心臓灌流媒体に心臓を置く。その後、氷冷心臓灌流媒体中の外植心臓から残りの組織を素早く解剖し、上昇大起を露出させる。注:解剖学的ランドマークとして使用するには、胸腺をそのままにして心臓を植え出すのに便利です。 過剰組織の大器官の周囲を、マイクロ解剖鉗子とはさみを使用して清掃します。細かい先端の鉗子を使用してカニューレに大オルタを置き、5-0シルク縫合糸で固定します。注意:最良の配置は、通常、大オルタがカニューレの上に約2mm伸びて発生します。 3 mL/minの流量で心の透過媒体を4分間、カニュード心臓に浸透させます。次に、メディアを心臓灌流メディアから、15.0~17.5分間の消化バッファーに切り替えます(図1A)。注:冠動脈流量が増加する可能性が高く、効果的な組織消化(すなわち、青白く、腫れた心臓)を示す。 ステップ5.4で後で使用するために、灌流の最後の分の間に消化バッファーの流れの8 mLを収集します。 カニューレから心臓を取り出し、60mmのプラスチック文化皿の上に置きます。過剰な組織(大器官、静脈)を除去し、機械的分離に備えて2.5mLの消化バッファーで心臓を沈下する。注:この時点で、心房は解剖され、1人の実験者が心房細胞分離プロトコルを実施し、2人目の実験者は心室細胞分離を行うべきです。 4. 心房細胞の分離と培養 心臓から離れてアトリアを解剖し、30ミリメートルのプラスチック文化皿に置きます。機械的分離のために0.75 mLの消化バッファーに沈める。60 mm皿(ステップ3.12)に心室を入れておき、分離方法を同時に実行します(セクション5、図1B)。注:この時点で、心房と心室は、左側および右側の細胞を分離する必要がある場合、さらなる分離を受けることができます。 最初は細かい先端の外科用ハサミで、さらにミンチのための細かい鉗子が続いて、離れてアトリアをミンチといじめ始めます。組織を攪拌することを避け、そして急速に筋線維を引き離さない。 無菌転移ピペットチップを使用して、15分間組織を穏やかに混合し、解体し続けます。5分ごとに、10倍の目的の明視野顕微鏡下で組織から心房筋細胞の解離を観察する。組織がさらに消化されるようになるにつれて、小さな細孔サイズで無菌転写ピペットチップを使用して組織を穏やかに混合し、解離し続けます。 細胞懸濁液を2 mLの無菌マイクロ遠心分離チューブに移す。30 mmプレートを0.75 mLの37°Cの筋細胞停止バッファー1でリンスし、セル懸濁液(エンドボリューム= 1.5 mL)と組み合わせます。 心房筋細胞を室温で10分間重力で沈下させます。細胞懸濁液を穏やかに攪拌し、筋細胞が円錐形チューブの底まで沈み込み、目に見えるペレットを形成するようにします。 20 x gで 5 分間の細胞懸濁液を遠心分離します。非筋細胞を含む上清を慎重に除去し、心房筋細胞のペレットを乱すことなく滅菌ピペットチップを使用して15 mLポリプロピレンコニカルチューブに移す。 遠心分離術非筋細胞分率は、20,000 x gで5分間.上清を吸引し、10%の胎児の子牛血清(FCS)を補充したDMEMの10 mLで非筋細胞ペレットを再懸濁する。 血球計または他の方法を用いて非筋細胞を数え、次に実験の必要性に従ってプレート、または蛍光活性化細胞分類を介して個々の特定細胞集団にさらに単離する(図1C)。 心房筋細胞メッキ培地のステップ4.6から1mLの分離された心筋細胞のペレットを再懸濁し、この懸濁液の10μLを血球計に塗布する。棒状の筋細胞の細胞数をフィールドごとに実行します。 予備コーティングされた実験プレート/スライドからラミニンを吸引し、25 μMブレビスタチンを添加した心房筋細胞メッキ培地の適切な体積で単離された心房筋細胞を再中断する。実験ニーズに応じて所望の密度でプレート(図1C)。注:ここで説明する長期培養のための典型的なめっき密度は、4つのチャンバ(1.7 cm2)ガラススライド上の5 x 105細胞/チャンバーです。 5. 心室細胞の分離と培養 最初に細かい先端の外科用ハサミで心臓をミンチといじめ、さらにミンチのための細かい鉗子を始める(図1B)。急速に筋線維を引き離すことによって組織を攪拌を避けます. セル懸濁液を15 mLポリプロピレンコニカルチューブに移します。プレートを37°Cのミオサイト停止バッファー1の2.5 mLでリンスし、セル懸濁液(エンドボリューム= 5 mL)と組み合わせます。 滅菌転移ピペットチップを使用して、4分間組織を穏やかに混合し、解体し続けます。この細胞懸濁液の10 μLをスライドに塗布し、棒状の筋細胞の存在を可視化して、分離の質を確保します。 100 μmの無菌ナイロンフィルターを通して、50 mL ポリプロピレン製の円錐形チューブにセル懸濁液を通します。手順3.12で収集した消化バッファーの2 mLを使用して、残りの細胞を滅菌ナイロンフィルターから洗い流します。 心室筋細胞を室温で6分間重力で沈下させます。濾過された細胞懸濁液を穏やかに攪拌し、筋細胞が円錐の底に沈み込み、目に見えるペレットを形成することを可能にする。 心室筋細胞のペレットを乱すことなく、上清(非筋細胞)を慎重に除去し、滅菌ピペットチップを使用して50 mLポリプロピレンコニカルチューブに移します。遠心分離術非筋細胞分率は、20,000 x gで5分間.上清を吸引し、非ミオサイトペレットを10Sで補ったDMEMの10mLで再懸濁する。 血球計を使用して非筋細胞をカウントし、10%のFCSを補充したDMEMの適切な量で再中断します。そして、実験ニーズに応じたプレート、又は蛍光活性化細胞分類を介して個々の特異的細胞集団にさらに単離する(図1C)。 2 mLの筋細胞停止バッファー2で分離した心室筋細胞を再懸濁し、10 μLの細胞懸濁液を血球計に塗布する。棒状の筋細胞の細胞数をフィールドごとに実行します。 ステップワイズパラダイムを用いたCa2+ の再導入注:カルシウム再導入ステップは心室筋細胞に特異的であり、細胞死をもたらすため、心房筋細胞に対しては行うべきではない。 50 μLの 10 mM CaCl2 を心室筋細胞懸濁液に加えます。よく混ぜて、室温で4分間インキュベートします。 さらに50 μLの10 mMCaCl2 を心室筋細胞懸濁液に加えます。よく混ぜて、室温で4分間インキュベートします。 10 mM CaCl2 の 100 μL を心室筋細胞懸濁液に追加します。よく混ぜて、室温で4分間インキュベートします。 心室筋細胞懸濁液に80μLの100 mMCaCl2 を加えます。よく混ぜて、室温で4分間インキュベートします。 プレートまたはスライドからラミニンコーティングを除去し、実験的ニーズに応じて適切な量の心室筋細胞めっき媒体で孤立した心室筋細胞を再中断する(図1C)。注:ここで説明する長期培養のための典型的なめっき密度は、4つのチャンバ(1.7 cm2)ガラススライド上の5 x 105細胞/チャンバーです。75%以上の密度でめっきを避け、細胞過緻密化が細胞の凝集を促進し、それによってプレートへの付着を阻害するように。さらに、最初の中規模の変化の間に多数の細胞が失われます。細胞外Ca2+が過剰収縮および生存可能な筋細胞の喪失を促進するので、細胞は単離後に素早く細胞を培養する。 心室筋細胞が少なくとも1時間沈着するようにします。その後、25 μM ブレビスタチンを添加した培地を維持する心室筋細胞にメディアを変更します。注意:心室筋細胞はμMブレビスタチンでめっきした後96時間まで培養することができる。ブレビスタチンがない場合に心室筋細胞維持培地で実験を行う必要があります。