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생물학

Isolamento simultâneo e cultura de miócitos atrial, miócitos ventriculares e não-miócitos de um coração de rato adulto

Published: June 14, 2020
doi:
10.3791/61224
, , , ,
1San Diego State University Heart Institute and the Department of Biology,San Diego State University

Summary

Um método é descrito para o isolamento simultâneo de miócitos e não miócitos tanto da atria quanto dos ventrículos de um único coração de rato adulto. Este protocolo resulta em rendimentos consistentes de miócitos cardíacos altamente viáveis e não miócitos e detalha condições ideais de cultura específica celular para fenotipagem e análise in vitro.

Abstract

O isolamento e o cultivo de miócitos cardíacos de camundongos tem sido essencial para promover a compreensão da fisiologia cardíaca e da fisiopatologia. Embora isolar miócitos de corações de camundongos neonatais seja relativamente simples, os miócitos do coração murino adulto são preferidos. Isso porque, em comparação com as células neonatais, os miócitos adultos recapitulam a função celular como ocorre no coração adulto in vivo. No entanto, é tecnicamente difícil isolar miócitos cardíacos de camundongos adultos nas quantidades e viabilidade necessárias, o que contribui para um impasse experimental. Além disso, os procedimentos publicados são específicos para o isolamento de miócitos atrial ou ventricular em detrimento de células não miócitos atrial e ventricular. Descrito aqui é um método detalhado para isolar miócitos cardíacos atrial e ventricular, juntamente com não miócitos atrial e ventricular, simultaneamente de um único coração de rato. Também são fornecidos os detalhes para métodos de cultivo específicos para células ideais, que melhoram a viabilidade e a função celular. Este protocolo visa não apenas acelerar o processo de isolamento de células cardíacas murinas adultas, mas também aumentar o rendimento e a viabilidade das células para investigações de células cardíacas atrial e ventricular.

Introduction

A cultura celular primária é um recurso integral que oferece um ambiente controlado para estudos mecanicistas detalhados da função miócito cardíaco. Devido à sua natureza mais durável e facilidade de isolamento, os miócitos auriculares e ventriculares de ratos neonatais têm sido a fonte comum dessas culturas celulares1. No entanto, miócitos atrial e ventricular adultos (AMAMs e AMVMs) são altamente desejáveis para estudos in vitro, pois suas características moleculares e funcionais imitam melhor as das células cardíacas adultas. Assim, tornaram-se relevantes para estudos relacionados a patologias cardíacas, a maioria dos quais se desenvolvem em adultos2.

Além disso, a disponibilidade e o uso de modelos transgênicos e de camundongos doenças amplia a utilidade de miócitos cardíacos adultos isolados. Protocolos de isolamento e cultura de AMVMs de camundongos para estudos de curto e longo prazo foram descritos em inúmeras publicações anteriores2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Em comparação, poucos protocolos foram descritos para o isolamento das AMAMs. Além disso, aqueles descritos são principalmente otimizados para estudos agudos de células recém-isoladas, sem protocolo de cultivo de longo prazo descrito até as11,12,13. Como tal, os protocolos de isolamento da AMAM não foram projetados para fornecer a utilidade e versatilidade dos protocolos publicados para o isolamento e cultura das AMVMs. Além disso, embora os estudos pioneiros para o isolamento de AMAMs e AMVMs tenham se mostrado engenhosos, não há protocolos para o isolamento e cultura simultâneos ideais tanto de AMAMs quanto de AMVMs, o que resulta em uso eficiente de todo o coração para cada preparação.

Até agora, os protocolos de isolamento amam e AMVM publicados não foram projetados para o isolamento simultâneo de ambos os tipos de células, pois a maioria dos estudos sobre função atrial e ventricular tem um foco específico da câmara. Por exemplo, os AMAMs são usados predominantemente para estudar eletrofisiologia mócito atrial, em parte devido ao interesse em fibrilação atrial (AF), a arritmia cardíaca mais comum nos EUA. No entanto, a AF não é uma doença que afeta a ária isoladamente, e tem sido implicada como tendo um papel causador em disfunção ventricular leve a grave esquerda14. Além disso, eletrocardiogramas de pacientes com insuficiência cardíaca com fração de ejeção preservada (HFpEF) ilustraram que o tamanho atrial esquerdo é um dos preditores mais fortes para a suscetibilidade à insuficiência cardíaca15.

Além de seu papel na eletrofisiologia e contrailidade, o átrio também é um órgão endócrino, segregando cardiocinas (ou seja, peptídeo natriurético atrial [ANP]) que regulam homeostaticamente a pressão arterial e o volume16,17. Além disso, a ANP (presumivelmente de miócitos atrial) tem um papel protetor e anti-hipertrófico proeminente nos miócitos ventriculares16,17. Embora exista uma forte implicação da comunicação neurohormonal entre atria e ventrículos em vários estados da doença, os mecanismos subjacentes a essa comunicação não foram totalmente explorados. Este ponto é ainda mais exemplificado pelo aumento das pesquisas com foco em 1) o papel dos não miócitos (especificamente fibroblastos cardíacos e células imunes) no coração doente e 2) como a remodelação cardíaca em função da doença afeta diretamente a viabilidade do miócito cardíaco e a função cardíaca global18,19,20,21,22. Assim, estudar células cardíacas tanto de atria quanto de ventrículos é uma abordagem necessária para obter uma imagem mais completa de seus papéis na fisiopatologia cardíaca.

O protocolo a seguir descreve o isolamento simultâneo de miócitos atrial e ventricular e não miócitos de um único coração de camundongos sob condições fisiológicas e fiofosiológicas. Além disso, este método é o primeiro a descrever as condições ideais necessárias para a manutenção de culturas de miócitos cardíacos atrial, pois já foram publicadas condições para a manutenção de culturas de miócitos ventriculares.

Protocol

Todas as pesquisas realizadas em camundongos relatadas neste artigo foram revisadas e aprovadas pelo Comitê Institucional de Atenção e Uso de Animais da SDSU e estão em conformidade com o Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicado pelo Conselho Nacional de Pesquisa. 1. Preparação de mídia de isolamento e cultura e chapeamento Prepare 1 L de mídia de perfusão cardíaca antes de ser usada adicionando joklik modificado mínimo de mídia essencial (MMEM) a 1 L de água estéril. Ajuste o pH para 7,36 com NaOH de 10 N, depois filtre através de um filtro de 0,2 μm e armazene a 4 °C por até 2 semanas.NOTA: Joklik MMEM é composto por 112 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1 mM MgCl2, 9 mM NaH2PO4e 11,1 mM D-glicose. Este é suplementado com HEPES de 10 mM (2,38 g/L), taurina de 30 mM (3,75 g/L), 2 mM D-l-carnitina (0,4 g/L), creatina de 2 mM e monoxime butanedione de 10 mM (1,01 g/L). Prepare o tampão de digestão pouco antes da perfusão, da seguinte forma: suplementar 50 mL de mídia de perfusão cardíaca com 6,25 μL de 100 mM CaCl2 (ver passo 1.3) e colagenase tipo 2 (atividade enzimática ~310-320 U/mg dw).NOTA: Pesar o animal antes do sacrifício. A quantidade de colagenase tipo 2 suplementada no tampão de digestão é ditada pelo peso do animal (2,25 mg de colagenase tipo 2 por 1 g de peso corporal). Para preparar 100 mM CaCl2, adicione 1,47 g de CaCl2 a 100 mL de água de grau de biologia molecular. Mexa até dissolver, depois passe por um filtro de 0,2 μm e guarde em temperatura ambiente por até 2 meses. Prepare o tampão de parada de micócito 1 suplementando 90 mL de tampão de perfusão cardíaca com 10 mL de soro bovino fetal (FBS) e 125 μL de 100 mM CaCl2. Passe por um filtro de 0,2 μm e armazene a 4 °C por até 2 semanas. Prepare o tampão de parada de miócito 2 suplementando 114 mL de tampão de perfusão cardíaca com 6 mL de FBS e 150 μL de 10 mM CaCl2. Passe por um filtro de 0,2 μm e armazene a 4 °C por até 2 semanas. Prepare o meio de revestimento de miócito atrial pouco antes da perfusão, suplementando 95 mL do meio Eagle modificado (DMEM) modificado de Dulbecco com 4 mL de FBS, 1 mL de caneta/estreptococo-glutamina, 1 mL de 100x de insulina-transferrina-selênio, e 1 mL de 10 μM de dexamona. Passe por um filtro de 0,2 μm e armazene a 37 °C até emplacamento. Prepare o meio de revestimento ventricular de miócito suplementando 95 mL de meio essencial mínimo (MEM) com 4 mL de FBS, 1 mL de caneta/estreptococo-glutamina, 10 mL de solução HEPES de 1 M, 1 mL de insulina-transferrina-senium 100x e 0,1 g de monoxeno de butanedion. Passe por um filtro de 0,2 μm e armazene a 4 °C por até 2 semanas. Prepare o micócito ventricular mantendo o meio, suplementando 99 mL de MEM com 1 mL de insulina-transferrina-selênio, 0,1 mg/mL de soro bovino albumina (BSA), 10 mL de solução HEPES de 1 M e 1 mL de caneta/estreptococo-glutamina. Passe por um filtro de 0,2 μm e armazene a 4 °C por até 2 semanas. Para preparar placas experimentais e slides revestidos de laminina, descongele a solução de estoque de laminina do rato (1,19 mg/mL). Adicione 10 μL de solução de estoque de laminina a cada 1 mL de DMEM e misture. Cubra placas experimentais e deslizes uniformemente e armazene em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2 por pelo menos 1 h antes da perfusão para permitir o equilíbrio.NOTA: Placas e lâminas experimentais revestidas podem ser armazenadas a 4 °C por até 2 dias. 2. Aparelho de isolamento Antes de cada isolamento, limpe o tubo e outros componentes do sistema com três lavagens completas de 70% de EtOH preenchendo a armadilha de bolhas até o topo (feche a torneira inferior e mantenha a torneira superior aberta). Enxágüe o sistema completo 3x com H2O estéril preenchendo a armadilha de bolhas até o topo (feche a torneira inferior e mantenha a torneira superior aberta). Enxágüe o sistema completo com tampão de perfusão cardíaca e encha a armadilha da bolha no meio do caminho com a mídia. Coloque o banho de água circulante para 37 °C. Coloque um banho de água para a mídia a 37 °C. Remova quaisquer bolhas de ar na tubulação da bomba peristáltica. Ajuste a taxa de fluxo da bomba peristáltica para 3 mL/min. 3. Procedimento cirúrgico (não sobrevida) Mergulhe instrumentos cirúrgicos em 70% EtOH por pelo menos 5 min. Coloque a mídia de perfusão do coração, os tampões de parada do miócito e o tampão de digestão no banho de água de 37 °C. Coloque o meio de revestimento de miócito atrial, o meio de revestimento do miócito ventricular e o mócito ventricular mantendo o meio em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2 1h antes do uso e solte as tampas para permitir o equilíbrio. Injete camundongos C57b6/j machos ou fêmeas de 10 semanas de idade intraperitoneally (i.p.) com 0,35 mL de heparina, diluídos em soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) a 100 UI/mL. Deixe a droga fazer efeito por cerca de 10 minutos.NOTA: Se dois corações forem submetidos a este procedimento de isolamento, o segundo rato pode ser anestesiado e administrado heparina neste momento no primeiro procedimento. Para minimizar o estresse no animal, a anestesia leve pode ser administrada usando 2% de mistura isoflurane/oxigênio em uma câmara de indução hermeticamente selada. Anestesiar o animal com uma mistura de isoflurano/oxigênio de 2% e injetar i.p. com pentobarbital (0,3 mL a partir de 10 mg/mL de estoque), em seguida, preparar o peito esfregando com 70% de EtOH. Prepare uma sutura de seda 5-0 amarrada para estar pronto para ligar o coração à cânula de perfusão. Montar cânula ao lado do microscópio cirúrgico. Abra rapidamente o peito fazendo primeiro uma incisão de pele média, do meio do abdômen até a mandíbula, depois entrando no peritônio com a tesoura grande, limpando o diafragma por dissecção contundente. Em seguida, corte a caixa torácica usando a tesoura com cortes na parede do peito no aspecto lateral de ambos os lados. Corte as conexões fibrosas entre o coração e a parede do peito (incluindo o timo). Então, cortem a caixa torácica todos juntos. Usando as pequenas fórceps e tesouras, levante suavemente o coração pelo ápice e exponha o aspecto posterior do coração. Explane o coração dissecando imediatamente inferior à artéria innominada na aorta ascendente e coloque imediatamente o coração em PBS gelado ou mídia de perfusão de coração frio. Posteriormente, disseco rapidamente o tecido remanescente do coração explantado em meios de perfusão de coração gelado, expondo a aorta ascendente.NOTA: É útil explanar o coração com o timo intacto para usar como um marco anatômico. Limpe a área ao redor da aorta do excesso de tecido usando fórceps e tesouras micro-dissecando. Posicione a aorta sobre a cânula usando fórceps finos e fixe com uma sutura de seda 5-0.NOTA: A melhor colocação geralmente ocorre com a aorta estendendo cerca de 2 mm acima da cânula. Perfunda o coração cânulado com mídia de perfusão cardíaca a uma taxa de fluxo de 3 mL/min por 4 min. Em seguida, mude a mídia da mídia de perfusão cardíaca para o tampão de digestão por 15,0-17,5 min de perfusão(Figura 1A).NOTA: A vazão coronariana provavelmente aumentará, indicando uma digestão eficaz do tecido (ou seja, coração pálido e inchado). Colete 8 mL de fluxo de tampão de digestão durante os minutos finais de perfusão para uso posterior na etapa 5.4. Retire o coração da cânula e coloque-o em um prato de cultura de plástico de 60 mm. Remova o excesso de tecido (ou seja, aorta, veias) e submerse o coração em 2,5 mL de tampão de digestão em preparação para separação mecânica.NOTA: Neste ponto, os atrias são dissecados, e um experimentador deve conduzir o protocolo de isolamento de células atrial, enquanto um segundo experimentador deve realizar o isolamento da célula ventricular. 4. Isolamento e cultura de células atrial Disseca a atria longe do coração e coloque-a em um prato de cultura plástica de 30 mm. Submergir em 0,75 mL de tampão de digestão para separação mecânica. Mantenha os ventrículos na lousa de 60 mm (etapa 3.12) e realize os métodos de isolamento separados simultaneamente (seção 5, Figura 1B).NOTA: Neste ponto, os atria e ventrículos podem sofrer uma separação adicional caso haja necessidade de isolar as células do lado esquerdo e direito. Comece a picar e provocar a atria à parte, inicialmente com uma tesoura cirúrgica de ponta fina e seguida de fórceps finos para mais picar. Evite agitar o tecido e não retire rapidamente as fibras musculares. Usando uma ponta de pipeta de transferência estéril, continue a misturar suavemente e dissociar o tecido por 15 minutos. A cada 5 minutos, observe a dissociação do miócito atrial do tecido sob um microscópio de campo brilhante objetivo de 10x. À medida que o tecido se torna mais digerido, continue misturando suavemente e dissociando tecido usando uma ponta de pipeta de transferência estéril com um tamanho menor de poros. Transfira a suspensão celular para um tubo microcrífrífugo estéril de 2 mL. Enxágüe a placa de 30 mm com 0,75 mL de 37 °C de tampão de parada de miócito 1 e combine com a suspensão celular (volume final = 1,5 mL). Permita que os miócitos atrial sedimentem por gravidade por 10 minutos à temperatura ambiente. Agitar suavemente a suspensão celular para permitir que os miócitos se sedimentem até o fundo do tubo cônico, formando uma pelota visível. Centrifugar a suspensão celular por 5 min a 20 x g. Remova cuidadosamente o supernasce, que contém os não miócitos, e transfira para um tubo cônico de polipropileno de 15 mL usando uma ponta de pipeta estéril sem perturbar a pelota de miócitos atrial. Centrifugar a fração não-miócito por 5 min a 20.000 x g. Aspire o supernasal e resuspenda a pelota não mióclito em 10 mL de DMEM suplementada com soro de bezerro fetal de 10% (FCS). Conte os não miócitos usando um hemócito ou outro método, em seguida, plaque como por necessidades experimentais, ou isole-se ainda mais em populações celulares específicas individuais através de classificação celular ativada por fluorescência(Figura 1C). Resuspend a pelota de miócitos atrial isolados da etapa 4.6 em 1 mL de meio de revestimento de miócito atrial e aplicar 10 μL desta suspensão em um hemócito. Realize uma contagem de células de miócitos em forma de vara por campo. Laminina aspirada a partir de placas/slides experimentais pré-revestidos e resuspensa os miócitos atrial isolados no volume apropriado de myocyte médio atrial complementado com blebbistatina de 25 μM. Placa na densidade desejada por necessidades experimentais(Figura 1C).NOTA: A densidade típica de revestimento para a cultura de longo prazo descrita aqui é 5 x 105 células/câmara em lâminas de vidro de quatro câmaras (1,7 cm2). 5. Isolamento e cultura celular ventricular Comece a picar e provocar o coração além do tecido ventricular, primeiro com uma tesoura cirúrgica de ponta fina e seguido de fórceps finos para mais picar(Figura 1B). Evite agitar o tecido, retirando rapidamente as fibras musculares. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de polipropileno de 15 mL. Enxágüe a placa com 2,5 mL de 37 °C de tampão de parada de miócito 1 e combine com a suspensão celular (volume final = 5 mL). Usando uma ponta de pipeta de transferência estéril, continue a misturar suavemente e dissociar o tecido por 4 minutos. Aplique 10 μL desta suspensão celular no slide e visualize a presença de miócitos em forma de vara para garantir a qualidade do isolamento. Passe a suspensão da célula através de um filtro de nylon estéril de 100 μm em um tubo cônico de polipropileno de 50 mL. Use 2 mL de tampão de digestão coletado na etapa 3.12 para lavar todas as células restantes do filtro de nylon estéril. Permita que os miócitos ventriculares sedimentem por gravidade por 6 minutos à temperatura ambiente. Agitar suavemente a suspensão celular filtrada para permitir que os miócitos se sedimentem na parte inferior do cônico, formando uma pelota visível. Sem perturbar a pelota de miócitos ventriculares, remova cuidadosamente os supernaciantes (não miócitos) e transfira para um tubo cônico de polipropileno de 50 mL usando uma ponta de pipeta estéril. Centrifugar a fração não-miócito por 5 min a 20.000 x g. Aspire o supernasal e resuspenda a pelota não mióctil em 10 mL de DMEM complementada com 10% de FCS. Conte os não miócitos usando um hemócito e resuspend em um volume apropriado de DMEM complementado com 10% de FCS. Em seguida, a placa de acordo com as necessidades experimentais, ou isolar-se ainda mais em populações celulares específicas individuais através da triagem celular ativada por fluorescência(Figura 1C). Resuspend os miócitos ventriculares isolados em 2 mL de tampão de parada de miócito 2 e aplique 10 μL de suspensão celular no hemócito. Realize uma contagem de células de miócitos em forma de vara por campo. Reintrodução do Ca2+ usando um paradigma stepwiseNOTA: As etapas de reintrodução de cálcio são específicas para miócitos ventriculares e não devem ser realizadas para miócitos atrial, pois isso resultará em morte celular. Adicione 50 μL de 10 mM CaCl2 à suspensão da célula de miócito ventricular. Misture bem e incubar por 4 minutos em temperatura ambiente. Adicione um adicional de 50 μL de 10 mM CaCl2 à suspensão da célula de miócito ventricular. Misture bem e incubar por 4 minutos em temperatura ambiente. Adicione um adicional de 100 μL de 10 mM CaCl2 à suspensão da célula de miócito ventricular. Misture bem e incubar por 4 minutos em temperatura ambiente. Adicione 80 μL de 100 mM CaCl2 à suspensão da célula de miócito ventricular. Misture bem e incubar por 4 minutos em temperatura ambiente. Remova o revestimento de laminina de placas ou slides e resuspenque os miócitos ventriculares isolados em um volume apropriado de meio de revestimento de miócito ventricular de acordo com as necessidades experimentais(Figura 1C).NOTA: A densidade típica de revestimento para a cultura de longo prazo descrita aqui é 5 x 105 células/câmara em lâminas de vidro de quatro câmaras (1,7 cm2). Evite o revestimento a uma densidade superior a 75% de confluência, pois o excesso de adensamento celular promove a aglomeração celular, inibindo assim o apego à placa. Além disso, um grande número de células será perdida durante a primeira mudança média. As células da placa rapidamente após o isolamento, como o Ca2+ extracelular promove a hipercontratação e a perda de miócitos viáveis. Permita que os miócitos ventriculares se acomodem e aderam por pelo menos 1h. Posteriormente, mude a mídia para miócito ventricular mantendo o meio suplementado com blebbistatina de 25 μM.NOTA: Os miócitos ventriculares podem ser cultivados até 96 h após o revestimento em blebbistatina μM. Experimentos devem ser realizados em mócito ventricular mantendo o meio na ausência de blebbistatin.

Representative Results

Um coração de rato C57b6/j de 10 semanas de idade normalmente resulta entre 75.000-150.000 miócitos atrial e 1,0-1,5 x 106 miócitos ventriculares, equiparando-se a um rendimento aproximado de 30%-50% para miócitos atrial e ventricular18,19. Durante e imediatamente após os isolamentos, os miócitos cardíacos viáveis devem aparecer em forma de vara e não contraindo. A maioria dos miócitos cardíacos isolados deve adaptar essa morfologia, o que é uma indicação de perfusão eficaz. A morfologia em forma de vara também pode ser um preditor de viabilidade. O protocolo visa aumentar o rendimento e a viabilidade de miócitos e não miócitos isolados de um coração de camundongo doente. Além disso, foi testado em um modelo de insuficiência cardíaca induzida por sobrecarga de pressão (dados não mostrados). Para confirmar o isolamento adequado e replicável de miócitos e não miócitos do tecido atrial e ventricular, as células foram observadas e fotografadas em vários dias de cultura(Figura 2). Além disso, foi realizada uma reação quantitativa em cadeia de polimerase de transcrição reversa (qRT-PCR) para medir os níveis de transcrições específicas do tipo celular. Troponina muscular cardíaca T(Tnnt2) é um marcador de miócitos cardíacos e foi fortemente expressa nas culturas de miócito cardíaco atrial e ventricular(Figura 3A). Em contraste, o peptídeo natriurético atrial(Nppa, que é tipicamente expresso exclusivamente em miócitos cardíacos atrial adultos sob condições fisiológicas) e a cadeia de luz da miosina 2(Myl2, que é um gene específico do miócito ventricular) foram robustamente e especificamente expressos nas culturas miócitos cardíacos atrial e ventricular, respectivamente (Figura 3B,C). Os marcadores fibroblastos, o fator de transcrição21 (Tcf21),o receptor de fator de crescimento derivado de plaquetas A(Pdgfra)e o aglomerado de marcadores celulares derivados do monocito de diferenciação 68(Cd68)foram expressos exclusivamente em culturas não miócidas isoladas tanto das câmaras atrial quanto ventricular(Figura 3D F). Estima-se que os não miócitos comprometam ~65% de todas as células cardíacas e que a maioria delas se origina de uma linhagem fibroblasto ou monocite derivado18,19,23,24. Assim, foram escolhidos marcadores para essas duas linhagens para serem representativos, dado o interesse dessas populações celulares em estudos de diversos modelos e etiologias da patologia cardíaca. Imunostaining de AMAMs e AMVMs para o marcador t-tubule dihydropyridine (DHPR, que é um canal de cálcio dependente de tensão (L)) bem como o receptor de ryanodo (RYR2) demonstrou t-tubules intactos em todo o isolamento e cultura de longo prazo(Figura 4A,B). A abundância de DHPR e localização característica e única aos miócitos atrial e ventricular indicaram as presenças de t-tules. Além disso, a colocalização da DHPR com a imunostaining RYR2 foi um indicador de estruturas diádicas intactas. Imunostaining para a proteína sarcomerica alfa-actinina em miócitos cardíacos atrial e ventricular resultou no padrão de estriação sarcomeric esperado. O padrão de estriação sarcomerica foi utilizado para avaliar a pureza e a viabilidade de miócitos cardíacos isolados em conjunto com a forma morfológica em forma de vara e a coloração nuclear com TOPRO-3 (Figura 4C,D; roxo e vermelho). Como esperado, os miócitos cardíacos ventriculares eram grandes, exibindo um comprimento médio de ~150 mm, enquanto os miócitos cardíacos atrial mediam ~75 mm. Além disso, após análise imunostaining, miócitos cardíacos atrial (mas não miócitos cardíacos ventriculares) apresentaram expressão robusta de peptídeo natriurético atrial (ANP) em um padrão de coloração característico da localização para os grânulos endoplasmáticos reticulum e secretory(Figura 4C,D; verde). Uma característica única dos miócitos cardíacos atrial é sua classificação como uma célula endócrina, além da célula contratil. Enquanto os miócitos atrial secretam a ANP em condições basais, a secreção aumenta em resposta aos secretagogues (ou seja, o agonista alfa-adrenérgico, fenilefrina [PE]). Além disso, os miócitos cardíacos atrial secretam a ANP e processam co-secrecionáriamente uma porção do hormônio desde seu estado precursor (Pro-ANP, 15 kD) até o peptídeo do produto (ANP 3kD)16,17. Essa capacidade secreta pode ser quantificada através da detecção de imunobloto da ANP na mídia de miócitos cardíacos atrial isolados em resposta ao tratamento agudo de PE(Figura 4E). Esta capacidade secreta e de processamento do miócito cardíaco atrial foi considerada sensível às condições de cultivo. Assim, é imperativo que o meio de revestimento de miócito atrial seja suplementado com dexametasona, insulina, transferrina e selênio. Figura 1: Visão geral esquemática da perfusão cardíaca retrógrada, digestão e isolamento celular. São mostrados os principais passos envolvidos no isolamento celular de câmaras atrial e ventricular simultaneamente a partir de um único coração de rato. (A) Um único coração de rato é rapidamente cânulado através da aorta ascendente e perfundido de forma retrógrada. (B) O coração é separado em tecidos atrial e ventricular para maior digestão e separação física. (C) Após a digestão adequada, as células são separadas via filtração gravitacional em um total de quatro frações celulares que são cultivadas para experimentação subsequente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Análise morfológica de miócitos cardíacos atrial e ventricular isolados e não miócitos na cultura. (A) Miócitos atrial de camundongos adultos isolados (AMAMs),(B) camundongos não miócitos (AMANMs) adultos,ou(D)os não miócitos ventriculares adultos (AMVNMs) foram emplacados em 5 x 105 células/câmara em lâminas de vidro de quatro câmaras (1,7 cm2) em respectivas mídias banhadas. As imagens de fase foram obtidas em dias indicados na cultura utilizando um objetivo de 10x sob um microscópio de epifluorescência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Análise representativa do QRT-PCR de culturas celulares isoladas. O RNA foi extraído de miócitos cardíacos e não miócitos recém-isolados, e os níveis de mRNA para marcadores genéticos específicos de células foram determinados por qRT-PCR4. (A) Tnnt2, troponina muscular cardíaca T (marcador de miócito cardíaco); (B) Nppa, peptídeo natriurético atrial (marcador de miótido atrial); (C) Myl2, cadeia de luz de miosina 2 (marcador de miócito ventricular); (D) Tcf21, fator de transcrição 21 (marcador de fibroblasto); (E) Pdgfra, receptor de fator de crescimento derivado de plaquetas A (marcador de fibroblasto); (F) Cd68, cluster de diferenciação 68 (marcador celular derivado de monócito). Os dados representam ± SEM (*p ≤ 0,05 diferente de todos os outros valores, conforme determinado pela ANOVA seguido da análise pós-hoc de Newman Keul). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: Análise morfológica e funcional representativa de mioitos cardíacos atrial e ventricular isolados. (A) AMMs ou (B) AMVMs foram emplacados em 5 x 105 células/câmara em lâminas de vidro de quatro câmaras (1,7 cm2) em respectivas mídias de revestimento por 1h para permitir a adesão. Isso foi seguido por refeeding atrial myocyte plating media ou mudança para miócito ventricular mantendo a mídia complementada com blebbistatin por mais 16 horas. As culturas foram posteriormente fixadas e depois imunos detidas para RYR2 (roxo), DHPR (verde) e mancha nuclear TOPRO-3 (vermelho). (C) AMMs ou(D) AMVMs foram isolados e banhados, depois imunossuados para a-actinin (roxo), ANP (verde) e TOPRO-3 (vermelho). São mostradas duas imagens representativas para cada tipo de célula. (E) AMAMs foram banhados em 5 x 105 células/bem em um prato de cultura de 12 poços por 16 h em mídia de revestimento de miócito atrial. Os AMAMs foram posteriormente tratados por 0,5 h com veículo ou a anp secretagogue (fenilefrina, 50 mM) antes da coleta de mídia e submetida à análise de imunobloto para ANP. Antes da análise do imunoblot, as amostras de mídia foram centrifugadas a 500 x g por 5 min para remover detritos celulares e garantir que a ANP observada fosse resultado de secreção ativa de AMAMs. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

A qualidade das células isoladas utilizando o procedimento aqui descrito, conforme determinado pelo rendimento celular e pela saúde geral das células na cultura, depende de inúmeros fatores controláveis. A partir do próprio camundongo, foi documentado que o estresse imposto ao animal pode afetar negativamente o rendimento e a viabilidade celular na cultura, presumivelmente devido ao excesso de cortisol sistêmico, catecolaminas e ao estado hipercontratado do tecido cardíaco2,5,7. Por essas razões, devem ser tomadas medidas para evitar alarmar o animal antes do sacrifício. Tais medidas incluem cobrir a gaiola do animal e limitar o tempo fora do vivarium antes do sacrifício. Heparina e muitos barbitúricos comumente usados para eutanásia podem afetar vias de sinalização; assim, o método ideal de eutanásia deve ser personalizado em conformidade. A idade do animal tem um impacto considerável na qualidade e viabilidade das células isoladas, provavelmente devido ao acúmulo progressivo de fibrose intersticiais que ocorre simultaneamente com o processo de envelhecimento, o que pode afetar a digestão tecidual25. Em dados não apresentados aqui, enquanto o método descrito acima funciona em camundongos de até 78 semanas de idade, a qualidade das células foi menor nesses animais mais velhos.

O passo mais crítico no processo de isolamento descrito, bem como outros protocolos com um aparelho Langendorff para perfusão retrógrada, é a canulação e a perfusão inicial do coração. Para obter resultados ideais, o tempo de explantação cardíaca à canulação da aorta ascendente e iniciação da perfusão não deve levar mais de 90 s. Além do tempo, dois fatores importantes adicionais são a profundidade da cânula e a possibilidade de introduzir embolias de ar a partir do aparelho de perfusão. Assim, a cânula deve ser avançada na aorta ascendente para não entrar na raiz aórtica e obstruir a válvula aórtica, o que prejudicaria a perfusão dos vasos coronários.

Durante o processo de digestão, é importante testar regularmente a rigidez do coração para evitar exposição prolongada à colagem de enzimas digestivas, o que reduz a tolerância ao cálcio do mióco cardíaco. O protocolo descrito acima para a reintrodução do cálcio nas culturas isoladas de miócito ventricular foi projetado para limitar a morte do miócito cardíaco através do influxo inadequado de cálcio através de canais de cálcio operados pela loja. Deve-se notar que a reintrodução do cálcio stepwise não deve ser realizada para culturas isoladas de miócitos atrial, pois isso promoverá a morte celular durante a cultura de curto e longo prazo12. Para maiores precauções, os tampões de perfusão e digestão utilizados aqui incluem o inibidor de contração muscular cardíaca butanedione monoxime (BDM) para evitar a hipercontratação de miócitos isolados, bem como o paradoxo do cálcio, ambos impactando a viabilidade mióceca26. No entanto, a mudança de BDM para blebbistatin deve ser notada, pois é o agente anticonstêmico preferido na manutenção de mídia para miócitos cardíacos isolados. Em dados não mostrados, blebbistatin confere maior viabilidade para a cultura de longo prazo de miócitos cardíacos isolados.

Imediatamente após o isolamento, é importante considerar as ramificações da cultura de longo prazo das células cardíacas, especialmente os miócitos. O protocolo de isolamento e cultivo cardíaco não miócito descrito aqui é baseado em métodos comuns que se aproveitam das diferentes densidades e propriedades adesivas de diferentes células cardíacas. O benefício dos não miócitos é seu alto potencial de expansão na cultura; assim, ao contrário dos miócitos cardíacos, eles são passáveis à perpetragem para perpetuação. No entanto, sabe-se que as condições de cultivo, incluindo suplementação média com FBS, podem afetar a funcionalidade do miócito cardíaco27. Os meios culturais descritos aqui foram projetados para otimizar a viabilidade e limitar os desarranjos funcionais, especialmente para os miócitos atrial isolados. Embora nenhuma habilidade contratil prejudicada tenha sido observada em miócitos cardíacos isolados após a cultura na ausência de suplementação de blebbistatina, estudos que se concentram em eletrofisiologia, contratilidade e outras sinalizações moleculares unicelulares em si só devem ser realizados logo após o isolamento, quando a estrutura sarcomerica e a assinatura molecular ainda imitam a do coração intacto.

Uma característica marcante do miócito atrial é sua capacidade de luar como uma célula endócrina com imensa capacidade secreta, além de sua função contraída. Em condições fisiológicas, os miócitos atrial produzem grandes quantidades de ANP, que é armazenada no ânticulo endoplasmático e em grandes grânulos secretos denso-núcleo preparados para exocitose regulada ao receber um estímulo16,17. Enquanto muitos estudos isolados de miócitos atrial se concentram em suas propriedades eletrofisiológicas únicas, este é o primeiro estudo a projetar uma mídia cultural. Isso permite a viabilidade a longo prazo, bem como a promoção das funções mantidas de propriedades endócrinas e contratuais de miócitos atrial. Este novo método de cultivo, bem como o isolamento simultâneo de todos os tipos celulares de câmaras atrial e ventricular de um único coração de rato, será útil e eficaz para estudos sobre as propriedades fisiológicas e fisioterícias de miócitos atrial e ventricular.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

E.A.B. foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (1F31HL140850), pela ArcS Foundation, Inc., San Diego Chapter, e é uma Fundação de Pesquisa Rees-Stealy Phillips Gausewitz, M.D. Scholar do SDSU Heart Institute. E.A.B. e A.S.B. foram apoiados pela Fundação Inamori. CcG by (NIH) concede R01 HL135893, R01 HL141463 e HL149931.

Materials

(-)-Blebbistatin Sigma-Aldrich B0560
1 Liter Water Jacketed Reservoir Radnoti 120142-1
2,3-Butanedione monoxime Sigma-Aldrich B0753
5-0 Silk Suture Thread Fine Science Tools 18020-50
Adenosine Sigma-Aldrich A9251
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A6003
Bubble Trap Compliance Chamber Radnoti 130149
Calcium Chloride Anhydrous Fisher Scientific C614-500
Carnitine hydrochloride Sigma-Aldrich C9500
Collagenase type 2 Worthington Biochemical Corporation LS004176
Creatine Sigma-Aldrich C0780
Dexamethasone Sigma-Aldrich D2915
DMEM/F12 (1:1; 1X) Gibco 11330-032
Dumont #7 – Fine Forceps Fine Science Tools 11274-20
Epifluorescent micropscpe Olympus X70 IX70
Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated) Omega Scientific FB-12 Lot# 206018
Fine Scissors – Sharp Fine Science Tools 14060-09
Graefe Forceps Fine Science Tools 11051-10
Headband Magnifiers Fine Science Tools 28030-04
Hemacytometer (Bright-Line) Hausser Scientific 1475
HEPES (1M) Gibco 15630-080
Inosine Sigma-Aldrich I4125
Insulin-Transferrin-Selenium-X Gibco 51500-056
Isotemp 105 Water Bath Fisher Scientific NC0858659
Isotemp 3006 Fisher Scientific 13-874-182
Joklik Modified Minimum Essential Media Sigma-Aldrich M-0518
Laminin (Natural, Mouse) Gibco 1795024 Lot# 1735572
L-Glutamine Sigma-Aldrich G8540
Masterflex C/L Single-Channel Variable-Speed Compact Pump Cole-Palmer EW-77122-24
Minimum Essential Medium (MEM 1X) Gibco 12350-039
Molecular Biology Grade Water Corning 46-000-CM
Pen Strep Glutamine (100X) Gibco 10378-016
Spring Scissors – 6mm Cutting Edge Fine Science Tools 15020-15
Taurine Sigma-Aldrich T-8691
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References

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Blackwood, E. A., Bilal, A. S., Azizi, K., Sarakki, A., Glembotski, C. C. Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart. J. Vis. Exp. (160), e61224, doi:10.3791/61224 (2020).
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