היממה של דרוסופילה מלנוגסטר

1. פליי ייצור מזון לכל 1 L של מים, להכין מזון זבובים המורכב 4.69 גרם של מולסה מיובשת, 19.70 גרם של שמרים פעילים יבשים, 87.22 גרם של ארוחת תירס ו 7.83 גרם אגר. שלבו את התוכן המפורט לעיל ב- crockpot והפכו את החום ל- 250°F. מערבבים היטב את המרכיבים. יש לשמור את המכסה על התערה בזמן שהמזון המעופף מתחמם תוך כדי ערבוב התוכן כל 10 דקות עד שהוא מגיע לרתיחה מתגלגלת. מניחים לרתיחה המתגלגלת להימשך 20 דקות לפני כיבוי החום. מוסיפים 83.60 מ”ל מים ושמור על מכסה התרגרות כשהמזון מתקרר. מערבבים ומתוקלטים את טמפרטורת המזון כל 10 דקות עם מדחום זכוכית. הימנעו מלתת לשכבת פילם להתיישב על גבי האוכל. לאחר שהמזון התקרר ל-60°C, הוסף 10.44 מ”ל של Tegosept ו-5.51 מ”ל של חומצה פרופיונית לליטר מים (ראה שלב 1.1). מערבבים היטב והופכים את החום ל-60 מעלות צלזיוס כדי למנוע מהמזון להיות קריר מדי. לשאוב את מזון לטוס לפי הצורך באמצעות מילוי Droso. עבור בקבוקונים צרים, משאבה 10 מ”ל עבור 6 oz בקבוקים תחתית ריבוע משאבה 60 מ”ל. 2. איסוף זבובים בגיל מוגדר צג בקבוקים מסוג בר זבובים מאוחסנים ב 25 ° C במשך 5-7 ימים עד כמויות גדולות של גלם (כ 200 גופה) מחוברים לצד של הבקבוק. הבקבוקים המשמשים הם 6 oz בקבוקי מלאי Drosophila עם תחתית מרובעת. נקה מבוגרים קיימים מהבקבוק. או להטות את המבוגרים לבקבוק חדש או למקם אותם ב-70% אתנול. השתמש בקצה המשעמם של #0 צבע כדי לדחוף את כל המבוגרים הנותרים לתוך האוכל לטוס. הקפד לנגב את מברשת הצבע עם 70% אתנול לפני ואחרי שימושים. אפשרו לבקבוקים נקיים לשבת במשך 3 ימים באינקובטור של 25 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לדור הבא להתקלקל. זבובים אלה יהיו בני 0 עד 3 ימים. 3. הפרדת זבובים לאחר 3 ימים, להפריד זכרים מן הנקבות ולאסוף את המספר הרצוי עבור כל מין עבור כל אחת מארבע נקודות הזמן. זבובים יכולים להיות מבדילים על ידי מין על ידי בדיקת איברי מין; לזכרים יש איברי מין מעוגלים כהים ואילו לנקבות יש איברי מין בהירים ומחודדים יותר. הנקבות גם הרבה יותר גדולות מזבובים זכרים. השתמש כרית הרדמה CO2 כדי להפריד ביעילות את הזבובים ולהבדיל בין המינים. להזיז את הזבובים עם מברשות צבע כדי למנוע להרוג אותם. לאסוף 100 זכרים ו 100 נקבות עבור כל נקודת זמן, עם 50 זכרים לכל בקבוקון ו 100 נקבות לכל בקבוקון. זכרים נוטים להיות אגרסיביים יותר והאינטראקציות החברתיות שלהם להוביל הרבה מקרי מוות כאשר יש 100 אנשים במבעון. הנקבות, עד 100 אנשים, אינן מושפעות בזמן שהן נמצאות במבעון. בצע את האוספים בנקודות הזמן הבאות: ZT1, ZT7, ZT13 ו- ZT19 (טבלה 1). שים לב כי אוספים המנוונים בחושך (ZT12-ZT24) רגישים לאור ואילו אוספי ZT0-ZT11 נעשים בשעות תאורה ואורות החדר עשויים להיות דולקים. אנא שימו לב כי שתי אינקובטורים נפרדים משמשים עם דפוסי אור הפוכים של 12 שעות כדי לאפשר לכל האוספים להתרחש במהלך היום ולא בלילה. השתמשו בזבובים עודפים כדי ליצור בקבוקי זבובים חדשים לאמוניה עתידית. מניחים 25 נקבות עם 5-7 זכרים בכל בקבוק חדש וממקמים באינקובטור ב-25°C. 4. דגירה זבובים לאפשר לזבובים להישאר באינקובטורים מוסדרים אור במשך 3-5 ימים כדי לאפשר את ההמולה היממה להתרחש. ודא כי האינקובטורים הם אור הדוק כי אפילו כמויות קטנות של זיהום אור יפריעו לאמוניה. 5. קיבעון אימונו-השפלה לאחר אימון, להכין בקבוקונים חדשים של פתרון קיבעון עבור דגימות שישמשו עבור immunofluorescence. לפני הסרת הזבובים מהאינקובטור, להוסיף 4.8 מ”ל של 4% פורמלדהיד מדולל 1x PBS + 0.1% Tween-20 לכל בקבוקון צר חדש עבור כל 100 זבובים כי הם להיות מקובע. כל בקבוקון יכן 100 זבובים זכרים או 100 נקבות היממה. מניחים את הבקבוקונים הצרים בקרח. 6. אוסף אימונולוסיות בעת איסוף הזבובים מהאינקובטור לצורך אימונופלואורסצנטי, הסירו את פקק הבקבוק והפכו במהירות את הבקבוק למשפך. תקיש בעדינות את הזבובים לתוך התמיסה דרך המשפך כדי לעזור להנחות את הזבובים לתוך הבקבוקון; לשלב שני צינורות של 50 זכרים עבור סך של 100 זכרים במבחנה אחת ולהשתמש בצינור יחיד של 100 נקבות עבור הבקבוקון השני. בצע אוספי ZT13 ו- ZT19 בחושך; השתמשו באור אדום כדי לראות כמו drosophila הם הרבה פחות רגיש לאורכי גל אור אלה ולכן נוטים פחות זיהום אור13. חלבון קריפטוכרום, בפרט, רגיש במיוחד לאור כחול, אשר יש להימנע14. כדי להפחית את החשיפה לאור, ודא שחדר האיסוף יהיה בהיר עם מקורות אור חסונים או מכוסים. עטו בקבוקונים אלה בנייר כסף כך שזבובי ZT13 ו-ZT19 לא ייחשפו לאור כאשר הם מונחים על מערבל האגוזים בשלב הבא. זבובי ZT1 ו-ZT7 אינם רגישים לאור ותוכלים למצוא ם על המיקסר ללא כיסוי נייר כסף. 7. מערבל ואחסון Nutating לאחר איסוף הזבובים, הדביקו את החלק העליון של הבקבוקונים המכילים קיבעון כדי למנוע שפיכה והניחו אותם על מערבל האגוזים ב-165 סל”ד ב-4°C למשך 4 שעות. הזבובים כבר אינם רגישים לאור לאחר שלב קיבעון זה, כך שנייר הכסף עשוי להיות מוסר כדי לוודא שהפתרון זז וזבובים שקועים במתקן. לאחר הסרת הזבוב המכיל בקבוקונים מערבל אגוז להסיר את הפורמלדהיד ולשטוף שלוש פעמים עם 3,000 μL של 1x PBS, היפוך הבקבוקון עם כל שטיפה. אחסן את הבקבוקונים הנושאים דגימות אימונו-לורה ב-4°C כדי להמתיןל-15 מעלות. 8. איסוף להפקת חלבונים הכן ארבעה צינורות 50 מ”ל וDewar המכיל חנקן נוזלי לשימור דגימות להפקת חלבון לאיסוף זבובים להפקת חלבון או חומצה נוקלית, להעביר זבובים מהבקבוקים לצינור באותו אופן כמו בשלב 6.1 במהירות לכסות את הצינור כדי למנוע את שחרורו של זבובים ולמקם את הצינור לתוך חנקן נוזלי כדי להקפיא הצמד. 9. אחסון להפקת חלבונים לאחסן דגימות קפואות להפקת חלבונים ב-80°C. אלה יכולים להיות מעובדים על פי פרוטוקול הפקת חלבון המתאים לניתוח במורד הזרם, כולל immunoblotting16.